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Adsorption de surface de verre de fibronectine

Adsorption de surface de verre de fibronectine


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Court résumé

J'ai des surfaces en verre et je veux y adsorber des protéines. Je n'ai aucun problème lorsque j'adsorbe pour la première fois la fibronectine (humaine) sur certaines zones et ensuite sur toute autre protéine. La seconde protéine ne s'adsorbera que sur les zones "libres" restantes.

Mais dès que j'applique de la fibronectine en second lieu, elle s'adsorbe partout. Et je veux éviter ça.

Protocole plus détaillé

(impression par microcontact direct) :

  1. Incuber un tampon pdms avec Protein-Solution #1 pendant un certain temps et une certaine concentration
  2. Tampon pdms sec et appuyez sur la lamelle pendant un certain temps
  3. Retirez le tampon et mettez une goutte de Protein-Solution #2 pendant un certain temps et concentrez-vous sur la lamelle

J'ai déjà varié les concentrations et les temps sans succès notable. J'ai également essayé d'ajouter du BSA à la fibronectine - également sans succès. Toutes les solutions sont dans PBS.

D'autres étapes que je prévois :

  1. Variation du pH autour du point isoélectrique de la protéine (Fibronectine : environ 5,2)
  2. Ajout de détergents à fn-solution (par exemple, Tween)
  3. Variation de la teneur en sel dans le tampon de protéine fn

Ma question

Je me demande quelle est la raison exacte du caractère collant de la fibronectine et quel paramètre est le meilleur à faire varier ? Ai-je oublié quelque chose? La fibronectine colle-t-elle aux autres protéines ou plutôt aux « zones libres » de la surface ?

Remarque : les techniques de modification de surface (par exemple, l'utilisation d'époxy) ne sont pas une option.

Je ne sais pas si ce sujet convient mieux à la communauté de la chimie. N'hésitez pas à vous déplacer.


Quelle est la raison exacte du caractère collant de la fibronectine ?

La fibronectine interagit avec divers substrats ce qui reflète sa non-spécificité et son interaction avec des substrats hydrophobes suggère mieux que l'adsorption dépend des interactions hydrophobes.

La fibronectine colle-t-elle aux autres protéines ou plutôt aux « zones libres » de la surface ?

Il peut coller aux deux comme vous pouvez le voir sur le tableau. Cependant, sa liaison aux matériaux hydrophobes comme le polystyrène et le PVC est la plus efficace.

quel paramètre est le meilleur à faire varier?

Notez qu'il y aura beaucoup de régions libres dans le substrat. Vous ne pouvez pas bloquer tous les sites à moins d'utiliser une concentration élevée de fibronectine. Le meilleur paramètre à faire varier serait donc la concentration de fibronectine. Vous pouvez également utiliser des mélanges fibronectine-BSA car leur liaison mutuelle n'est pas très bonne (une méthode par étapes serait néanmoins préférable). Vous pouvez également faire varier le temps d'adsorption (voir la figure ci-dessous) mais ce n'est pas aussi facilement contrôlable que la concentration. Étant donné que la fibronectine ne se lie pas à la gélose, vous pouvez également bloquer certains sites sur votre lamelle en utilisant de la gélose fondue (ou de l'agarose).


Référence:

Klebe, Robert J., Kevin L. Bentley et Robert C. Schoen. "Substrats adhésifs pour la fibronectine." Journal de physiologie cellulaire 109.3 (1981): 481-488.


