Informations

Pourquoi les protéines dénaturées ont-elles tendance à être moins solubles que la protéine native ?

Pourquoi les protéines dénaturées ont-elles tendance à être moins solubles que la protéine native ?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pourquoi les protéines dénaturées ont-elles tendance à être moins solubles que la protéine native ? En termes d'effets hydrophobes, quelqu'un pourrait-il m'expliquer ce phénomène ?


Informations d'arrière-plan

Une protéine native a ses acides aminés hydrophobes repliés vers l'intérieur, donc elle a un noyau hydrophobe. Pourquoi? Parce qu'il est thermodynamiquement favorisé. Lorsqu'une protéine est dénaturée, les acides aminés hydrophobes ne seront pas plus longtemps à l'intérieur du noyau de la protéine, mais seront plutôt exposés à l'environnement hydrophile (en supposant que vous parliez d'une protéine à l'intérieur d'un organisme). Mais ce n'est pas favorisé thermodynamiquement car les parties hydrophobes ne peuvent pas former de liaisons H avec l'eau et ne sont donc pas très solubles dans l'eau :

Ainsi, lorsque cela se produit, de nombreuses molécules de protéines s'agrègent comme des micelles de savon (car les interactions hydrophobes sont favorisées). Cela réduira la surface totale des acides aminés hydrophobes en contact avec l'eau, réduisant ainsi les perturbations de la liaison H dans les molécules d'eau.

Voici ma représentation personnelle de l'effet de la molécule organique sur la liaison H dans l'eau (c'est assez rugueux, alors ne vous souciez pas des détails fins).

Résumé les acides aminés hydrophobes seront exposés à l'environnement hydrophile --> les protéines s'agrégeront ensemble --> la plaque insoluble.


Dénaturation (biochimie)

Dénaturation est un processus dans lequel les protéines ou les acides nucléiques perdent la structure quaternaire, la structure tertiaire et la structure secondaire qui sont présentes dans leur état natif, par application d'un stress externe ou d'un composé tel qu'un acide ou une base forte, un sel inorganique concentré, un solvant organique (par exemple, alcool ou chloroforme), rayonnement ou chaleur. [3] Si les protéines d'une cellule vivante sont dénaturées, cela entraîne une perturbation de l'activité cellulaire et peut-être la mort cellulaire. La dénaturation des protéines est également une conséquence de la mort cellulaire. [4] [5] Les protéines dénaturées peuvent présenter un large éventail de caractéristiques, depuis le changement de conformation et la perte de solubilité jusqu'à l'agrégation due à l'exposition de groupes hydrophobes. Les protéines dénaturées perdent leur structure 3D et ne peuvent donc pas fonctionner.

Note 1: Modifié à partir de la définition donnée dans la réf. [1]

Note 2: La dénaturation peut se produire lorsque les protéines et les acides nucléiques sont soumis à des températures élevées ou à des pH extrêmes, ou à des concentrations non physiologiques de sel, de solvants organiques, d'urée ou d'autres agents chimiques.

Note 3: Un enzyme perd son activité catalytique lorsqu'il est dénaturé. [2]

Le repliement des protéines est essentiel pour savoir si une protéine globulaire ou membranaire peut faire son travail correctement, elle doit être repliée dans la bonne forme pour fonctionner. Cependant, les liaisons hydrogène, qui jouent un rôle important dans le repliement, sont plutôt faibles et donc facilement affectées par la chaleur, l'acidité, les concentrations variables de sel et d'autres facteurs de stress qui peuvent dénaturer la protéine. C'est l'une des raisons pour lesquelles l'homéostasie est physiologiquement nécessaire dans de nombreuses formes de vie.

Ce concept n'a rien à voir avec l'alcool dénaturé, c'est-à-dire de l'alcool qui a été mélangé à des additifs pour le rendre impropre à la consommation humaine.


La réponse des protéines dépliées et le stress cellulaire, partie B

Daisuke Oikawa , Yukio Kimata , dans Methods in Enzymology , 2011

4.3 In vitro test anti-agrégation

Comme substrats modèles de protéines dénaturées, la luciférase (Promega) et la citrate synthase (Roche) ont été utilisées. La citrate synthase a été dialysée contre un tampon de stock (20 mM HEPES (pH 7,0), 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, et 10 % (v/v) de glycérol), et conservé à - 80 °C. Pour dénaturer, la luciférase (25 μM concentration finale) et la citrate synthase (50 μM concentration finale) ont été incubés dans une solution dénaturante de guanidine HCl (guanidine-HCl (6 M pour la luciférase ou 4 M pour la citrate synthase), 20 mM HEPES (pH 7,2), 50 mM KCl, et 2 mM MgCl2) pendant 30 min à température ambiante. Les mélanges de protéines dénaturées ont ensuite été dilués (dilution 50 fois pour la luciférase ou dilution 33 fois pour la citrate synthase) avec un tampon de dosage (20 mM HEPES (pH 7,2), 50 mM KCl, et 2 mM MgCl2) en présence ou en l'absence des protéines recombinantes à tester. L'agrégation des protéines après dilution a été contrôlée par absorbance optique à 320 nm avec un spectrophotomètre (DU640 Beckman Coulter) à température ambiante.


Science de la dénaturation des protéines par la chaleur

Des changements majeurs dans les structures secondaires, tertiaires et quaternaires sans clivage des liaisons peptidiques du squelette sont considérés comme "dénaturation". De subtils changements de structure, qui ne modifient pas radicalement l'architecture moléculaire de la protéine, sont généralement considérés comme « adaptabilité conformationnelle ». La décomposition des liaisons peptidiques des protéines en peptides ou en acides aminés est "digestion"

La structure d'une protéine dépend de diverses interactions attractives et répulsives résultant de diverses forces intramoléculaires ainsi que de l'interaction de divers groupes protéiques avec l'eau du solvant environnant. L'état natif (d'une seule molécule de protéine) est thermodynamiquement le plus stable avec la plus faible énergie libre possible dans des conditions physiologiques. Tout changement dans son environnement, tel que le pH, la force ionique, la température, la composition du solvant, etc., forcera la molécule à adopter une nouvelle structure d'équilibre.

Comprendre la structure des protéines

Comment mesurer la dénaturation des protéines

La dénaturation implique la transformation d'une structure repliée bien définie d'une protéine, formée dans des conditions physiologiques, en un état déplié dans des conditions non physiologiques. Comme nous le savons, nous ne pouvons pas mesurer la structure directement, c'est-à-dire que la mesure directe des fractions de protéines natives et dénaturées dans une solution n'est pas possible. Mais, les changements de conformation des protéines affectent invariablement plusieurs de ses propriétés chimiques et physiques, telles que l'absorbance ultraviolette (UV), la fluorescence, la viscosité, le coefficient de sédimentation, la rotation optique, le dichroïsme circulaire, la réactivité des groupes sulfhydryle et l'activité enzymatique. Ainsi, la dénaturation des protéines peut être étudiée en surveillant les modifications de ces propriétés physiques et chimiques.

Chaleur comme dénaturant

La chaleur est l'agent le plus couramment utilisé dans la transformation et la conservation des aliments. Lorsqu'une solution de protéine est progressivement chauffée au-dessus d'une température critique, elle subit une transition brutale de l'état natif à l'état dénaturé. La température au point médian de transition, où le rapport de concentration des états natif et dénaturé est égal à 1, est appelée soit la température de fusion Tm, soit la température de dénaturation Td.

Le mécanisme de la dénaturation induite par la température est très complexe et implique principalement la déstabilisation des principales interactions non covalentes. Les interactions de liaison hydrogène, électrostatiques et de van der Waals sont de nature exothermique (enthalpie). Par conséquent, ils sont déstabilisés à haute température et stabilisés à basse température. Cependant, étant donné que les liaisons hydrogène peptidiques des protéines sont pour la plupart enfouies à l'intérieur, elles restent stables sur une large plage de températures. D'autre part, les interactions hydrophobes sont endothermiques (entropiques). Ils sont stabilisés à haute température et déstabilisés à basse température. Par conséquent, à mesure que la température augmente, les changements dans les stabilités de ces deux groupes d'interactions non covalentes s'opposent. Cependant, la stabilité des interactions hydrophobes ne peut pas augmenter à l'infini avec l'augmentation de la température, car au-dessus d'une certaine température, la dégradation progressive de la structure de l'eau finira par déstabiliser également les interactions hydrophobes. La force des interactions hydrophobes atteint un maximum à environ 60-70°C.

Une autre force majeure qui affecte la stabilité conformationnelle des protéines est l'entropie conformationnelle, –TSConf, de la chaîne polypeptidique. Lorsque la température augmente, l'augmentation de l'énergie cinétique thermique de la chaîne polypeptidique facilite grandement le dépliement de la chaîne polypeptidique.

Dénaturation des protéines et composition en acides aminés
La dénaturation des protéines par la chaleur dépend également de la composition en acides aminés des protéines. Les protéines qui contiennent une plus grande proportion de résidus d'acides aminés hydrophobes, en particulier Val, Ile, Leu et Phe, ont tendance à être plus stables que les protéines plus hydrophiles. Les protéines des organismes thermophiles contiennent généralement de grandes quantités de résidus d'acides aminés hydrophobes. Il est également dit que d'autres facteurs, tels que les liaisons disulfure et la présence de ponts salins enfouis dans les fissures hydrophobes, peuvent également contribuer à la thermostabilité.

Dénaturation des protéines et teneur en eau
L'eau facilite grandement la dénaturation thermique des protéines [37,95]. Les poudres de protéines sèches sont extrêmement stables à la dénaturation thermique. La valeur de Td diminue rapidement lorsque la teneur en eau passe de 0 à 0,35 g d'eau/g de protéines. L'effet de l'hydratation sur la thermostabilité est fondamentalement lié à la dynamique des protéines. A l'état sec, les protéines ont une structure statique, c'est-à-dire que la mobilité des segments polypeptidiques est restreinte. Lorsque la teneur en eau augmente, l'hydratation et la pénétration partielle de l'eau dans les cavités superficielles provoquent un gonflement de la protéine. Le gonflement de la protéine augmente la mobilité et la flexibilité de la chaîne, et la molécule de protéine prend une structure fondue plus dynamique. Lorsqu'elle est chauffée, cette structure flexible dynamique offre un meilleur accès de l'eau aux ponts salins et aux liaisons hydrogène peptidiques qu'il n'est possible à l'état sec, ce qui réduit Tré.

Dénaturation induite par le froid
On dit que plus la température est basse, plus grande sera la stabilité d'une protéine. Il existe des exceptions à cette règle. Les protéines dans lesquelles les interactions polaires dominent sur les interactions non polaires sont plus stables aux températures de réfrigération ou en dessous qu'elles ne le sont à des températures plus élevées. D'autre part, les protéines qui sont principalement stabilisées par des interactions hydrophobes sont plus stables à environ la température ambiante qu'elles ne le sont à la température de réfrigération.

