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Mutations clonales et sous-clonales dans le cancer

Mutations clonales et sous-clonales dans le cancer


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Cela semblera probablement une question idiote, mais je ne sais pas à qui demander. D'accord, c'est parti.

McGranahan et al link ont ​​découvert que les tumeurs avec une charge élevée en antigène clonal sont plus susceptibles de répondre au blocage du point de contrôle immunitaire.

Bozic et al link (en même temps) ont proposé un modèle probabiliste pour déterminer le nombre de mutations clonales et sous-clonales. Ils ont découvert que les types de cancer à croissance rapide (où la croissance correspond à la division cellulaire plutôt qu'à la mort cellulaire) sont plus susceptibles de générer un nombre plus élevé de mutations sous-clonales.

Sachant que le mélanome et le NSCLC sont des types de cancer à croissance rapide, ces résultats semblent se contredire. Nous savons qu'ils sont rapides et nous savons que le mélanome et le NSCLC sont des types de cancer où l'immunothérapie est la plus efficace.

De plus, quelle est la probabilité qu'une certaine lésion cancéreuse ait de nombreuses mutations partagées ? Une lésion totalement génétiquement homogène sans ramifications avec un nombre très élevé de mutations.

Ou (beaucoup plus probable) j'ai raté quelque chose.


Ils ne se contredisent pas vraiment ; la clonalité des néoantigènes ajoute une couche supplémentaire à la charge mutationnelle globale ; mais la charge mutationnelle globale (et par conséquent la charge globale en néo-antigènes, car les mutations dans un contexte de séquence fixe génèrent des néo-antigènes à un certain taux) en elles-mêmes sont également prédictives.

Les tumeurs avec une charge élevée en néo-antigènes ont tendance à mieux répondre de toute façon (voir Snyder et al, NEJM, Rizvi et al, Science et Van Allen et al, Science) et aussi le fait que les cancers déficients dans la réparation des mésappariements ont généralement tendance à répondre.

Donc, si vous prenez déjà des tumeurs à néoantigène élevé (les poumons et les mélanomes ont des charges de mutation extrêmement élevées), puis que vous les stratifiez en fonction de la clonalité du néoantigène, vous avez tendance à stratifier davantage les patients par réponse associée au blocage du point de contrôle.

Le but de McGranahan et al était de souligner qu'il est possible d'augmenter les réponses immunitaires qui ciblent tous les cellules d'une tumeur, et que la capacité de le faire peut dicter la survie en général et la réponse de blocage des points de contrôle en particulier, mais seul lorsque la présentation de l'antigène et l'infiltration immunitaire sont intactes. McGranahan et al notent que les néoantigènes clonaux ne font rien dans les cancers squameux du poumon en raison de l'infiltration de CD8 appauvrie et de l'expression du CMH de classe I et il existe d'autres travaux (voir http://www.pnas.org/content/113/48/E7759.abstract )

Quant à ce peu

De plus, quelle est la probabilité qu'une certaine lésion cancéreuse ait de nombreuses mutations partagées ? Une lésion totalement génétiquement homogène sans ramifications avec un nombre très élevé de mutations.

C'est assez compliqué à répondre; mais en règle générale, il convient de rappeler que, à mesure que le nombre de divisions et le nombre de mutations (et donc de sous-clones potentiels) augmente, pour que les tumeurs restent clonales, il faut des balayages sélectifs extrêmement puissants de sorte qu'à tout moment un très petit nombre des clones a tendance à prédominer, et au moins dans les tumeurs non traitées/pré-traitement, il y a une tendance pour beaucoup d'entre eux à montrer des modèles d'évolution effectivement neutres ( http://www.nature.com/ng/journal/v48/ n3/abs/ng.3489.html )


Les tendances

Le séquençage de nouvelle génération a révélé la complexité de l'évolution tumorale. Les cancers sont généralement composés de plusieurs sous-clones distincts génétiquement apparentés évoluant en parallèle. Cela représente un changement par rapport au paradigme traditionnel de l'évolution continue d'un clone de plus en plus agressif.

Les forces évolutives dans les tumeurs hétérogènes sont complexes. Il peut y avoir à la fois concurrence et coopération entre les sous-clones. Des preuves récentes suggèrent également que l'évolution neutre peut être commune à une gamme de tumeurs.