Distribution conformationnelle des molécules de fibronectine adsorbées en surface explorée par microscopie de localisation de molécule unique†

E. Klotzsch ab , I. Schoen a , J. Ries c , A. Renn d , V. Sandoghdar e et V. Vogel * a
a Laboratoire de mécanobiologie appliquée, Département des sciences et technologies de la santé, ETH Zurich, Zurich, Suisse. Courriel : [email protected]
b Institut de physique appliquée, Université de technologie de Vienne, Vienne, Autriche
c EMBL, Heidelberg, Allemagne
d Laboratoire de chimie physique, ETH Zurich, Suisse
e Max Planck Institute for the Science of Light, Erlangen, Allemagne

Publié pour la première fois le 5 février 2014

Les protéines adsorbées qui favorisent l'adhésion cellulaire interviennent dans la réponse des cellules aux biomatériaux et aux échafaudages. Comme les protéines subissent des changements de conformation lors de l'adsorption en surface, leur affichage fonctionnel peut être considérablement affecté par la chimie de surface ou les conditions de la solution au cours du processus d'adsorption. Une technique de microscopie de localisation à haute résolution est étendue ici pour sonder la conformation des molécules individuelles de fibronectine (Fn) à l'interface verre-eau dans des conditions de tampon physiologique. Pour cartographier les distances, quatre cystéines disponibles situées sur les modules FnIII7 et FnIII15 de Fn dimères ont été spécifiquement marqués avec Cy3B, et leurs positions relatives ont été déterminées par photoblanchiment par étapes avec une précision nanométrique. Les quatre marqueurs sur des molécules de Fn uniques n'ont pas montré d'arrangement uniforme ou linéaire. Les distances entre les positions des étiquettes étaient distribuées de manière asymétrique autour de 33 nm avec une queue vers des distances plus élevées. L'exposition de Fn à des conditions de solution dénaturante pendant l'adsorption a augmenté les distances moyennes jusqu'à 43 nm pour le guanidinium HCl 4 M, tandis que la modification des conditions de solution après l'adsorption n'a eu aucun effet, indiquant que les distances intramoléculaires observées sont bloquées pendant l'adsorption. traiter. De plus, des revêtements de surface d'hydrophobie différente ont modifié la distribution conformationnelle, déplaçant les distances des marqueurs d'une médiane de 24 nm sur les surfaces hydrophiles à 49 nm sur les surfaces hydrophobes. Ces résultats soulignent en outre que la conformation des macromolécules aux interfaces dépend de l'histoire de l'adsorption. Bien qu'illustré ici pour la surface Fn adsorbée, la puissance de la microscopie basée sur la localisation étend le répertoire des techniques pour caractériser les biomolécules aux interfaces.


Les références

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Études de fluorescence à molécule unique de la fibronectine adsorbée en surface

La conformation de la protéine de la matrice extracellulaire, la fibronectine, joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire, y compris l'adhésion et la migration cellulaires. Alors que les conformations moyennes de grands ensembles de protéines d'adhésion ont été précédemment mesurées, les cellules peuvent répondre de manière sensible aux valeurs aberrantes de conformation. Nous avons donc appliqué à la fois des techniques d'imagerie moléculaire et de spectroscopie pour cartographier une gamme d'états conformationnels de molécules individuelles de fibronectine adsorbées sur du verre, ainsi que pour mesurer leurs fluctuations conformationnelles dans le temps. Des expériences de photoblanchiment en une seule étape ont confirmé la sensibilité d'une seule molécule. Les spectres d'une seule molécule ont montré des fluctuations dans la longueur d'onde maximale, à la fois sur un ensemble spatial de molécules et dans une seule molécule au fil du temps, indiquant très probablement les différents états de conformation que la fibronectine peut prendre lors de l'adsorption en surface. Le transfert d'énergie par résonance de fluorescence à paire unique (FRET) a révélé qu'une fraction des molécules de fibronectine existait dans des conformations permettant le transfert d'énergie entre les résidus de cystéine marqués des deux bras dimères repliés l'un sur l'autre, et que des fluctuations se sont produites dans l'efficacité du FRET. Les expériences de polarisation de fluorescence ont identifié deux sources possibles de fluctuations de FRET : les changements d'orientation des fluorophores et les fluctuations de conformation de la fibronectine sur une échelle de temps de quelques secondes.