  • La stabilité du lysozyme augmente avec l'abaissement de la température, tandis que celles de la myoglobine et d'un lysozyme mutant du phage T4 présentent une stabilité maximale à environ 30°C et 12,5°C, respectivement. Au-dessous et au-dessus de ces températures, la myoglobine et le lysozyme T4 sont moins stables. Stockées en dessous de 0°C, ces deux protéines subissent dénaturation induite par le froid.
  • Lorsque le lait écrémé est conservé à 4°C, la b-caséine se dissocie des micelles de caséine, ce qui altère les propriétés physico-chimiques et d'emprésurage des micelles.

La dénaturation des protéines est réversible.
Lorsque le dénaturant est retiré de la solution de protéines (ou que l'échantillon est refroidi), la plupart des protéines monomères (en l'absence d'agrégation) se replient dans leur conformation native dans des conditions de solution appropriées, telles que le pH, la force ionique, le potentiel redox et la concentration en protéines .

  • La glycinine, l'une des protéines de réserve du soja, s'agrège et précipite lorsqu'elle est conservée à 2°C, puis devient soluble lorsqu'elle est ramenée à température ambiante.
  • Plusieurs enzymes oligomères, telles que lactate déshydrogénase et glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase, perdent la plupart de leur activité enzymatique lorsqu'ils sont conservés à 4 °C, ce qui a été attribué à la dissociation des sous-unités. Cependant, lorsqu'ils sont réchauffés et maintenus à température ambiante pendant quelques heures, ils se réassocient et reprennent complètement leur activité
  • La dénaturation thermique des protéines globulaires monomères est en grande partie réversible. Par exemple, lorsque de nombreuses enzymes monomères sont chauffées au-dessus de leurs températures de dénaturation, ou même brièvement maintenues à 100°C, puis sont immédiatement refroidies à température ambiante, elles retrouvent pleinement leurs activités. Cependant, la dénaturation thermique peut devenir irréversible lorsque la protéine est chauffée à 90-100°C pendant une période prolongée même à pH neutre. Cette irréversibilité se produit en raison de plusieurs changements chimiques dans la protéine, tels que la désamidation des résidus Asn, le clivage des liaisons peptidiques au niveau des résidus Asp, la destruction des résidus Cys et cystine et l'agrégation.

Conférence suggérée sur la dénaturation des protéines

Référence : Chimie alimentaire l1996 l 3e éd l Par O R Fennema l Marcel Dekker


Pourquoi les protéines dénaturées ont-elles tendance à être moins solubles que la protéine native ? - La biologie

Les protéines sont des polymères d'acides aminés. Vingt types différents d'acides aminés sont présents naturellement dans les protéines. Les protéines diffèrent les unes des autres selon le type, le nombre et la séquence des acides aminés qui composent le squelette polypeptidique. En conséquence, ils ont des structures moléculaires, des attributs nutritionnels et des propriétés physicochimiques différents. Les protéines sont des constituants importants des aliments pour un certain nombre de raisons différentes. Ils sont une source importante d'énergie, en plus de contenir des acides aminés essentiels, tels que la lysine, le tryptophane, la méthionine, la leucine, l'isoleucine et la valine, qui sont essentiels à la santé humaine, mais que l'organisme ne peut synthétiser. Les protéines sont également les principaux composants structurels de nombreux aliments naturels, déterminant souvent leur texture globale, par exemple la tendreté des produits à base de viande ou de poisson. Les protéines isolées sont souvent utilisées dans les aliments en tant qu'ingrédients en raison de leurs propriétés fonctionnelles uniques, c'est-à-dire leur capacité à fournir une apparence, une texture ou une stabilité souhaitables. Typiquement, les protéines sont utilisées comme gélifiants, émulsifiants, agents moussants et épaississants. De nombreuses protéines alimentaires sont des enzymes capables d'augmenter la vitesse de certaines réactions biochimiques. Ces réactions peuvent avoir un effet favorable ou défavorable sur les propriétés globales des aliments. Les analystes alimentaires souhaitent connaître la concentration totale, le type, la structure moléculaire et les propriétés fonctionnelles des protéines dans les aliments.

6.2. Détermination de la concentration globale en protéines

La méthode Kjeldahl a été développée en 1883 par un brasseur appelé Johann Kjeldahl. Un aliment est digéré avec un acide fort afin qu'il libère de l'azote qui peut être dosé par une technique de titrage appropriée. La quantité de protéines présentes est ensuite calculée à partir de la concentration en azote de l'aliment. La même approche de base est encore utilisée aujourd'hui, bien qu'un certain nombre d'améliorations aient été apportées pour accélérer le processus et obtenir des mesures plus précises. Elle est généralement considérée comme la méthode standard de détermination de la concentration en protéines. Étant donné que la méthode Kjeldahl ne mesure pas directement la teneur en protéines, un facteur de conversion (F) est nécessaire pour convertir la concentration d'azote mesurée en une concentration en protéines. Un facteur de conversion de 6,25 (équivalent à 0,16 g d'azote par gramme de protéine) est utilisé pour de nombreuses applications, cependant, ce n'est qu'une valeur moyenne, et chaque protéine a un facteur de conversion différent en fonction de sa composition en acides aminés. La méthode Kjeldahl peut commodément être divisée en trois étapes : digestion, neutralisation et titrage.

L'échantillon d'aliment à analyser est pesé dans un ballon de digestion puis digéré en le chauffant en présence d'acide sulfurique (un agent oxydant qui digère l'aliment), de sulfate de sodium anhydre (pour accélérer la réaction en élevant le point d'ébullition) et un catalyseur, tel que le cuivre, le sélénium, le titane ou le mercure (pour accélérer la réaction). La digestion convertit tout azote dans les aliments (autre que celui qui est sous forme de nitrates ou de nitrites) en ammoniac et d'autres matières organiques en C0 2 et H 2 0. L'ammoniac n'est pas libéré dans une solution acide car l'ammoniac est dans la forme de l'ion ammonium (NH 4 + ) qui se lie à l'ion sulfate (SO 4 2- ) et reste ainsi en solution :

Une fois la digestion terminée, le ballon de digestion est relié à un ballon de réception par un tube. La solution dans le ballon de digestion est ensuite rendue alcaline par addition d'hydroxyde de sodium, qui transforme le sulfate d'ammonium en gaz ammoniac :

(NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH ® 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2)

Le gaz ammoniac qui se forme est libéré de la solution et sort du ballon de digestion et pénètre dans le ballon récepteur - qui contient un excès d'acide borique. Le faible pH de la solution dans le ballon récepteur convertit le gaz ammoniac en ion ammonium et convertit simultanément l'acide borique en ion borate :

NH 3 + H 3 BO 3 (acide borique) ® NH 4 + + H 2 BO 3 - (ion borate) (3)

La teneur en azote est ensuite estimée par titrage du borate d'ammonium formé avec de l'acide sulfurique ou chlorhydrique standard, en utilisant un indicateur approprié pour déterminer le point final de la réaction.

H 2 BO 3 - + H + ® H 3 BO 3 (4)

La concentration d'ions hydrogène (en moles) requise pour atteindre le point final est équivalente à la concentration d'azote qui se trouvait dans l'aliment d'origine (Équation 3). L'équation suivante peut être utilisée pour déterminer la concentration en azote d'un échantillon qui pèse m grammes en utilisant une solution acide x M HCl pour le titrage :

Où vs et vb sont les volumes de titrage de l'échantillon et du blanc, et 14g est le poids moléculaire de l'azote N. Un échantillon à blanc est généralement analysé en même temps que le matériau analysé pour prendre en compte tout azote résiduel qui peut être présent dans les réactifs utilisés pour effectuer l'analyse. Une fois que la teneur en azote a été déterminée, elle est convertie en une teneur en protéines en utilisant le facteur de conversion approprié : %Protéine = F %N.

6.2.1.4. Avantages et inconvénients

Avantages. La méthode Kjeldahl est largement utilisée au niveau international et reste la méthode standard de comparaison avec toutes les autres méthodes. Son universalité, sa haute précision et sa bonne reproductibilité en ont fait la méthode majeure pour l'estimation des protéines dans les aliments.

Inconvénients. Il ne donne pas une mesure de la vraie protéine, puisque tout l'azote dans les aliments n'est pas sous forme de protéine. Différentes protéines ont besoin de facteurs de correction différents car elles ont des séquences d'acides aminés différentes. L'utilisation d'acide sulfurique concentré à haute température présente un risque considérable, de même que l'utilisation de certains des catalyseurs possibles. La technique est longue à mettre en œuvre.

6.2.2. Méthode Dumas améliorée

Récemment, une technique instrumentale automatisée a été développée, capable de mesurer rapidement la concentration en protéines d'échantillons d'aliments. Cette technique est basée sur une méthode décrite pour la première fois par un scientifique appelé Dumas il y a plus d'un siècle et demi. Elle commence à concurrencer la méthode Kjeldahl comme méthode standard d'analyse des protéines pour certains aliments en raison de sa rapidité.

Un échantillon de masse connue est brûlé dans une chambre à haute température (environ 900 °C) en présence d'oxygène. Cela conduit à la libération de CO 2 , H 2 O et N 2 . Le CO 2 et H 2 O sont éliminés en faisant passer les gaz sur des colonnes spéciales qui les absorbent. La teneur en azote est ensuite mesurée en faisant passer les gaz restants à travers une colonne qui a un détecteur de conductivité thermique à l'extrémité. La colonne permet de séparer l'azote de tout CO 2 et H 2 O résiduels qui auraient pu rester dans le flux gazeux. L'instrument est calibré en analysant un matériau pur et ayant une concentration en azote connue, tel que l'EDTA (= 9,59% N). Ainsi, le signal du détecteur de conductivité thermique peut être converti en une teneur en azote.Comme avec la méthode de Kjeldahl, il est nécessaire de convertir la concentration d'azote dans un échantillon en teneur en protéines, en utilisant des facteurs de conversion appropriés qui dépendent de la séquence précise d'acides aminés de la protéine.

6.2.2.2. Avantages et inconvénients

Avantages : Elle est beaucoup plus rapide que la méthode Kjeldahl (moins de 4 minutes par mesure, contre 1-2 heures pour Kjeldahl). Il n'a pas besoin de produits chimiques toxiques ou de catalyseurs. De nombreux échantillons peuvent être mesurés automatiquement. C'est facile a utiliser.

Inconvénients : coût initial élevé. Il ne donne pas une mesure de la vraie protéine, puisque tout l'azote dans les aliments n'est pas sous forme de protéine. Différentes protéines ont besoin de facteurs de correction différents car elles ont des séquences d'acides aminés différentes. La petite taille de l'échantillon rend difficile l'obtention d'un échantillon représentatif.