L'architecture sous-clonale varie dans l'espace et dans le temps. L'hétérogénéité spatiale pose un problème de biais d'échantillonnage, en particulier si les sous-clones individuels dominent les régions tumorales. La circulation de l'ADN tumoral permet de surveiller la charge de morbidité et la résistance aux médicaments au fil du temps, ce qui peut résoudre les problèmes de biais d'échantillonnage et l'exigence d'un échantillonnage répété de la tumeur.

Les tumeurs sont composées de sous-clones génétiquement hétérogènes qui peuvent diverger tôt au cours de la croissance tumorale. Cependant, nos stratégies de traitement et d'évaluation des résultats pour les patients sont largement basées sur le paradigme linéaire classique de l'évolution du cancer. De plus en plus d'études révèlent que des sous-clones mineurs peuvent déterminer l'évolution clinique de la maladie et que l'hétérogénéité temporelle et spatiale doit être prise en compte dans la gestion de la maladie. Dans cet article, nous passons en revue les preuves de l'hétérogénéité clonale du cancer, en évaluant l'importance des sous-clones tumoraux et leur croissance à travers l'évolution darwinienne et neutre. Des changements majeurs dans la pratique clinique actuelle et les conceptions des essais, visant à comprendre l'évolution du cancer patient par patient, peuvent être nécessaires pour parvenir à un traitement plus efficace de la maladie métastatique hétérogène.


Introduction : l'évolution du cancer en tant que processus en plusieurs étapes dans le temps

Le risque de développer un cancer augmente régulièrement tout au long de la vie d'un individu, augmentant fortement à partir de l'âge moyen. Dans les années 1950, Armitage et Doll [1] ont proposé que les tendances observées dans l'incidence du cancer seraient cohérentes avec la progression de la cancérogenèse à travers une série de six ou sept aberrations cellulaires séquentielles. L'effet cumulatif des mutations au cours du développement du cancer a ensuite été explicitement démontré dans des travaux séminaux sur le rétinoblastome, dans lesquels deux événements mutationnels sont nécessaires pour initier la formation de tumeurs, inspirant l'hypothèse du « deux coups » de Knudson [2]. À la fin des années 1970, une image globale du développement du cancer commençait à émerger, formalisée dans le modèle clonal d'évolution tumorale proposé par Nowell [3], qui est encore largement accepté aujourd'hui. Essentiellement, l'évolution du cancer peut être considérée comme un processus darwinien. Les mutations s'accumulent de manière aléatoire dans les génomes des cellules normales et, lorsqu'elles sont avantageuses, entraînent des expansions clonales résultant de la sélection naturelle [4].

Au cours des dernières décennies, des gènes clés ont été identifiés qui sont fréquemment aberrés dans le génome du cancer, soit par des approches traditionnelles de génétique moléculaire, soit plus récemment par le séquençage de nouvelle génération [5,6,7]. Cependant, on sait peu de choses sur le moment des mutations somatiques ou sur l'ordre dans lequel elles se produisent au cours de l'évolution tumorale. En 1990, Fearon et Vogelstein [8] ont été les premiers à aborder cette question dans une étude historique sur les tumeurs colorectales, retraçant l'acquisition de mutations ponctuelles et les changements de nombre de copies au cours de la progression du tissu épithélial normal vers le carcinome et la maladie métastatique. Depuis ce travail, d'autres ont tenté de reconstruire des voies similaires d'évolution tumorale pour d'autres types de tissus en utilisant la même approche, généralement en comparant les aberrations génomiques présentes dans différents échantillons de tumeurs, soit entre les lésions précurseurs et les tumeurs résultantes, soit à travers des cohortes de patients atteints de différents stades de la maladie [9,10,11,12].

Ces dernières années, ces analyses de la progression du cancer ont été encore avancées par l'application de modèles mathématiques tels que les arbres oncogénétiques et les graphes acycliques dirigés [13]. Cependant, le séquençage du génome du cancer permet désormais une étude beaucoup plus directe de l'évolution tumorale chez des patients individuels à partir d'échantillons séparés temporellement ou spatialement [14,15,16]. De plus, le développement d'algorithmes pour reconstruire l'histoire évolutive d'une tumeur a permis d'inférer le moment de mutations spécifiques et de caractériser une séquence d'événements, à partir du séquençage du génome entier de biopsies individuelles [17].