Adsorption de surface de verre de fibronectine - Biologie

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Résumé

L'adsorption des protéines sur les matériaux synthétiques influence l'adhésion cellulaire et les événements de signalisation qui dirigent la fonction cellulaire dans de nombreuses applications biomédicales. L'adsorption de la fibronectine (FN) sur différentes surfaces modifie la structure des protéines et module α5??1 liaison à l'intégrine, adhésion cellulaire, propagation cellulaire et migration cellulaire. Dans la présente étude, des monocouches auto-assemblées d'alcanethiols sur Au ont été utilisées pour analyser les effets de la chimie de surface (CH3, OH, NH2, et COOH) sur l'adsorption d'un fragment recombinant de FN, FNIII7-10, qui incorpore à la fois la synergie et les motifs de liaison cellulaire RGD. Chimie de surface différentielle potentialisée FNIII7-10 cinétique d'adsorption et structure adsorbée déterminées par spectroscopie de résonance plasmonique de surface et dosages de liaison d'anticorps. FNIII7-10 l'activité fonctionnelle, déterminée par la force d'adhésion cellulaire, a été modulée d'une manière cohérente avec ces changements structurels (OH = NH2 > COOH > CH3). Cependant, ces changements dans les paramètres protéiques n'étaient pas simplement corrélés à des différences d'hydrophobie de surface, ce qui indique que des paramètres de surface supplémentaires influencent l'adsorption des protéines. Ces résultats démontrent que la chimie de surface module la structure et l'activité des protéines adsorbées et établit une relation entre les changements dépendant de la surface dans les domaines structuraux de FNIII7-10 et l'activité fonctionnelle.

Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology.

Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology.

Département de bio-ingénierie, Clemson University.

Coulter School of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology.

École de génie chimique, Georgia Institute of Technology.

Auteur correspondant. Adresse : Woodruff School of Mechanical Engineering, 315 Ferst Drive, Room 2314 IBB, Atlanta, GA 30332-0363. Courriel : [email protected] Téléphone : 404-894-9384. Télécopieur : 404-385-1397.


Effets de la chimie de surface du polystyrène sur l'activité biologique de la fibronectine et de la vitronectine en phase solide, analysés avec des anticorps monoclonaux

PENNSYLVANIE. Underwood, J.G. Steele, B.A. Dalton Effets de la chimie de surface du polystyrène sur l'activité biologique de la fibronectine et de la vitronectine en phase solide, analysés avec des anticorps monoclonaux. J Cell Sci 1er mars 1993 104 (3) : 793-803. doi : https://doi.org/10.1242/jcs.104.3.793

La conformation et les activités biologiques de la fibronectine (FN) et de la vitronectine (VN) enduites sur différentes surfaces plastiques ont été étudiées à l'aide de l'adhésion cellulaire et d'un panel d'anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques au domaine. L'adhérence des fibroblastes BHK était nettement meilleure sur FN enduit sur polystyrène de culture tissulaire hydrophile (TCPS) que sur polystyrène hydrophobe non traité (PS). Les mAb A17 et 3E3, qui inhibent la liaison des cellules BHK à la séquence contenant RGD dans la région de liaison cellulaire de FN, se sont également liés préférentiellement à FN sur TCPS. En revanche, deux mAb anti-FN, qui n'ont aucun effet sur l'adhésion cellulaire (A35 et A3), se sont liés préférentiellement à la conformation de FN sur le PS plus hydrophobe. Les cellules de mélanome de souris utilisent un site de liaison cellulaire supplémentaire dans le domaine Hep II de la FN et leur préférence pour la FN enrobée sur TCPS était moins marquée que celle des cellules BHK. Cette préférence réduite a de nouveau été imitée par la liaison d'un mAb, A32, qui inhibe la liaison des cellules B16 au domaine Hep II de FN. En revanche, l'adhésion des cellules BHK à VN n'a pas montré de préférence pour TCPS par rapport à PS. L'activité de liaison cellulaire du VN adsorbé correspondait à la liaison d'un mAb inhibiteur d'adhésion cellulaire, A18, qui, contrairement aux mAb A17 et A32, présentait une liaison légèrement accrue au VN revêtu de PS, plutôt que TCPS. Lorsque l'effet dénaturant du revêtement de FN et VN sur PS en présence d'urée a été étudié, des corrélations similaires entre l'adhésion des cellules BHK et la liaison des mAb inhibiteurs ont été observées. Le traitement à l'urée de FN a significativement réduit à la fois l'adhésion cellulaire BHK et la liaison des deux mAb inhibiteurs d'adhésion cellulaire, tandis que la liaison de A35 et A3 n'était pas affectée. Il n'y avait pas d'effet significatif du traitement à l'urée de VN sur l'adhésion des cellules BHK ou la liaison à l'Acm. Un plus grand panel d'Acm anti-FN a été utilisé, avec les Acm anti-VN, pour déterminer s'il y avait des différences dans la reconnaissance des Acm de FN et de VN adsorbés sur trois marques différentes de TCPS. Les mAb se sont séparés en quatre modèles de réactivité, dont A17, A32, A35 et A18 respectivement étaient représentatifs. Des différences significatives ont été observées dans la reconnaissance des mAb de FN et VN adsorbés sur différentes marques de TCPS. Ceux-ci peuvent refléter des différences dans la capacité de ces surfaces à soutenir une croissance optimale de différents types de cellules. L'effet des cations divalents sur les FN et VN adsorbés a également été étudié. (RÉSUMÉ TRONQUÉ À 400 MOTS)