6.2.3. Méthodes utilisant la spectroscopie UV-visible

Un certain nombre de méthodes ont été conçues pour mesurer la concentration en protéines, qui sont basées sur la spectroscopie UV-visible. Ces méthodes utilisent soit la capacité naturelle des protéines à absorber (ou disperser) la lumière dans la région UV-visible du spectre électromagnétique, soit elles modifient chimiquement ou physiquement les protéines pour qu'elles absorbent (ou dispersent) la lumière dans cette région. Le principe de base de chacun de ces tests est similaire. Tout d'abord, une courbe d'étalonnage de l'absorbance (ou de la turbidité) en fonction de la concentration en protéines est préparée en utilisant une série de solutions de protéines de concentration connue. L'absorbance (ou la turbidité) de la solution analysée est ensuite mesurée à la même longueur d'onde, et sa concentration en protéines déterminée à partir de la courbe d'étalonnage. La principale différence entre les tests réside dans les groupes chimiques responsables de l'absorption ou de la diffusion du rayonnement, par exemple les liaisons peptidiques, les groupes latéraux aromatiques, les groupes basiques et les protéines agrégées.

Certaines des méthodes UV-visible les plus couramment utilisées pour déterminer la teneur en protéines des aliments sont présentées ci-dessous :

Mesure directe à 280 nm

Le tryptophane et la tyrosine absorbent fortement la lumière ultraviolette à 280 nm. La teneur en tryptophane et en tyrosine de nombreuses protéines reste assez constante, et donc l'absorbance des solutions de protéines à 280 nm peut être utilisée pour déterminer leur concentration. Les avantages de cette méthode sont que la procédure est simple à réaliser, elle est non destructive et aucun réactif spécial n'est requis. L'inconvénient majeur est que les acides nucléiques absorbent également fortement à 280 nm et pourraient donc interférer avec la mesure de la protéine s'ils sont présents à des concentrations suffisantes. Même ainsi, des procédés ont été développés pour surmonter ce problème, par exemple, en mesurant l'absorbance à deux longueurs d'onde différentes.

Une couleur violacée est produite lorsque les ions cuivriques (Cu 2+ ) interagissent avec les liaisons peptidiques dans des conditions alcalines. Le réactif biuret, qui contient tous les produits chimiques nécessaires pour effectuer l'analyse, peut être acheté dans le commerce. Il est mélangé avec une solution de protéines puis laissé au repos pendant 15 à 30 minutes avant que l'absorbance ne soit lue à 540 nm. Le principal avantage de cette technique est qu'il n'y a pas d'interférence des matériaux qui adsorbent à des longueurs d'onde inférieures, et la technique est moins sensible au type de protéine car elle utilise l'absorption impliquant des liaisons peptidiques communes à toutes les protéines, plutôt que des groupes latéraux spécifiques. Cependant, sa sensibilité est relativement faible par rapport aux autres méthodes UV-visible.

La méthode de Lowry combine le réactif biuret avec un autre réactif (le réactif phénol de Folin-Ciocalteau) qui réagit avec les résidus tyrosine et tryptophane dans les protéines. Cela donne une couleur bleuâtre qui peut être lue entre 500 et 750 nm selon la sensibilité requise. Il existe un petit pic autour de 500 nm qui peut être utilisé pour déterminer des concentrations élevées en protéines et un grand pic autour de 750 nm qui peut être utilisé pour déterminer de faibles concentrations en protéines. Cette méthode est plus sensible aux faibles concentrations de protéines que la méthode au biuret.

Un excès connu d'un colorant chargé négativement (anionique) est ajouté à une solution de protéines dont le pH est ajusté de sorte que les protéines soient chargées positivement (c'est-à-dire < le point isoélectrique). Les protéines forment un complexe insoluble avec le colorant en raison de l'attraction électrostatique entre les molécules, mais le colorant non lié reste soluble. Le colorant anionique se lie aux groupes cationiques des résidus d'acides aminés basiques (histidine, arganine et lysine) et aux groupes amino terminaux libres. La quantité de colorant non lié restant en solution après que le complexe protéine-colorant insoluble a été éliminé (par exemple, par centrifugation) est déterminée en mesurant son absorbance. La quantité de protéine présente dans la solution d'origine est proportionnelle à la quantité de colorant qui s'y lie : colorant lié = colorant initial - sans colorant.

Les molécules de protéines qui sont normalement solubles en solution peuvent être amenées à précipiter par l'ajout de certains produits chimiques, par exemple l'acide trichloracétique. La précipitation des protéines rend la solution trouble. Ainsi, la concentration de protéine peut être déterminée en mesurant le degré de turbidité.

6.2.3.2. Avantages et inconvénients

Avantages : les techniques UV-visible sont assez rapides et simples à mettre en œuvre, et sont sensibles aux faibles concentrations de protéines.

Inconvénients : Pour la plupart des techniques UV-visible, il est nécessaire d'utiliser des solutions diluées et transparentes, qui ne contiennent aucune substance contaminante qui absorbe ou diffuse la lumière à la même longueur d'onde que la protéine analysée. Le besoin de solutions transparentes signifie que la plupart des aliments doivent subir des quantités importantes de préparation d'échantillons avant de pouvoir être analysés, par exemple, l'homogénéisation, l'extraction par solvant, la centrifugation, la filtration, ce qui peut prendre du temps et être laborieux. De plus, il est parfois difficile d'extraire quantitativement les protéines de certains types d'aliments, surtout après qu'ils aient été transformés de sorte que les protéines s'agrègent ou se lient de manière covalente avec d'autres substances. De plus, l'absorbance dépend du type de protéine analysée (différentes protéines ont des séquences d'acides aminés différentes).

6.2.4. Autres techniques instrumentales

Il existe une grande variété de méthodes instrumentales différentes pour déterminer la teneur totale en protéines des aliments. Celles-ci peuvent être divisées en trois catégories différentes selon leurs principes physico-chimiques : (i) mesure des propriétés physiques globales, (ii) mesure de l'adsorption du rayonnement, et (iii) mesure de la diffusion du rayonnement. Chaque méthode instrumentale a ses propres avantages et inconvénients, et une gamme d'aliments auxquels elle peut être appliquée.

Mesure des propriétés physiques en vrac

  • Densité : La densité d'une protéine est supérieure à celle de la plupart des autres composants alimentaires, et il y a donc une augmentation de la densité d'un aliment à mesure que sa teneur en protéines augmente. Ainsi, la teneur en protéines des aliments peut être déterminée en mesurant leur densité.
  • Indice de réfraction : L'indice de réfraction d'une solution aqueuse augmente à mesure que la concentration en protéines augmente et, par conséquent, les mesures RI peuvent être utilisées pour déterminer la teneur en protéines.

Mesure de l'adsorption du rayonnement

  • UV-visible : La concentration de protéines peut être déterminée en mesurant l'absorbance du rayonnement ultraviolet-visible (voir ci-dessus).
  • Infrarouge : Les techniques infrarouges peuvent être utilisées pour déterminer la concentration de protéines dans des échantillons d'aliments. Les protéines absorbent naturellement les IR en raison des vibrations caractéristiques (étirement et flexion) de certains groupes chimiques le long du squelette polypeptidique. Les mesures de l'absorbance du rayonnement à certaines longueurs d'onde peuvent ainsi être utilisées pour quantifier la concentration en protéine dans l'échantillon. L'IR est particulièrement utile pour l'analyse rapide en ligne de la teneur en protéines. Il nécessite également peu de préparation d'échantillon et est non destructif. Ses inconvénients majeurs sont son coût initial élevé et la nécessité d'un étalonnage poussé.
  • Résonance magnétique nucléaire : La spectroscopie RMN peut être utilisée pour déterminer la concentration totale en protéines des aliments. La teneur en protéines est déterminée en mesurant l'aire sous un pic dans un spectre de déplacement chimique RMN qui correspond à la fraction protéique.

Mesure de la diffusion du rayonnement

  • Diffusion de la lumière : La concentration d'agrégats de protéines dans une solution aqueuse peut être déterminée à l'aide de techniques de diffusion de la lumière car la turbidité d'une solution est directement proportionnelle à la concentration d'agrégats présents.
  • Diffusion par ultrasons : la concentration d'agrégats de protéines peut également être déterminée à l'aide de techniques de diffusion par ultrasons, car la vitesse et l'absorption des ultrasons sont liées à la concentration d'agrégats de protéines présents.

6.2.4.2. Avantages et inconvénients

Un certain nombre de ces méthodes instrumentales présentent des avantages majeurs par rapport aux autres techniques mentionnées ci-dessus car elles sont non destructives, nécessitent peu ou pas de préparation d'échantillons et les mesures sont rapides et précises. Un inconvénient majeur des techniques qui reposent sur des mesures des propriétés physiques globales des aliments est qu'une courbe d'étalonnage doit être préparée entre la propriété physique d'intérêt et la teneur totale en protéines, et cela peut dépendre du type de protéine présente et de l'aliment. matrice dans laquelle il est contenu. De plus, les techniques basées sur des mesures de propriétés physico-chimiques en vrac ne peuvent être utilisées que pour analyser des aliments de compositions relativement simples. Dans un aliment qui contient de nombreux composants différents dont la concentration peut varier, il est difficile de démêler la contribution de la protéine à la mesure globale de celle des autres composants.

6.2.5. Comparaison des méthodes

En tant que scientifiques de l'alimentation, nous pouvons souvent être dans une position où nous devons choisir une technique particulière pour mesurer la concentration en protéines d'un aliment. Comment décidons-nous quelle technique est la plus appropriée pour notre application particulière ? La première chose à déterminer est à quoi serviront les informations. Si l'analyse doit être effectuée à des fins officielles, par exemple, pour des exigences légales ou d'étiquetage, il est alors important d'utiliser une méthode officiellement reconnue. La méthode Kjeldahl, et de plus en plus la méthode Dumas, ont été officiellement approuvées pour un large éventail d'applications alimentaires. En revanche, seul un petit nombre d'applications de la spectroscopie UV-visible ont été officiellement reconnues.

À des fins de contrôle qualité, il est souvent plus utile d'avoir des mesures rapides et simples de la teneur en protéines et, par conséquent, les techniques IR sont les plus appropriées. Pour les études fondamentales en laboratoire, où les protéines pures sont souvent analysées, les techniques de spectroscopie UV-visible sont souvent préférées car elles donnent des mesures rapides et fiables, et sont sensibles aux faibles concentrations de protéines.