Décrypter la séquence temporelle des événements au fur et à mesure que les cancers se développent et progressent est essentiel pour une compréhension globale de la tumorigenèse et pour identifier les premiers événements de l'évolution tumorale. Cela peut fournir des marqueurs pour un diagnostic et un traitement plus rapides, ainsi qu'améliorer notre capacité à prédire la progression du cancer. Ici, nous passons en revue les différentes approches pour examiner l'évolution des tumeurs, y compris les méthodologies actuelles pour chronométrer les mutations, et décrivons comment cela a fait progresser notre compréhension de la biologie des tumeurs.


Évolution et impact des mutations sous-clonales dans le cancer papillaire de la thyroïde

Contrairement à de nombreux cancers, le schéma d'évolution tumorale dans le cancer papillaire de la thyroïde (CTP) et son rôle potentiel dans la rechute n'ont pas été élucidés. Dans cette étude, un séquençage multirégional de l'exome entier (WES) a été réalisé sur des tumeurs PTC à un stade précoce (n = 257 régions tumorales) de 79 individus, dont 17 qui avaient développé une rechute, pour comprendre le cadre temporel et spatial dans lequel les sous-clonaux les mutations catalysent l'évolution tumorale et sa pertinence clinique potentielle. Des tissus tumoraux appariés de rechute primaire étaient également disponibles pour un sous-ensemble d'individus. Le catalogue de variantes résultant a été analysé pour explorer les histoires évolutives, définir les événements clonaux et sous-clonaux et évaluer la relation entre l'hétérogénéité intra-tumorale et la survie sans rechute. L'approche WES multirégionale a été essentielle pour classer correctement les mutations sous-clonales, dont 40 % auraient autrement été considérées à tort comme clonales. Nous avons observé des modèles d'évolution à la fois linéaires et ramifiés dans notre cohorte PTC. Un fardeau plus élevé de mutations sous-clonales était significativement associé à un risque accru de rechute. Nous concluons que la rechute dans le PTC, bien que généralement rare, ne suit pas un chemin évolutif prévisible et que le fardeau des mutations sous-clonales peut servir de facteur pronostique. Des études plus importantes utilisant le séquençage multirégional chez des sujets de cas de PTC en rechute avec des tissus primaires correspondants sont nécessaires pour confirmer ces observations.

Mots clés: évolution exome séquençage multi-tissus papillaire cancer de la thyroïde phylogénie récurrence mutations sous-clonales.

Copyright © 2019 Société américaine de génétique humaine. Publié par Elsevier Inc. Tous droits réservés.


Génomique du cancer et architectures clonales

Le séquençage des génomes cancéreux, facilité par l'avènement du séquençage du génome entier de deuxième génération, a ouvert une nouvelle fenêtre sur la complexité de la génétique des cellules cancéreuses et de sa biologie évolutive 2 . Étant donné que la transformation et les métastases sont probablement clonales dans la plupart des cas 2 , provenant de cellules uniques, l'identification des mutations présentes dans toutes les cellules d'une tumeur peut reconstruire le génotype de la cellule fondatrice. Ces événements fondateurs limitent la complexité génétique et clonale des tumeurs. Nous avions déjà une longue liste de mutations motrices récurrentes (avec gain ou perte de fonction) via la cartographie fine des cassures chromosomiques, le séquençage des gènes candidats et le criblage fonctionnel d'échantillons en vrac de tumeurs. Ce qui est maintenant apparu dans les criblages génomiques est un portrait de la complexité habituelle des génomes du cancer. Les cancers individuels peuvent contenir des centaines ou des centaines de milliers de mutations et d'altérations chromosomiques 2 , dont la grande majorité sont supposées être des mutations neutres résultant d'une instabilité génétique. L'instabilité chromosomique (amplifications, délétions, translocations et autres changements structurels) est une caractéristique commune de la plupart des cancers, mais il n'est pas clair si le taux de mutations ponctuelles est augmenté dans le cancer 2,21,23,52. Des altérations évolutivement neutres s'enregistrent vraisemblablement dans les écrans à la suite de l'auto-stop sur des expansions clonales entraînées par des altérations sélectivement avantageuses ou par dérive. De plus, les données confirment de manière frappante que chaque cancer chez chaque patient a un profil génomique individuellement unique. Il se peut que seul un nombre modeste de traits phénotypiques soient nécessaires pour négocier toutes les contraintes et évoluer vers un statut complètement malin ou métastatique 25 mais l'inférence est que cela peut être réalisé par une variété presque infinie de trajectoires évolutives et avec de multiples combinaisons différentes de mutations du conducteur 44 .

Paradoxalement, les profils génomiques sous-estiment la complexité. Il s'agit pour la plupart, à ce jour, d'instantanés ponctuels pris à partir d'un seul échantillon à un seul moment de diagnostic. L'échantillonnage en série ou en parallèle que nous connaissons, via une analyse génétique plus conventionnelle, révèle la diversité génétique. Le séquençage du génome entier d'échantillons de tumeurs primaires appariés par rapport à des échantillons de métastases a été limité à ce jour, mais a révélé que les lésions métastatiques individuelles sont d'origine clonale et génétiquement uniques, mais avec des ancêtres clonaux retraçant la tumeur primaire 2 . Les descriptions du “le génome” d'un cancer sont peut-être trompeuses à un autre égard. Des variants génétiques sont couramment identifiés dans 5 % et 50 % des lectures, ce qui suggère une distribution sous-clonale de la plupart des mutations 53 . Mais, de manière critique, le schéma de ségrégation des mutations au sein des sous-clones est perdu lorsque l'ADN est extrait de la population cellulaire totale. Cette caractéristique est importante si les profils génomiques spécifiques aux patients doivent fournir une plate-forme pour la sélection de cibles thérapeutiques. La diversité génétique sous-clonale est sans doute un déterminant clé de l'échec thérapeutique. Cette limitation de la génomique du cancer est largement reconnue et représente un défi considérable, techniquement et bioinformatiquement. Comprendre la diversité génétique au sein des néoplasmes, et comment elle change en réponse aux interventions, nécessitera un séquençage approfondi 40 et l'interrogation des génomes de cellules individuelles pour les schémas de ségrégation des mutations.


Shedden K, Li Y, Ouillette P, Malek S N: Caractéristiques de la leucémie lymphoïde chronique avec mutations somatiquement acquises dans l'exon 34 de NOTCH1. Leucémie 26(5) : 1108-10, 2012. PM22182918/PMC3634572

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Discussion

Le ciblage des « mutations motrices » dans le cancer est considéré comme une nouvelle approche thérapeutique importante qui prend en considération un paysage mutationnel varié présent dans les tumeurs, même lorsqu'elles surviennent dans le même tissu [34-36]. Le paradigme défini par la thérapie TKI (inhibiteurs de la tyrosine kinase) de la LMC (leucémie myéloïde chronique) et l'inhibition de l'ALK (lymphome kinase anaplasique) dans un petit sous-ensemble de patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules est assez convaincant. Dans ces deux tumeurs, la compréhension mécaniste de la façon dont la mutation entraîne la tumeur est claire et donc le terme mutation « pilote » est justifié. De même, l'expression de c-Kit sur les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) rend ces tumeurs sensibles à l'imatinib comme le sont les rares cas de mastocytose avec éosinophilie due à l'expression de PDGFRA ou à l'expression de c-Kit mutant [37-39]. Les mutations BRAF V600E dans le mélanome malin rendent les cellules sensibles au vémurafénib [40]. Le séquençage d'autres tumeurs rares a également conduit à la découverte de mutations pouvant être ciblées de manière significative [41]. Cependant, dans la majorité des cas, l'identification d'une mutation en soi n'implique pas qu'elle soit un moteur - même si cela s'est avéré être le cas dans une tumeur similaire et qu'elle est présente dans une fraction significative de l'échantillon. La clonalité doit être prouvée avec une certitude raisonnable s'il y a un espoir qu'une thérapie ciblée soit efficace. Le séquençage d'un seul échantillon et la déduction qu'une mutation est « actionnable » pose de nombreux problèmes, car l'échantillon de la tumeur séquencée peut ne pas être représentatif de l'ensemble de la tumeur, et en plus, l'échantillonnage doit également faire face aux problèmes de faux positifs et négatifs. , un bruit de fond élevé dû à la présence potentielle de cellules pas complètement malignes qui peuvent encore abriter des copies normales de gènes importants tels que TP53 [42] ainsi qu'une contamination par des tissus normaux. Il n'est donc pas surprenant qu'en dépit d'efforts importants, l'avantage pratique du séquençage NGS pour le patient individuel ait été limité à ce jour. Un exemple récent illustre ce cas : dans une série de 95 patients atteints de cancer vus au MD Anderson Cancer Center, le séquençage NGS a identifié au moins une mutation chez 92 % des patients. Les plus fréquents étaient dans TP53 (25 %) et KRAS (10 %). En principe, 36 % des tumeurs séquencées présentaient une mutation exploitable et 13 patients ont reçu un traitement basé sur ces données de séquençage pour cibler la mutation motrice présumée. Quatre patients ont eu une réponse partielle, six ont eu une maladie stable tandis que trois ont progressé [36]. Il est difficile de justifier l'approche clinique actuelle avec ces résultats. Prouver qu'une mutation est tronconique et donc clonale devrait conduire à une meilleure identification des mutations motrices et à un ciblage approprié de ces mutations est plus susceptible de donner des résultats significatifs. Il semble qu'une stratégie d'échantillonnage appropriée pour le séquençage multirégional d'une tumeur soit un élément clé du processus d'identification correcte des mutations véritablement clonales. Une telle liste qui est développée pour chaque patient unique séquencé sera probablement enrichie pour les mutations « pilotes ». Dans ce travail, nous discutons de la façon d'améliorer la stratégie déterminant cette liste de mutations clonales avec un haut niveau de certitude. L'introduction future du profilage tumoral multirégional dans la pratique clinique nécessite une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de l'hétérogénéité intratumorale et une approche plus standardisée de l'échantillonnage tumoral. Nous sommes toujours incapables d'orienter les processus biologiques au sein d'une tumeur pour affecter son hétérogénéité [43], mais nous pouvons optimiser la façon dont nous collectons et analysons les échantillons de tumeur.