D'autres facteurs à prendre en compte sont la quantité de préparation d'échantillon requise, leur sensibilité et leur vitesse. Les méthodes Kjeldahl, Dumas et IR nécessitent très peu de préparation d'échantillons. Une fois qu'un échantillon représentatif de l'aliment a été sélectionné, il peut généralement être testé directement. D'autre part, les différentes méthodes UV-visible nécessitent une préparation approfondie des échantillons avant l'analyse. La protéine doit être extraite de l'aliment dans une solution transparente diluée, ce qui implique généralement des procédures fastidieuses d'homogénéisation, d'extraction par solvant, de filtration et de centrifugation. De plus, il peut être difficile d'isoler complètement certaines protéines des aliments car elles sont fortement liées à d'autres composants. Les différentes techniques ont également des sensibilités différentes, c'est-à-dire la plus faible concentration de protéines qu'elles peuvent détecter. Les méthodes UV-visible sont les plus sensibles, étant capables de détecter des concentrations de protéines aussi faibles que 0,001% en poids. La sensibilité des méthodes Dumas, Kjeldahl et IR est d'environ 0,1% en poids. Le temps requis par analyse et le nombre d'échantillons pouvant être analysés simultanément sont également des facteurs importants à prendre en compte lors du choix de la technique analytique à utiliser. Les techniques IR sont capables d'analyser rapidement (< 1 minute) la concentration en protéines une fois qu'elles ont été calibrées. La méthode instrumentale moderne de Dumas est entièrement automatisée et permet de mesurer la concentration en protéines d'un échantillon en moins de 5 minutes, par rapport à la méthode Kjeldahl qui prend entre 30 minutes et 2 heures à réaliser. Les différentes méthodes UV-visible vont de quelques minutes à une heure (selon le type de colorant utilisé et le temps qu'il faut pour réagir), bien qu'elles présentent l'avantage de pouvoir analyser de nombreux échantillons simultanément. Néanmoins, il est généralement nécessaire d'effectuer une préparation approfondie de l'échantillon avant l'analyse afin d'obtenir une solution transparente. D'autres facteurs peuvent être importants lors du choix d'une technique appropriée : l'équipement disponible, la facilité d'utilisation, la précision souhaitée et le fait que la technique soit ou non non destructive.

6.3. Séparation et caractérisation des protéines

Dans la conférence précédente, les techniques utilisées pour déterminer la concentration totale de protéines dans un aliment ont été discutées. Les analystes alimentaires s'intéressent également souvent au type de protéines présentes dans un aliment, car chaque protéine possède des propriétés nutritionnelles et physico-chimiques uniques. Le type de protéine est généralement déterminé en séparant et en isolant les protéines individuelles d'un mélange complexe de protéines, afin qu'elles puissent être ultérieurement identifiées et caractérisées. Les protéines sont séparées sur la base de différences dans leurs propriétés physico-chimiques, telles que la taille, la charge, les caractéristiques d'adsorption, la solubilité et la stabilité thermique. Le choix d'une technique de séparation appropriée dépend d'un certain nombre de facteurs, notamment les raisons de la réalisation de l'analyse, la quantité d'échantillon disponible, la pureté souhaitée, l'équipement disponible, le type de protéines présentes et le coût. Des méthodes à grande échelle sont disponibles pour les isolements bruts de grandes quantités de protéines, tandis que des méthodes à petite échelle sont disponibles pour des protéines coûteuses ou disponibles uniquement en petites quantités. L'un des facteurs qui doit être pris en compte lors de la procédure de séparation est la possibilité que la structure tridimensionnelle native des molécules de protéine puisse être altérée.

Une connaissance préalable des effets des conditions environnementales sur la structure et les interactions des protéines est extrêmement utile lors du choix de la technique de séparation la plus appropriée. Premièrement, parce qu'il aide à déterminer les conditions les plus appropriées à utiliser pour isoler une protéine particulière à partir d'un mélange de protéines (par exemple, pH, force ionique, solvant, température, etc.), et deuxièmement, parce qu'il peut être important de choisir des conditions qui n'affecte pas négativement la structure moléculaire des protéines.

6.3.1. Méthodes basées sur différentes caractéristiques de solubilité

Les protéines peuvent être séparées en exploitant les différences de leur solubilité dans les solutions aqueuses. La solubilité d'une molécule de protéine est déterminée par sa séquence d'acides aminés car elle détermine sa taille, sa forme, son hydrophobie et sa charge électrique. Les protéines peuvent être sélectivement précipitées ou solubilisées en modifiant le pH, la force ionique, la constante diélectrique ou la température d'une solution. Ces techniques de séparation sont les plus simples à utiliser lorsqu'il s'agit de grandes quantités d'échantillons, car elles sont relativement rapides, peu coûteuses et ne sont pas particulièrement influencées par d'autres composants alimentaires. Ils sont souvent utilisés comme première étape de toute procédure de séparation car la majorité des matériaux contaminants peuvent être facilement éliminés.

Les protéines sont précipitées à partir de solutions aqueuses lorsque la concentration en sel dépasse un niveau critique, appelé relargage, car toute l'eau est « liée » aux sels et n'est donc pas disponible pour hydrater les protéines. Le sulfate d'ammonium [(NH 4 ) 2 SO 4 ] est couramment utilisé car il a une haute solubilité dans l'eau, bien que d'autres sels neutres puissent également être utilisés, par exemple NaCl ou KCl. Généralement, une procédure en deux étapes est utilisée pour maximiser l'efficacité de séparation. Dans la première étape, le sel est ajouté à une concentration juste en dessous de celle nécessaire pour précipiter la protéine d'intérêt. La solution est ensuite centrifugée pour éliminer toutes les protéines moins solubles que la protéine d'intérêt. La concentration en sel est ensuite augmentée jusqu'à un point juste au-dessus de celui requis pour provoquer la précipitation de la protéine. Cela précipite la protéine d'intérêt (qui peut être séparée par centrifugation), mais laisse des protéines plus solubles en solution. Le principal problème avec cette méthode est que de grandes concentrations de sel contaminent la solution, qui doit être éliminée avant que la protéine puisse être resolubilisée, par exemple, par dialyse ou ultrafiltration.

Le point isoélectrique (pI) d'une protéine est le pH auquel la charge nette de la protéine est nulle. Les protéines ont tendance à s'agréger et à précipiter à leur pi car il n'y a pas de répulsion électrostatique les séparant. Les protéines ont des points isoélectriques différents en raison de leurs différentes séquences d'acides aminés (c'est-à-dire le nombre relatif de groupes anioniques et cationiques), et elles peuvent donc être séparées en ajustant le pH d'une solution. Lorsque le pH est ajusté au pi d'une protéine particulière, il précipite en laissant les autres protéines en solution.

La solubilité d'une protéine dépend de la constante diélectrique de la solution qui l'entoure car cela modifie l'amplitude des interactions électrostatiques entre les groupes chargés. Au fur et à mesure que la constante diélectrique d'une solution diminue, l'amplitude des interactions électrostatiques entre les espèces chargées augmente. Cela tend à diminuer la solubilité des protéines en solution car elles sont moins ionisées, et donc la répulsion électrostatique entre elles n'est pas suffisante pour les empêcher de s'agréger. La constante diélectrique des solutions aqueuses peut être abaissée en ajoutant des solvants organiques hydrosolubles, tels que l'éthanol ou l'acétone. La quantité de solvant organique nécessaire pour provoquer la précipitation dépend de la protéine et, par conséquent, les protéines peuvent être séparées sur cette base. La quantité optimale de solvant organique nécessaire pour précipiter une protéine varie d'environ 5 à 60 %. Le fractionnement par solvant est généralement effectué à 0 °C ou moins pour éviter la dénaturation des protéines causée par les augmentations de température qui se produisent lorsque les solvants organiques sont mélangés à de l'eau.

Dénaturation des protéines contaminantes

De nombreuses protéines sont dénaturées et précipitent de la solution lorsqu'elles sont chauffées au-dessus d'une certaine température ou en ajustant une solution à des pH très acides ou basiques. Les protéines qui sont stables à haute température ou à des pH extrêmes sont plus facilement séparées par cette technique car les protéines contaminantes peuvent être précipitées alors que la protéine d'intérêt reste en solution.

6.3.2. Séparation due à différentes caractéristiques d'adsorption

La chromatographie d'adsorption implique la séparation des composés par adsorption-désorption sélective sur une matrice solide contenue dans une colonne traversée par le mélange. La séparation est basée sur les différentes affinités des différentes protéines pour la matrice solide. La chromatographie d'affinité et la chromatographie par échange d'ions sont les deux principaux types de chromatographie d'adsorption couramment utilisés pour la séparation des protéines. La séparation peut être effectuée en utilisant soit une colonne ouverte, soit une chromatographie liquide à haute pression.

Chromatographie d'échange d'ions

La chromatographie par échange d'ions repose sur l'adsorption-désorption réversible d'ions en solution sur une matrice solide chargée ou un réseau polymère. Cette technique est la technique chromatographique la plus couramment utilisée pour la séparation des protéines. Une matrice chargée positivement est appelée un échangeur d'anions car elle lie les ions chargés négativement (anions). Une matrice chargée négativement est appelée un échangeur d'ions car elle lie les ions chargés positivement (cations). Les conditions du tampon (pH et force ionique) sont ajustées pour favoriser une liaison maximale de la protéine d'intérêt à la colonne échangeuse d'ions. Les protéines contaminantes se lient moins fortement et passent donc plus rapidement à travers la colonne. La protéine d'intérêt est ensuite éluée en utilisant une autre solution tampon qui favorise sa désorption de la colonne (par exemple, un pH ou une force ionique différents).

La chromatographie d'affinité utilise une phase stationnaire constituée d'un ligand lié de manière covalente à un support solide. Le ligand est une molécule qui a une affinité réversible hautement spécifique et unique pour une protéine particulière. L'échantillon à analyser est passé à travers la colonne et la protéine d'intérêt se lie au ligand, tandis que les protéines contaminantes passent directement à travers. La protéine d'intérêt est ensuite éluée à l'aide d'une solution tampon qui favorise sa désorption de la colonne. Cette technique est le moyen le plus efficace de séparer une protéine individuelle d'un mélange de protéines, mais c'est le plus coûteux, en raison de la nécessité d'avoir des colonnes auxquelles sont liés des ligands spécifiques.

La chromatographie par échange d'ions et la chromatographie d'affinité sont couramment utilisées pour séparer les protéines et les acides aminés en laboratoire. Ils sont moins couramment utilisés pour les séparations commerciales car ils ne conviennent pas pour séparer rapidement de gros volumes et sont relativement coûteux.

6.3.3. Séparation due aux différences de taille

Les protéines peuvent également être séparées en fonction de leur taille. Typiquement, les poids moléculaires des protéines varient d'environ 10 000 à 1 000 000 daltons. En pratique, la séparation dépend du rayon de Stokes d'une protéine, plutôt que directement de son poids moléculaire. Le rayon de Stokes est le rayon moyen d'une protéine en solution et dépend de sa structure moléculaire tridimensionnelle. Pour les protéines de même poids moléculaire, le rayon de Stokes augmente dans l'ordre suivant : protéine globulaire compacte < protéine à bobine aléatoire flexible < protéine en forme de bâtonnet.