Notre étude fournit des informations sur les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui influencent la probabilité de détecter des mutations véritablement clonales. Comme la construction de la phylogénie tumorale complète n'est pas nécessaire pour l'inférence de clonalité, nous nous sommes concentrés sur la reconstruction de la série d'événements de branchement provenant d'une population ancestrale. Nous avons développé un modèle mathématique pour le calcul de la probabilité d'identification correcte de mutations véritablement clonales à partir d'un échantillonnage multirégional de cancer avec un grand nombre de bifurcations. Dans ce processus, le plus grand sous-clone est le facteur le plus pertinent dans l'identification de mutations véritablement clonales. Sa proportion est une conséquence du temps écoulé depuis l'émergence du premier sous-clone. Plus la première mutation sous-clonale se produit tôt, plus nous sommes susceptibles de la classer à tort comme troncale. Une grande abondance de cette première mutation sous-clonale nécessite plus d'échantillons pour s'assurer qu'au moins un échantillon ne contient PAS cette mutation. De plus, si le premier sous-clone n'est présent que dans une faible proportion de la tumeur, il y a une faible probabilité qu'il soit classé à tort comme clonal. Nos résultats montrent qu'en considérant plusieurs événements de branchement, nous voyons maintenant que la probabilité de classer correctement les mutations est beaucoup plus grande qu'on ne le pensait auparavant [20].

Dans les néoplasmes solides, où les cellules se développent dans l'espace, nous avons montré que des échantillons plus grands sont plus susceptibles de surestimer la clonalité de certaines mutations si l'analyse inclut toutes les mutations présentes dans chaque échantillon. Il est nécessaire d'exclure de l'analyse les mutations présentes en basse et moyenne fréquence. Ce faisant, nous atteignons non seulement la même précision qu'avec un échantillonnage à cellule unique, mais nous l'augmentons même considérablement. Cependant, l'exclusion des mutations de fréquence inférieure de l'analyse peut entraîner une classification faussement négative de certaines mutations clonales dont les fréquences sont variables au sein d'un échantillon en raison d'une contamination par des tissus sains, d'une duplication de matériel génétique dans certaines cellules cancéreuses ou d'une erreur de séquençage. En présence d'autres mutations clonales détectées, une erreur faussement négative est moins préoccupante qu'un faux positif, car les faux positifs priveraient le patient d'un traitement efficace. La décision sur le seuil pour l'exclusion de la mutation doit être choisie individuellement en fonction du nombre de candidats à la mutation clonale disponibles.