La dialyse est utilisée pour séparer les molécules en solution à l'aide de membranes semi-perméables qui permettent le passage de molécules plus petites qu'une certaine taille, mais empêchent le passage de molécules plus grosses. Une solution de protéines est placée dans un tube de dialyse qui est scellé et placé dans un grand volume d'eau ou de tampon qui est lentement agité. Les solutés de faible poids moléculaire s'écoulent à travers le sac, mais les molécules de protéines de poids moléculaire élevé restent dans le sac. La dialyse est une méthode relativement lente, qui prend jusqu'à 12 heures. Il est donc le plus fréquemment utilisé en laboratoire. La dialyse est souvent utilisée pour éliminer le sel des solutions de protéines après leur séparation par relargage et pour changer les tampons.

Une solution de protéine est placée dans une cellule contenant une membrane semi-perméable, et une pression est appliquée. Les molécules plus petites traversent la membrane, tandis que les molécules plus grosses restent dans la solution. Le principe de séparation de cette technique est donc similaire à celui de la dialyse, mais comme la pression est appliquée, la séparation est beaucoup plus rapide. Des membranes semi-perméables avec des points de coupure compris entre environ 500 et 300 000 sont disponibles. La partie de la solution retenue par la cellule (grosses molécules) est appelée rétentat, tandis que la partie qui traverse la membrane (petites molécules) fait partie de l'ultrafiltrat. L'ultrafiltration peut être utilisée pour concentrer une solution de protéines, éliminer les sels, échanger des tampons ou fractionner des protéines sur la base de leur taille. Les unités d'ultrafiltration sont utilisées en laboratoire et à l'échelle commerciale.

Chromatographie d'exclusion de taille

Cette technique, parfois appelée filtration sur gel, sépare également les protéines en fonction de leur taille. Une solution de protéine est versée dans une colonne remplie de billes poreuses constituées d'un matériau polymère réticulé (tel que le dextrane ou l'agarose). Les molécules plus grosses que les pores dans les billes sont exclues et se déplacent rapidement dans la colonne, tandis que le mouvement des molécules qui pénètrent dans les pores est retardé. Ainsi, les molécules sont éluées de la colonne par ordre de taille décroissante. Des billes de différentes tailles de pores moyennes sont disponibles pour séparer des protéines de différents poids moléculaires. Les fabricants de ces billes fournissent des informations sur la plage de poids moléculaires qu'elles conviennent le mieux pour séparer. Les poids moléculaires des protéines inconnues peuvent être déterminés en comparant leurs volumes d'élution Vo, avec ceux déterminés en utilisant des protéines de poids moléculaire connu : un tracé du volume d'élution en fonction du log( poids moléculaire) devrait donner une ligne droite. Un problème avec cette méthode est que le poids moléculaire n'est pas directement lié au rayon de Stokes pour différentes protéines de forme.

6.3.4. Séparation par électrophorèse

L'électrophorèse repose sur les différences de migration des molécules chargées dans une solution lorsqu'un champ électrique est appliqué à travers celle-ci. Il peut être utilisé pour séparer les protéines sur la base de leur taille, leur forme ou leur charge.

En électrophorèse non dénaturante, une solution tamponnée de protéines natives est versée sur un gel poreux (généralement du polyacrylamide, de l'amidon ou de l'agarose) et une tension est appliquée à travers le gel. Les protéines se déplacent à travers le gel dans une direction qui dépend du signe de leur charge, et à une vitesse qui dépend de l'amplitude de la charge, et de la friction à leur mouvement :

Les protéines peuvent être chargées positivement ou négativement en solution en fonction de leurs points isoélectriques (pI) et du pH de la solution. Une protéine est chargée négativement si le pH est supérieur au pI et positivement si le pH est inférieur au pI. L'amplitude de la charge et la tension appliquée détermineront jusqu'où les protéines migrent dans un certain temps. Plus la tension est élevée ou plus la charge sur la protéine est élevée, plus elle se déplacera. Le frottement d'une molécule est une mesure de sa résistance au mouvement à travers le gel et est largement déterminé par la relation entre la taille effective de la molécule et la taille des pores dans le gel. Plus la taille de la molécule est petite ou plus la taille des pores du gel est grande, plus la résistance est faible et donc plus la molécule se déplace rapidement à travers le gel. Des gels de porosités différentes peuvent être achetés auprès de fournisseurs de produits chimiques ou préparés en laboratoire. Des tailles de pores plus petites sont obtenues en utilisant une concentration plus élevée de réactif de réticulation pour former le gel. Les gels peuvent être contenus entre deux plaques parallèles, ou dans des tubes cylindriques. Dans l'électrophorèse non dénaturante, les protéines natives sont séparées sur la base d'une combinaison de leur charge, taille et forme.

Dans l'électrophorèse dénaturante, les protéines sont séparées principalement en fonction de leur poids moléculaire. Les protéines sont dénaturées avant l'analyse en les mélangeant avec du mercaptoéthanol, qui brise les liaisons disulfure, et du dodécylsulfate de sodium (SDS), qui est un tensioactif anionique qui se lie de manière hydrophobe aux molécules de protéines et les fait se déployer en raison de la répulsion entre les tensioactifs chargés négativement. groupes de tête. Chaque molécule de protéine se lie approximativement à la même quantité de SDS par unité de longueur. Par conséquent, la charge par unité de longueur et la conformation moléculaire sont approximativement similaires pour toutes les protéines. Lorsque les protéines traversent un réseau de gel, elles sont principalement séparées sur la base de leur poids moléculaire car leur mouvement dépend de la taille de la molécule de protéine par rapport à la taille des pores du gel : les petites protéines se déplacent plus rapidement à travers la matrice que les plus grosses. molécules. Ce type d'électrophorèse est communément appelé électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium-polyacrylamide, ou SDS-PAGE.

Pour déterminer jusqu'où les protéines se sont déplacées, un colorant de suivi est ajouté à la solution de protéines, par exemple du bleu de bromophénol. Ce colorant est une petite molécule chargée qui migre avant les protéines. Une fois l'électrophorèse terminée, les protéines sont rendues visibles en traitant le gel avec un colorant protéique tel que le bleu brillant de Coomassie ou le colorant à l'argent. La mobilité relative de chaque bande de protéine est calculée :

L'électrophorèse est souvent utilisée pour déterminer la composition en protéines des produits alimentaires. La protéine est extraite de la nourriture en solution, qui est ensuite séparée par électrophorèse. SDS-PAGE est utilisé pour déterminer le poids moléculaire d'une protéine en mesurant R m, puis en le comparant à une courbe d'étalonnage produite à l'aide de protéines de poids moléculaire connu : un tracé de log (poids moléculaire) par rapport à la mobilité relative est généralement linéaire. L'électrophorèse dénaturante est plus utile pour déterminer les poids moléculaires que l'électrophorèse non dénaturante, car le frottement au mouvement ne dépend pas de la forme ou de la charge d'origine des molécules de protéine.

Électrophorèse de focalisation isoélectrique

Cette technique est une modification de l'électrophorèse, dans laquelle les protéines sont séparées par charge sur une matrice de gel qui a un gradient de pH à travers elle. Les protéines migrent vers l'endroit où le pH est égal à leur point isoélectrique, puis cessent de bouger car elles ne sont plus chargées. Cette méthode a l'une des résolutions les plus élevées de toutes les techniques utilisées pour séparer les protéines. Des gels sont disponibles qui couvrent une plage de pH étroite (2-3 unités) ou une large plage de pH (3-10 unités) et il convient donc de sélectionner un gel qui convient le mieux aux protéines à séparer.

Électrophorèse bidimensionnelle

La focalisation isoélectrique et la SDS-PAGE peuvent être utilisées ensemble pour améliorer la résolution de mélanges de protéines complexes. Les protéines sont séparées dans une direction sur la base de la charge en utilisant la focalisation isoélectrique, puis dans une direction perpendiculaire sur la base de la taille en utilisant SDS-PAGE.


F4. Interactions hydrophobes : Introduction

  • Contribution de Henry Jakubowski
  • Professeur (Chimie) au Collège de St. Benedict/St. John's University

Nous avons étudié le rôle de l'effet hydrophobe (impliquant la libération entropique favorable de molécules d'eau en cage autour des groupes hydrophobes exposés au solvant) dans la formation de micelles et de bicouches. Cela entraîne-t-il également le repliement des protéines ? Pour explorer ces questions, nous étudierons la thermodynamique de petites molécules non polaires, en particulier le benzène, avec l'eau et nous demanderons si les paramètres thermodynamiques associés à la solubilité du benzène sont similaires à ceux associés à la stabilité des protéines. Si cette analogie est valable, tout ce qui favorisera la solubilité du benzène entraînera une exposition accrue des chaînes latérales d'acides aminés hydrophobes à l'eau et donc une dénaturation des protéines. Quelles sont les preuves à l'appui?

une. structures cristallines : ces structures montrent que la plupart des chaînes latérales non polaires sont enfouies à l'intérieur d'une protéine, qui est étroitement emballée et qui exclut l'eau. Des études montrent qu'à mesure que la surface des chaînes latérales d'acides aminés augmente, l'énergie libre de transfert des acides aminés de l'eau à l'éthanol devient plus négative.

Figure : Transfert d'acides aminés de l'eau

(Revoir les énergies libres de transfert des groupements hydrophobes au chapitre 1D : Lipides dans l'eau - Thermodynamique )

b. dénaturation des protéines à basse température - Il a été observé que les protéines peuvent se dénaturer à basse température (moins de 0°C), ce qui suggère que les résidus non polaires deviennent plus "solubles" dans l'eau à basse température (c'est-à-dire qu'ils se déplacent de l'intérieur plus hydrophobe d'une protéine vers le plus extérieur polaire). Comparez la solubilité des gaz non polaires comme le CO2 ou le N2, qui sont plus solubles à basse température. Lorsque vous chauffez des solutions de gaz non polaires dans l'eau, les gaz deviennent moins solubles, comme en témoigne la formation de bulles (c'est-à-dire la séparation de phase des gaz dissous à mesure qu'ils deviennent plus insolubles). Si le comportement des protéines est régi par ce même comportement (plus grande solubilité des groupes non polaires à basse température), cela suggérerait que les protéines pourraient se dénaturer à basse température (conduisant à une exposition accrue à l'eau des chaînes latérales non polaires). Ce phénomène a été observé.

c. stabilité des protéines affectée par différentes espèces de sel - Il y a plus de 100 ans, Hofmeister a déterminé l'efficacité de différents cations et anions de sels pour précipiter les protéines du sérum sanguin dans les plages de concentration de 0,01 à 1 M. La série est présentée ci-dessous :

NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > guanidinium

SO42- > HPO42- > acétate > citrate > Cl- > NO3- > ClO3- > I- > ClO4- > SCN-

  • Un sel provenant de paires des premiers ions de ces séries (par exemple, (NH4)2SO4), lorsqu'il est ajouté à des solutions aqueuses de protéines, précipite la forme native de la protéine. Nous devons tenir compte du fait qu'il précipite la protéine, et que la protéine est précipitée à l'état natif et non dénaturé. En savoir plus sur la raison pour laquelle il précipite les protéines en un instant. Le premier ion de chaque série augmente la tension superficielle de l'eau (ce qui rend plus difficile la création d'une cavité dans l'eau pour s'adapter à la molécule non polaire). Cela diminue la solubilité des molécules non polaires. Il s'agit de molécules non polaires "salées", favorisant non pas la dissolution dans l'eau mais l'agrégation suivie d'une séparation de phases. Par analogie, ils stabiliseront l'état natif puisque les chaînes latérales hydrophobes enfouies auraient une propension réduite à se déplacer dans l'environnement aqueux.
  • Les derniers ions de la série ont moins d'effet sur la tension de surface et augmentent donc la solubilité des molécules non polaires ("salt-in"). Par analogie, ils déstabiliseront l'état natif puisque les chaînes latérales hydrophobes enfouies auraient une propension accrue à se déplacer dans le milieu aqueux.
  • Série Hofmeister

La solubilité du benzène dans les solutions salines aqueuses de cette série augmente de gauche à droite, tout comme la stabilité de la protéine native diminue de gauche à droite (c'est-à-dire que les résidus de noyau non polaires de la protéine deviennent plus "solubles" dans l'eau, entraînant sa dénaturation).

ré. conservation des résidus de noyau hydrophobes - Ces résidus sont hautement conservés et corrélés à la structure.

e. L'urée dénature les protéines - Un autre additif, l'urée, à des concentrations élevées est souvent utilisé pour dénaturer les protéines. Les gens pensaient que l'urée était en compétition avec les liaisons H intrachaîne et donc démêlait la protéine. Les arguments ci-dessus avec les liaisons H contestent cette affirmation puisque l'eau devrait alors dénaturer les protéines. Comment l'urée dénature-t-elle les protéines ? Il a été démontré que l'énergie libre de transfert des acides aminés non polaires dans l'urée 8M augmente négativement à mesure que les chaînes latérales deviennent plus grosses et plus non polaires.

Figure : Énergie libre de transfert des acides aminés non polaires dans l'urée 8 M

Ceci est également vrai pour la dénaturation par le chlorhydrate de guanidine. L'urée augmente également la solubilité des molécules non polaires d'une manière proportionnelle à leur surface.


Caractéristiques physiques du détergent

La concentration à laquelle les micelles commencent à se former est la concentration micellaire critique (CMC). La CMC est la concentration maximale en monomère et constitue une mesure de l'énergie libre de formation des micelles. Plus la CMC est basse, plus la micelle est stable et plus les molécules sont incorporées ou retirées lentement de la micelle. La structure de la région hydrophobe du détergent peut affecter la structure micellaire. Une augmentation de la longueur de la chaîne hydrocarbonée hydrophobe des détergents ioniques entraîne une augmentation de la taille des micelles et une CMC inférieure, car moins de molécules sont nécessaires pour construire une micelle.

Le nombre moyen de monomères dans une micelle est le numéro d'agrégation. Les valeurs de CMC et de nombre d'agrégation dépendent fortement de facteurs tels que la température, le pH, la force ionique et l'homogénéité et la pureté du détergent. De légères divergences dans les valeurs rapportées pour la CMC et le nombre d'agrégation peuvent être le résultat de variations dans les méthodes analytiques utilisées pour déterminer les valeurs. Les valeurs du nombre d'agrégation sont également décalées par la concentration, car le nombre de molécules de détergent par micelle peut augmenter si la concentration est supérieure à la CMC.

La facilité de retrait ou de remplacement est un facteur important dans le choix d'un détergent. Certaines des méthodes d'élimination des détergents les plus courantes comprennent :

  • Dialyse
  • Chromatographie par filtration sur gel
  • Chromatographie d'adsorption hydrophobe
  • Précipitation des protéines

La valeur CMC associée au détergent est un guide utile pour la force de liaison hydrophobe. Les détergents avec des valeurs de CMC plus élevées ont une liaison plus faible et sont par la suite plus faciles à éliminer par des méthodes de dialyse ou de déplacement. Les détergents avec de faibles valeurs de CMC nécessitent moins de détergent pour former des micelles et solubiliser les protéines ou les lipides.

Un autre paramètre utile lors de l'évaluation des détergents pour l'élimination en aval est la poids moléculaire micellaire, qui indique la taille relative des micelles. Les micelles plus petites sont plus facilement éliminées et sont généralement souhaitables lorsque des complexes protéine-détergent doivent être séparés en fonction de la taille moléculaire de la protéine. Le poids moléculaire micellaire peut être calculé en multipliant le nombre d'agrégation par le poids moléculaire du monomère.

Les point de nuage est la température à laquelle la solution détergente proche ou au-dessus de sa CMC se sépare en deux phases. Les micelles s'agrègent, formant généralement une phase trouble avec une concentration élevée en détergent, tandis que le reste de la solution devient appauvri en détergent. La solution à deux phases résultante peut être séparée, la protéine extraite étant située dans la phase riche en détergent. Détergents avec des températures de point de trouble basses, tels que TRITON ® X-114 (point de trouble

23 °C) sont recommandés pour une utilisation avec des protéines car des températures de point de trouble élevées peuvent dénaturer les protéines solubilisées. Le point de trouble peut être affecté par des changements dans la concentration du détergent, la température et l'ajout de sel ou de polymères tels que le dextrane et le polyéthylène glycol. Notez que la phase riche en détergent dépend également du ou des détergents spécifiques et de la concentration en sel. Dans certaines conditions, la phase peut être claire plutôt que trouble et se situer dans la phase supérieure ou inférieure de la solution. Dans les détergents non ioniques, ce comportement a été appliqué dans la séparation de phases et la purification des protéines membranaires. 2


Co-expression de chaperons et/ou de foldases.

Deux classes de protéines jouent un rôle important dans in vivo repliement des protéines.

  • Chaperons moléculaires favoriser l'isomérisation et le ciblage cellulaire appropriés en interagissant de manière transitoire avec les intermédiaires de repliement. Le mieux caractérisé E. coli les systèmes sont :
    • GroES-GroEL
    • ADNK-ADNJ-GrpE
    • ClpB
    • peptidyl prolyle cis/trans isomérases (IPP's)
    • disulfure oxydoréductase (DsbA) et la disulfure isomérase (DsbC)
    • protéine disulfure isomérase (PDI) - une protéine eucaryote qui catalyse à la fois l'oxydation de la protéine cystéine et l'isomérisation des liaisons disulfure. Il présente également une activité de chaperon.

    La co-expression d'une ou plusieurs de ces protéines avec la protéine cible pourrait conduire à des niveaux plus élevés de protéines solubles. Les niveaux de co-expression des différentes chaperons/foldases doivent être optimisés pour chaque cas individuel. DsbA et DsbC ont également montré des effets positifs sur les niveaux d'expression lorsqu'ils sont utilisés comme partenaire de fusion.


    L'effet hydrophobe et son rôle dans la dénaturation à froid ☆

    L'effet hydrophobe est considéré comme la principale force motrice du repliement des protéines et joue un rôle important dans la stabilité de ces biomolécules. La dénaturation à froid, où l'état natif de la protéine perd sa stabilité lors du refroidissement, est également attribuée à cet effet. Il n'est donc pas surprenant que beaucoup d'efforts aient été consacrés à la compréhension de ce phénomène. Malgré ces efforts, de nombreux aspects fondamentaux non résolus demeurent. Dans cet article, nous passons en revue et résumons la thermodynamique des protéines, l'effet hydrophobe et la dénaturation à froid. Nous commençons par rendre compte macroscopiquement de ces phénomènes puis passons à leur description au niveau atomique. Nous espérons que cette revue aidera le lecteur à mieux comprendre le rôle joué par l'effet hydrophobe dans la dénaturation à froid.


    Contenu

    De nombreux dispositifs et produits médicaux entrent en contact avec les surfaces internes du corps, comme les outils chirurgicaux et les implants. Lorsqu'un matériau non natif pénètre dans le corps, la première étape de la réponse immunitaire a lieu et la matrice extracellulaire de l'hôte et les protéines plasmatiques s'agrègent au matériau pour tenter de contenir, de neutraliser ou de murer l'agent nocif. [1] Ces protéines peuvent faciliter la fixation de divers types cellulaires tels que les ostéoblastes et les fibroblastes qui peuvent favoriser la réparation des tissus. [2] Pour aller plus loin, les dispositifs implantables peuvent être recouverts d'un matériau bioactif pour favoriser l'adsorption de protéines spécifiques, la formation de capsules fibreuses et la cicatrisation des plaies. Cela réduirait le risque de rejet de l'implant et accélérerait la récupération en sélectionnant les protéines et les cellules nécessaires à l'endothélialisation. Après la formation de l'endothélium, le corps ne sera plus exposé au corps étranger et arrêtera la réponse immunitaire.

    Les protéines telles que le collagène ou la fibrine servent souvent d'échafaudages pour l'adhésion cellulaire et la croissance cellulaire. Ceci fait partie intégrante de l'intégrité structurelle des feuillets cellulaires et de leur différenciation en structures tissulaires et organiques plus complexes. Les propriétés d'adhésion des protéines aux surfaces non biologiques influencent grandement si les cellules peuvent ou non s'y attacher indirectement via des échafaudages. Un implant comme un remplacement de la tige de la hanche nécessite une intégration avec les tissus hôtes, et l'adsorption des protéines facilite cette intégration.

    Les outils chirurgicaux peuvent être conçus pour être stérilisés plus facilement afin que les protéines ne restent pas adsorbées sur une surface, risquant ainsi une contamination croisée. Certaines maladies telles que la maladie de Creutzfeldt-Jakob et le kuru (toutes deux liées à la maladie de la vache folle) sont causées par la transmission de prions, qui sont des formes errantes ou mal repliées d'une protéine normalement native. Les outils chirurgicaux contaminés par des prions nécessitent une méthode spéciale de stérilisation pour éradiquer complètement tous les oligo-éléments de la protéine mal repliée, car ils sont résistants à de nombreuses méthodes de nettoyage normalement utilisées.

    Cependant, dans certains cas, l'adsorption des protéines sur les biomatériaux peut être un événement extrêmement défavorable. L'adhésion des facteurs de coagulation peut induire une thrombose, ce qui peut conduire à un accident vasculaire cérébral ou à d'autres blocages. [3] Certains dispositifs sont destinés à interagir avec l'environnement interne du corps, tels que les capteurs ou les véhicules d'administration de médicaments, et l'adsorption des protéines entraverait leur efficacité.