Enfin, nous apportons une justification théorique de l'échantillonnage en motifs non aléatoires. Nous avons montré que le fait de placer les biopsies dans un motif à égale distance les unes des autres pourrait augmenter considérablement la probabilité de classer correctement les mutations véritablement clonales par rapport à l'échantillonnage aléatoire. Nous sommes conscients que nos simulations informatiques de la croissance tumorale sont simplifiées et manquent de nombreuses caractéristiques des systèmes vivants, telles que la migration cellulaire dans les tumeurs avec un schéma de croissance plus complexe. Là, une stratégie d'échantillonnage spatial différente pourrait être plus efficace. Nos résultats fournissent une justification aux pathologistes lors du prélèvement d'échantillons pour le séquençage de tumeurs multirégionales et aux cliniciens lors de l'échantillonnage endoscopique de néoplasmes, par ex. tube digestif. En choisissant des échantillons avec une propagation maximale dans le modèle suggéré, on maximise les chances de classer correctement les mutations clonales. Nous offrons également un moyen d'estimer un niveau de certitude pour une liste de mutations clonales détectées qui peut servir de guide aux oncologues dans leur choix de cible appropriée. Nos résultats fournissent quelques considérations pour l'amélioration de l'évaluation clinique des mutations ciblables dans les tumeurs naïves de traitement.


À l'ère des médicaments anticancéreux ciblés, identifier correctement les mutations dans une tumeur devient un élément essentiel de l'optimisation du traitement du cancer. Ce n'est pas nécessairement simple car les tumeurs peuvent contenir à la fois des mutations « pilotes », qui contrôlent la croissance tumorale et doivent donc être bloquées par des médicaments spécifiques, et des mutations « passagers », qui, comme leur nom l'indique, peuvent ne pas contribuer à la progression d'une tumeur. et sont peu susceptibles d'être des cibles thérapeutiques utiles. McGranahan et al. ont identifié des modèles d'évolution des événements moteurs dans une grande variété de types de tumeurs, révélant des modèles spécifiques de mutations qui seront importants dans la conception de futurs schémas thérapeutiques pour le cancer.

Il sera probablement nécessaire de déterminer si des mutations motrices exploitables sont trouvées dans l'ensemble ou un sous-ensemble des cellules tumorales pour améliorer le développement de médicaments et les stratégies de médecine de précision. Nous avons analysé neuf types de cancer pour déterminer les fréquences sous-clonales des événements moteurs, pour chronométrer les processus mutationnels au cours de l'évolution du cancer et pour identifier les moteurs des expansions sous-clonales. Bien que les mutations dans les gènes conducteurs connus se soient généralement produites au début de l'évolution du cancer, nous avons également identifié des mutations sous-clonales « actionnables » plus tard, y compris BRAF (V600E), IDH1 (R132H), PIK3CA (E545K), EGFR (L858R), et KRAS (G12D), ce qui peut compromettre l'efficacité des approches thérapeutiques ciblées. Plus de 20 % de IDH1 les mutations dans les glioblastomes et 15 % des mutations dans les gènes de l'axe de signalisation PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)–AKT–mTOR (cible mammifère de la rapamycine) dans tous les types de tumeurs étaient sous-clonales. Les mutations dans l'axe de signalisation RAS-MEK (protéine kinase kinase activée par un mitogene) étaient moins susceptibles d'être sous-clonales que les mutations dans les gènes associés à la signalisation PI3K-AKT-mTOR. L'analyse des mutations tardives a révélé un lien entre la mutagenèse médiée par APOBEC et l'acquisition de mutations inductrices sous-clonales et la découverte de gènes cancéreux putatifs impliqués dans les expansions sous-clonales, y compris CTNNA2 et ATXN1. Nos résultats fournissent un recensement pan-cancer des événements moteurs dans le contexte de l'hétérogénéité intratumorale et révèlent des modèles d'évolution tumorale à travers les cancers. La présence fréquente de mutations sous-clonales du conducteur suggère la nécessité de stratifier la réponse thérapeutique ciblée en fonction de la proportion de cellules tumorales dans lesquelles le conducteur est identifié.