    Les protéines sont des biomolécules composées de sous-unités d'acides aminés. Chaque acide aminé a une chaîne latérale qui gagne ou perd de la charge en fonction du pH de l'environnement, ainsi que de ses propres qualités polaires/non polaires. [4]

    Les régions chargées peuvent grandement contribuer à la façon dont cette protéine interagit avec d'autres molécules et surfaces, ainsi qu'à sa propre structure tertiaire (repliement des protéines). En raison de leur hydrophilie, les acides aminés chargés ont tendance à se trouver à l'extérieur des protéines, où ils sont capables d'interagir avec les surfaces. [5] C'est la combinaison unique d'acides aminés qui confère à une protéine ses propriétés. En termes de chimie de surface, l'adsorption de protéines est un phénomène critique qui décrit l'agrégation de ces molécules à l'extérieur d'un matériau. La tendance des protéines à rester attachées à une surface dépend en grande partie des propriétés du matériau telles que l'énergie de surface, la texture et la distribution relative des charges. Les protéines plus grosses sont plus susceptibles de s'adsorber et de rester attachées à une surface en raison du nombre plus élevé de sites de contact entre les acides aminés et la surface (Figure 1).

    Énergie d'Adsorption de Protéines Modifier

    L'idée fondamentale derrière l'adsorption spontanée des protéines est que l'adsorption se produit lorsque plus d'énergie est libérée que gagnée selon la loi de Gibbs de l'énergie libre.

    Cela se voit dans l'équation :

    • les publicités est le changement net des paramètres
    • g est l'énergie gratuite de Gibbs
    • T est la température (unité SI : kelvin)
    • S est l'entropie (unité SI : joule par kelvin)
    • H est l'enthalpie (unité SI : joule)

    Pour que l'adsorption des protéines se produise spontanément, les publicitésg doit être un nombre négatif.

    Effet Vroman Modifier

    Les protéines et autres molécules sont constamment en compétition les unes avec les autres sur les sites de liaison sur une surface. L'effet Vroman, développé par Leo Vroman, postule que les molécules petites et abondantes seront les premières à recouvrir une surface. Cependant, au fil du temps, des molécules ayant une plus grande affinité pour cette surface particulière les remplaceront. Ceci est souvent observé dans les matériaux qui entrent en contact avec le sang où la fibrine, qui est généralement abondante, se lie d'abord à la surface et, au fil du temps, sera remplacée par des protéines plus grosses. [6]

    Taux d'adsorption Modifier

    Pour que les protéines s'adsorbent, elles doivent d'abord entrer en contact avec la surface par un ou plusieurs de ces mécanismes de transport majeurs : diffusion, convection thermique, écoulement en vrac ou une combinaison de ceux-ci. Lorsque l'on considère le transport des protéines, il est clair comment les gradients de concentration, la température, la taille des protéines et la vitesse d'écoulement influenceront l'arrivée des protéines sur une surface solide. Dans des conditions de faible débit et de gradients de température minimes, le taux d'adsorption peut être modélisé d'après l'équation du taux de diffusion. [5]

    Équation du taux de diffusion Modifier

    • est le coefficient de diffusion
    • m est la concentration superficielle de la protéine
    • Co est la concentration en vrac des protéines
    • t est le temps

    Une concentration en vrac plus élevée et/ou un coefficient de diffusion plus élevé (inversement proportionnel à la taille moléculaire) entraînent un plus grand nombre de molécules arrivant à la surface. Les interactions de surface de protéines qui en résultent entraînent des concentrations locales élevées de protéines adsorbées, atteignant des concentrations jusqu'à 1000 fois supérieures à celles de la solution en vrac. [5] Cependant, le corps est beaucoup plus complexe, contenant des flux et une diffusion convective, et ceux-ci doivent être pris en compte dans le taux d'adsorption des protéines.

    Flux dans un canal mince Modifier

    • C est la concentration
    • est le coefficient de diffusion
    • V est la vitesse d'écoulement
    • X est la distance le long du canal
    • ?? est le taux de cisaillement du mur
    • b est la hauteur du canal

    Cette équation [5] est particulièrement applicable à l'analyse de l'adsorption des protéines sur les dispositifs biomédicaux dans les artères, par ex. stents.

    Les quatre classes fondamentales de forces et d'interaction dans l'adsorption des protéines sont : 1) interaction ionique ou électrostatique, 2) liaison hydrogène, 3) interaction hydrophobe (largement entraînée entropiquement) et 4) interactions de type transfert de charge ou particule d'électrons donneur/accepteur. . [7]

    Interactions ioniques ou électrostatiques Modifier

    La charge des protéines est déterminée par le pKa de ses chaînes latérales d'acides aminés, et l'acide aminé terminal et l'acide carboxylique. Les protéines dont le point isoélectrique (pI) est supérieur aux conditions physiologiques ont une charge positive et les protéines dont le pI est inférieur aux conditions physiologiques ont une charge négative. La charge nette de la protéine, déterminée par la somme des charges de ses constituants, entraîne une migration électrophorétique dans un champ électrique physiologique. Ces effets sont à courte portée en raison de la constante diélectrique élevée de l'eau, cependant, une fois que la protéine est proche d'une surface chargée, le couplage électrostatique devient la force dominante. [8]

    Liaison Hydrogène Modifier

    L'eau a autant de propension à former des liaisons hydrogène que n'importe quel groupe dans un polypeptide. Au cours d'un processus de repliement et d'association, les groupes peptidiques et acides aminés échangent des liaisons hydrogène avec l'eau. Ainsi, la liaison hydrogène n'a pas un fort effet stabilisant sur l'adsorption des protéines en milieu aqueux. [9]

    Illustration de deux molécules d'eau interagissant pour former une liaison hydrogène

    Interactions hydrophobes Modifier

    Les interactions hydrophobes sont essentiellement des interactions entropiques dues essentiellement à des phénomènes d'ordre/désordre en milieu aqueux. L'énergie libre associée à la minimisation des zones interfaciales est responsable de la minimisation de la surface des gouttelettes d'eau et des bulles d'air dans l'eau. Ce même principe est la raison pour laquelle les chaînes latérales d'acides aminés hydrophobes sont orientées loin de l'eau, minimisant leur interaction avec l'eau. Les groupes hydrophiles à l'extérieur de la molécule entraînent une solubilité dans l'eau des protéines. La caractérisation de ce phénomène peut se faire en traitant ces relations hydrophobes avec des concepts d'énergie libre interfaciale. En conséquence, on peut considérer la force motrice de ces interactions comme la minimisation de l'énergie libre interfaciale totale, c'est-à-dire la minimisation de la surface. [dix]

    Interactions de transfert de charge Modifier

    Les interactions de transfert de charge sont également importantes dans la stabilisation des protéines et l'interaction de surface. Dans les processus donneurs-accepteurs généraux, on peut penser à la présence d'une densité électronique excessive qui peut être donnée à une espèce électrophile. Dans les milieux aqueux, ces interactions de soluté sont principalement dues aux effets des électrons orbitaux pi. [11]

    Température Modifier

    La température a un effet à la fois sur l'état d'équilibre et la cinétique d'adsorption des protéines. La quantité de protéines adsorbées à haute température est généralement supérieure à celle à température ambiante. La variation de température provoque des changements de conformation dans la protéine influençant l'adsorption. Ces réarrangements conformationnels dans les protéines entraînent un gain d'entropie qui agit comme une force motrice majeure pour l'adsorption des protéines. L'effet de la température sur l'adsorption des protéines peut être observé dans les processus de fabrication des aliments, en particulier les aliments liquides tels que le lait, ce qui provoque un encrassement important des surfaces murales des équipements où le traitement thermique est effectué. [12] [13]

    Force ionique Modifier

    La force ionique détermine la longueur de Debye qui est en corrélation avec la distance d'amortissement du potentiel électrique d'une charge fixe dans un électrolyte. Ainsi, plus la force ionique est élevée, plus les interactions électrostatiques entre les entités chargées sont courtes. En conséquence, l'adsorption de protéines chargées sur des substrats de charges opposées est entravée tandis que l'adsorption sur des substrats de charges similaires est améliorée, influençant ainsi la cinétique d'adsorption. De plus, une force ionique élevée augmente la tendance des protéines à s'agréger. [12]

    Système multiprotéique Modifier

    Lorsqu'une surface est exposée à une solution multiprotéique, l'adsorption de certaines molécules protéiques est favorisée par rapport aux autres. Les molécules de protéines approchant la surface rivalisent pour les sites de liaison. Dans le système multiprotéique, une attraction entre les molécules peut se produire, alors que dans les solutions monoprotéiques, les interactions répulsives intermoléculaires dominent. De plus, il existe une propagation des protéines dépendante du temps, où les molécules de protéines entrent initialement en contact avec des sites de liaison minimaux à la surface. Avec l'augmentation du temps de résidence de la protéine à la surface, la protéine peut se déployer pour interagir avec des sites de liaison supplémentaires. Il en résulte une augmentation en fonction du temps des points de contact entre la protéine et la surface. Cela rend en outre la désorption moins probable. [5]

    Technique d'épuisement de la solution Modifier

    Cette technique mesure un changement de concentration des protéines dans la solution en vrac avant et après adsorption, cp. Tout changement de concentration en protéines est attribué à la couche adsorbée,p.

    Ce procédé nécessite également un matériau à grande surface spécifique tel que des adsorbants particulaires et perlés. [14]

    Ellipsométrie Modifier

    L'ellipsométrie a été largement utilisée pour mesurer la cinétique d'adsorption des protéines ainsi que la structure de la couche de protéines adsorbées. C'est une technique optique qui mesure le changement de polarisation de la lumière après réflexion sur une surface. Cette technique nécessite des surfaces planes et réfléchissantes, de préférence du quartz, du silicium ou de la silice, et une forte variation de l'indice de réfraction lors de l'adsorption des protéines. [12]

    Microscopie à force atomique Modifier

    La microscopie à force atomique (AFM) est une technique de microscopie puissante utilisée pour étudier des échantillons à l'échelle nanométrique et est souvent utilisée pour imager la distribution des protéines sur une surface. Il se compose d'un porte-à-faux avec une pointe pour balayer la surface. C'est un outil précieux pour mesurer l'interaction protéine-protéine et protéine-surface. Cependant, le facteur limitant de nombreuses études AFM est que l'imagerie est souvent réalisée après séchage de la surface, ce qui pourrait affecter le repliement des protéines et la structure de la couche de protéines. De plus, la pointe en porte-à-faux peut déloger une protéine ou onduler la couche de protéine. [12] [15]

    Résonance plasmonique de surface Modifier

    La résonance plasmonique de surface (SPR) a été largement utilisée pour mesurer l'adsorption des protéines avec une sensibilité élevée. Cette technique est basée sur l'excitation de plasmons de surface, des ondes électromagnétiques longitudinales provenant de l'interface entre les métaux et les diélectriques. Le dépôt sur la surface conductrice de molécules et de couches minces à moins de 200 nm modifie les propriétés diélectriques du système et donc la réponse SPR, signalant la présence de molécules sur une surface métallique. [16]

    Microbalance à cristal de quartz Modifier

    La microbalance à cristal de quartz (QCM) est un capteur acoustique construit autour d'un cristal de quartz en forme de disque. Il utilise l'effet piézoélectrique inverse. QCM, et des versions étendues telles que QCM-D, a été largement utilisé pour les études d'adsorption de protéines, en particulier, la surveillance en temps réel de l'adsorption de protéines sans marqueur. En plus des études d'adsorption, QCM-D fournit également des informations sur les modules d'élasticité, la viscosité et les changements de conformation [17]

    Spectroscopie optique en mode lumineux à guide d'ondes Modifier

    La spectroscopie optique à guide d'ondes (OWLS) est un dispositif qui repose sur un guide d'ondes optique à couche mince, renfermant un nombre discret d'ondes électromagnétiques guidées. Le guidage est réalisé au moyen d'un coupleur à grille. Il est basé sur les mesures de l'indice de réfraction effectif d'une couche mince au-dessus du guide d'ondes. Cette technique ne fonctionne que sur des surfaces très transparentes. [17]

    D'autres méthodes largement utilisées pour mesurer la quantité de protéines adsorbées sur les surfaces comprennent le radiomarquage, le dosage de Lowry, la réflectométrie à angle de balayage, la fluorescence à réflexion interne totale, le dosage de l'acide bicinchoninique, etc.