Discussion

Bien que la NGS diagnostique ait gagné en importance dans les milieux cliniques pour l'évaluation des mutations somatiques dans le cancer, une standardisation insuffisante des paramètres de séquençage limite encore sa mise en œuvre dans la pratique clinique (1), principalement pour les variants présents à de faibles fréquences alléliques (4). Nous avons donc abordé la question technique de déterminer correctement la profondeur de séquençage dans le diagnostic NGS afin d'obtenir des détections fiables et reproductibles des variantes de faible VAF. En particulier, nous avons effectué des calculs théoriques pour déterminer la profondeur de couverture optimale pour la probabilité souhaitée de détection de variants à basses fréquences alléliques, en tenant compte du taux d'erreur de séquençage. De plus, nous avons confirmé ces calculs théoriques en réalisant des expériences de dilution. Sur la base de ces observations, nous recommandons une profondeur de couverture de 1650 ou plus (avec le seuil respectif d'au moins 30 lectures mutées) pour appeler des variantes 𢙓% afin d'obtenir une probabilité de détection de variante de 99,9%, en utilisant le séquençage NGS conventionnel erreur seulement. Les variantes de la plage 1𠄳% VAF ne peuvent être appelées que si les données de séquence obtenues sont de haute qualité (moyenne Q30 > 90%) et/ou lorsque les variantes sont confirmées par réplication ou la méthode orthogonale (1, 11, 16). Nous fournissons également un calculateur théorique simple et convivial (logiciel) pour aider les laboratoires à résoudre la profondeur de séquençage correcte et le nombre minimum correspondant de lectures de variantes tout en tenant compte du taux d'erreur de séquençage. Notre simple calculatrice peut aider à minimiser les résultats faux positifs et faux négatifs dans le diagnostic NGS.

Néanmoins, la profondeur de séquençage correcte est également influencée par des facteurs spécifiques au test (1). Des erreurs peuvent se produire à de nombreuses étapes lors du traitement de l'ADN et de la préparation de la bibliothèque. Les plus courantes sont les erreurs d'amplification introduites lors de la préparation de la bibliothèque NGS (1, 12, 17). D'autres sources courantes d'erreurs sont liées à la complexité de la bibliothèque (le nombre de molécules d'ADN indépendantes analysées), à la qualité de l'ADN et à la complexité de la région cible, etc. Toutes les erreurs potentielles spécifiques au test doivent être traitées par la conception du test, la validation de la méthode et le contrôle qualité.

Actuellement, des stratégies émergentes de correction d'erreurs, à la fois computationnelles et expérimentales, sont en cours de développement afin d'atténuer les taux d'erreur élevés dans les NGS de diagnostic (11). Jusqu'à présent, parmi les méthodes de correction d'erreurs les plus prometteuses figurent les UMI (Unique Molecular Identifiers), qui corrigent les erreurs de PCR (18), et les approches de correction signal/bruit (11). Ces avancées tentent de réduire le LOD, augmentant ainsi la précision du séquençage nécessaire pour les futures opportunités de diagnostic NGS.

Afin d'améliorer la normalisation dans le diagnostic NGS, l'estimation de la profondeur de couverture correcte est un point de départ recommandé lors de l'évaluation des seuils entourant un test NGS particulier. Néanmoins, il y a encore un manque d'orientations publiées concernant les exigences techniques minimales et leur rapport dans NGS, particulièrement important dans la détection des mutations clonales et sous-clonales dans le diagnostic du cancer. Cela est principalement dû à la large gamme d'approches de préparation de bibliothèques et à de nombreuses variables jouant un rôle dans chaque test NGS spécifique, qui sont difficiles à standardiser, ainsi qu'à la variabilité inter-laboratoires. Par conséquent, la définition d'exigences techniques minimales et leur rapport dans NGS est hautement souhaitable. Sur la base de notre expérience dans le diagnostic NGS en hémato-oncologie, nous suggérons de rapporter au moins les paramètres techniques suivants : LOD, erreur globale du test NGS (ou au moins taux d'erreur de séquençage), la quantité d'entrée d'ADN, la source et la qualité de l'ADN , la profondeur de couverture minimale et le pourcentage de bases ciblées séquencées à cette profondeur minimale, le nombre total de lectures cibles couvrant la région variante et le nombre de lectures prenant en charge la variante. Un accent particulier doit être mis sur la normalisation NGS des échantillons fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) (19, 20).

Dans l'ensemble, notre étude met en évidence l'importance d'une profondeur de séquençage correcte et du nombre minimum de lectures requises pour une détection fiable et reproductible des variantes à faible VAF dans le diagnostic NGS. Le calcul de la profondeur de séquençage correcte pour un taux d'erreur donné à l'aide de notre calculateur théorique (logiciel) convivial peut aider à minimiser les résultats faux positifs et faux négatifs dans le diagnostic NGS, dans des situations liées à des mutations sous-clonales, entre autres. Les tests rigoureux et les exigences minimales standardisées pour le diagnostic NGS sont particulièrement souhaitables pour garantir des résultats corrects en milieu clinique.


Diversité mutationnelle sous-clonale étonnamment élevée dans le cancer colorectal humain et son importance

Les cancers colorectaux humains (CRC) contiennent à la fois des mutations clonales et sous-clonales. Les mutations clonales sont sélectionnées positivement, présentes dans la plupart des cellules et entraînent une progression maligne. Les mutations sous-clonales sont dispersées de manière aléatoire dans tout le génome, elles fournissent un vaste réservoir de cellules mutantes qui peuvent se développer, repeupler la tumeur et entraîner l'émergence rapide d'une résistance, tout en étant un contributeur majeur à l'hétérogénéité tumorale. Ici, nous appliquons la méthodologie de séquençage duplex (DS) pour quantifier les mutations sous-clonales dans la tumeur CRC avec une profondeur sans précédent (10 4 ) et une précision (<10 -7). Nous avons mesuré les fréquences de mutation dans les gènes codant pour les ADN polymérases réplicatives et dans les gènes fréquemment mutés dans le CCR, et avons trouvé un taux de mutation efficace étonnamment élevé, 7,1 × 10 -7 . La courbe d'accumulation de mutations sous-clonales en fonction de la profondeur de séquençage, en utilisant l'ADN obtenu à partir de cinq tumeurs différentes, est en accord avec un modèle neutre d'évolution tumorale. Nous présentons une nouvelle approche théorique pour modéliser l'évolution neutre indépendamment de l'hypothèse des sites infinis (qui stipule qu'une mutation particulière n'apparaît que dans une cellule tumorale à un moment donné). Our analysis indicates that the infinite sites assumption is not applicable once the number of tumor cells exceeds the reciprocal of the mutation rate, a circumstance relevant to even the smallest clinically diagnosable tumor. Our methods allow accurate estimation of the total mutation burden in clinical cancers. Our results indicate that no DNA locus is wild type in every malignant cell within a tumor at the time of diagnosis (probability of all cells wild type = 10 −308 ).

Significance Statement Cancers evolve many mutations. Clonal mutations are selected early. Subsequent evolution occurs in a branching fashion, possibly without selection (“neutral evolution”). Rarer mutations occur later on smaller branches of the evolutionary tree. Using a DNA sequencing method, duplex sequencing, with unprecedented accuracy and sensitivity, we quantified very rare unique subclonal mutations in diagnostic specimens from five human colorectal cancers. Rarer subclones probe later evolutionary timepoints than previously possible. We confirm neutral evolution at later times and find many more subclonal mutations than expected. A novel theoretical method allowed us to extrapolate further forward in time to diagnosis. At diagnosis, every base in DNA is mutated in at least one cancer cell. In particular any therapy resistance mutation would be present.


Voir la vidéo: On elämä ennen syöpää ja syövän jälkeen. Entiseen ei ole paluuta - Kultanauha 2019 (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Gaile

    But is there another way out?

  2. Leane

    tête haute

  3. Gaarwine

    Vous commettez une erreur. Discutons. Écrivez-moi en MP, on en parlera.

  4. Seamus

    Merci beaucoup, juste quelque chose avec des commentaires sur le blog, j'ai réussi à écrire la troisième fois (

  5. Rourke

    Je suis désolé, cela ne m'approche pas absolument. Qui d'autre, qu'est-ce qui peut inciter?

  6. Mijin

    Bien sûr, je m'excuse pour l'Offtopic. TS, votre ressource n'est pas dans le blogun? Si vous y êtes, alors j'essaierai de vous y chercher. J'ai aimé le site. Si dans le sujet, alors vous me comprenez.



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