    Composition chimique Modifier

    La liaison métallique fait référence à la liaison spécifique entre les ions métalliques positifs et les nuages ​​d'électrons de valence environnants. [18] Cette force intermoléculaire est relativement forte et donne lieu à l'orientation cristalline répétée des atomes, également appelée son système de réseau. Il existe plusieurs types de formations de réseau communes, et chacune a sa propre densité de tassement et sa proximité atomique. Les nuages ​​d'électrons chargés négativement des ions métalliques entraveront stériquement l'adhésion des régions de protéines chargées négativement en raison de la répulsion de charge, limitant ainsi les sites de liaison disponibles d'une protéine à une surface métallique.

    La formation de réseau peut conduire à une connexion avec des sites d'adhésion potentiels exposés aux ions métalliques (MIDAS) qui sont des sites de liaison pour le collagène et d'autres protéines. [19] La surface du métal a des propriétés différentes de celles de la masse puisque les sous-unités répétitives cristallines normales se terminent à la surface. Cela laisse les atomes de surface sans atome voisin d'un côté, ce qui modifie intrinsèquement la distribution des électrons. Ce phénomène explique également pourquoi les atomes de surface ont une énergie plus élevée que la masse, souvent simplement appelée énergie de surface. Cet état d'énergie plus élevée est défavorable, et les atomes de surface tenteront de le réduire en se liant aux molécules réactives disponibles. [20]

    Ceci est souvent accompli par adsorption de protéines, où les atomes de surface sont réduits à un état énergétique plus avantageux.

    L'environnement interne du corps est souvent modélisé comme un environnement aqueux à 37 °C à pH 7,3 avec beaucoup d'oxygène dissous, d'électrolytes, de protéines et de cellules. [5] Lorsqu'ils sont exposés à l'oxygène pendant une période prolongée, de nombreux métaux peuvent s'oxyder et augmenter leur état d'oxydation de surface en perdant des électrons. [21] Ce nouvel état cationique laisse la surface avec une charge positive nette et une plus grande affinité pour les groupes latéraux de protéines chargées négativement. Au sein de la grande diversité des métaux et alliages métalliques, nombre d'entre eux sont sensibles à la corrosion lorsqu'ils sont implantés dans le corps. Les éléments qui sont plus électronégatifs sont corrodés plus rapidement lorsqu'ils sont exposés à un environnement aqueux riche en électrolytes tel que le corps humain. [22] L'oxydation et la corrosion réduiront l'énergie libre, affectant ainsi l'adsorption des protéines, comme le montre l'équation. 1. [23]

    Effets de la topographie Modifier

    La rugosité et la texture de la surface ont une influence indéniable sur l'adsorption des protéines sur tous les matériaux, mais avec l'omniprésence des procédés d'usinage des métaux, il est utile de déterminer comment ceux-ci influent sur le comportement des protéines. L'adsorption initiale est importante, ainsi que le maintien de l'adhérence et de l'intégrité. La recherche a montré que la rugosité de la surface peut favoriser l'adhésion des protéines d'échafaudage et des ostéoblastes, et entraîne une augmentation de la minéralisation de la surface. [24] Les surfaces avec plus de caractéristiques topographiques et de rugosité auront une surface plus exposée avec laquelle les protéines pourront interagir. [5] En termes d'applications d'ingénierie biomédicale, les techniques de micro-usinage sont souvent utilisées pour augmenter l'adhérence des protéines aux implants dans l'espoir de raccourcir le temps de récupération. La technique du motif laser introduit des rainures et une rugosité de surface qui influenceront l'adhérence, la migration et l'alignement. Le grenaillage, une méthode analogue au sablage, et le mordançage chimique se sont avérés être des techniques efficaces de rugosité de surface qui favorisent la stabilité à long terme des implants en titane. [25] L'augmentation de la stabilité est le résultat direct de l'augmentation observée de la matrice extracellulaire et de la fixation du collagène, ce qui entraîne une augmentation de la fixation et de la minéralisation des ostéoblastes par rapport aux surfaces non rugueuses. [26] L'adsorption n'est cependant pas toujours souhaitable. Les machines peuvent être affectées négativement par l'adsorption, en particulier avec l'adsorption de protéines dans l'industrie alimentaire.

    Les polymères sont d'une grande importance lors de l'examen de l'adsorption des protéines dans le domaine biomédical. Les polymères sont composés d'un ou plusieurs types de "mères" liés ensemble de manière répétée, généralement par des liaisons covalentes directionnelles. Au fur et à mesure que la chaîne se développe par l'ajout de mers, les propriétés chimiques et physiques du matériau sont dictées par la structure moléculaire du monomère.En sélectionnant soigneusement le ou les types de mers dans un polymère et son procédé de fabrication, les propriétés chimiques et physiques d'un polymère peuvent être hautement adaptées pour adsorber des protéines et des cellules spécifiques pour une application particulière.

    Effets de conformation Modifier

    L'adsorption des protéines entraîne souvent des changements conformationnels importants, qui font référence à des changements dans les structures secondaires, tertiaires et quartes des protéines. En plus des taux et des quantités d'adsorption, l'orientation et la conformation sont d'une importance critique. Ces changements de conformation peuvent affecter l'interaction des protéines avec des ligands, des substrats et des antigènes qui dépendent de l'orientation du site de liaison d'intérêt. Ces changements de conformation, résultant de l'adsorption des protéines, peuvent également dénaturer la protéine et modifier ses propriétés natives.

    Adsorption sur des échafaudages en polymère Modifier

    L'ingénierie tissulaire est un domaine relativement nouveau qui utilise un échafaudage comme plate-forme sur laquelle les cellules souhaitées prolifèrent. Il n'est pas clair ce qui définit un échafaudage idéal pour un type de tissu spécifique. Les considérations sont complexes et l'adsorption des protéines ne fait qu'ajouter à la complexité. Bien que l'architecture, la mécanique structurelle et les propriétés de surface jouent un rôle clé, la compréhension de la dégradation et du taux d'adsorption des protéines est également essentielle. En plus des éléments essentiels de la mécanique et de la géométrie, une construction d'échafaudage appropriée possédera des propriétés de surface optimisées pour la fixation et la migration des types de cellules présentant un intérêt particulier.

    En général, il a été découvert que les échafaudages qui ressemblent étroitement aux environnements naturels du tissu en cours d'ingénierie sont les plus réussis. En conséquence, de nombreuses recherches ont été consacrées à l'étude des polymères naturels qui peuvent être adaptés, grâce à une méthodologie de traitement, à des critères de conception spécifiques. Le chitosan est actuellement l'un des polymères les plus largement utilisés car il est très similaire aux glycosaminoglycanes naturels (GAG) et il est dégradable par les enzymes humaines. [28]

    Chitosan Modifier

    Le chitosan est un polysaccharide linéaire contenant des résidus dérivés de la chitine liés et est largement étudié en tant que biomatériau en raison de sa haute compatibilité avec de nombreuses protéines dans le corps. Le chitosane est cationique et réagit donc électrostatiquement avec de nombreux protéoglycanes, des GAG anioniques et d'autres molécules possédant une charge négative. Étant donné que de nombreuses cytokines et facteurs de croissance sont liés aux GAG, les échafaudages avec les complexes chitosane-GAG sont capables de retenir ces protéines sécrétées par les cellules adhérentes. Une autre qualité du chitosane qui lui confère un bon potentiel de biomatériau est sa haute densité de charge dans les solutions. Cela permet au chitosane de former des complexes ioniques avec de nombreux polymères anioniques hydrosolubles, élargissant ainsi la gamme de protéines capables de s'y lier et élargissant ainsi ses utilisations possibles. [29]

    Polymère Structure d'échafaudage Tissu cible Type de cellule d'application Réf
    Chitosan Blocs poreux 3D OS ROS de type ostéoblaste [30]
    Chitosan-polyester Maillages de fibres 3D OS MSC humain [31]
    Chitosan-alginate Gel injectable OS MG63 de type ostéoblaste [32]
    Chitosan-gélatine Cylindres poreux 3D Cartilage Chondrocytes [33]
    Chitosan-GP Gel injectable Cartilage Chondrocytes [34]
    Chitosan-collagène Membranes poreuses Peau Co-culture de fibroblastes et de kératinocytes [35]
    Tableau 1: Structures, tissus cibles et types de cellules d'application des échafaudages à base de chitosane

    L'adsorption des protéines est essentielle pour de nombreuses applications industrielles et biomédicales. Une prédiction précise de l'adsorption des protéines permettra de progresser dans ces domaines.

    Base de données d'adsorption biomoléculaire Modifier

    La base de données d'adsorption biomoléculaire (BAD) est une base de données en ligne disponible gratuitement avec des données expérimentales d'adsorption de protéines collectées dans la littérature. La base de données peut être utilisée pour la sélection de matériaux pour la fabrication de dispositifs microfluidiques et pour la sélection des conditions de fonctionnement optimales des dispositifs de laboratoire sur puce. La quantité de protéines adsorbées à la surface peut être prédite à l'aide de la prédiction basée sur les réseaux de neurones disponible au BAD. Cette prédiction a été validée comme étant inférieure à 5% d'erreur pour les données globales disponibles dans le BAD. D'autres paramètres, tels que l'épaisseur des couches de protéines et la tension superficielle des surfaces recouvertes de protéines, peuvent également être estimés. [ citation requise ]


    Voir la vidéo: Voici Quelque Chose qui Vous Maintient en Forme Même Après 99 ans:voici Comment et Pourquoi? (Août 2022).