Résultats

Ficoll augmente l'assemblage des fibres de fibronectine et de collagène I dans les 16 premières heures et elles sont colocalisées

Fig. 1 La supplémentation en Ficoll accélère l'assemblage de l'ECM dans les 16 premières heures et la fibronectine et le collagène I sont colocalisés. (A) ECM assemblé sans Ficoll. La première rangée montre une image de fluorescence à grand champ des fibroblastes et de la matrice, suivie d'images de fibronectine marquée à l'Alexa-647 et de collagène I coloré à l'anticorps seul. La deuxième rangée montre une zone agrandie de l'image ci-dessus, suivie d'une image de matrice uniquement et de balayages linéaires d'intensité de la fibronectine et du collagène I le long de la ligne blanche indiquée dans l'image de la matrice uniquement à gauche. (B) ECM assemblé avec le mélange Ficoll (37,5 mg mL −1 70 kDa Ficoll + 25 mg mL −1 400 kDa). (C) Densité cellulaire. (D) Intensité totale de la fibronectine marquée par Alexa-647. (E) Intensité additionnée du collagène I coloré aux anticorps. (F) Zone de substrat recouverte de fibres de fibronectine telle que quantifiée à l'aide d'un seuil défini pour distinguer les fibres de l'arrière-plan et du revêtement.30 à 100 images ont été analysées pour chaque condition (10 pour la fibronectine totale en condition -Ficoll). D–F montrent les valeurs normalisées à la moyenne sans Ficoll. Substrats en verre préadsorbés avec 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée Alexa-647). Cellules cultivées dans MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine, 100 M de L-acide ascorbique 2-phosphate et 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée Alexa-647). **indique p < 0,01, ****indique p < 0,0001. Des images respectives en niveaux de gris de chaque canal peuvent être trouvées dans ESI Fig. 1.† ESI Movie 2† montre des images alternées de fibronectine et de collagène I pour apprécier leur corrélation spatiale. La quantification de la matrice de fibronectine par coloration d'anticorps peut être trouvée dans ESI Fig. 4.†

Les fibres de collagène I continuent pour la plupart à se colocaliser avec les fibres de fibronectine après 2 jours d'exposition au Ficoll

2 Le traitement au Ficoll continue d'accélérer l'assemblage des fibres de fibronectine et de collagène I pendant 2 jours et elles sont encore majoritairement colocalisées. (A) ECM assemblé sans Ficoll. La première rangée montre une image de fluorescence à grand champ des fibroblastes et de la matrice, suivie d'images de fibronectine marquée à l'Alexa-647 et de collagène I coloré à l'anticorps seul. La deuxième rangée montre une zone agrandie de l'image ci-dessus, suivie d'une image de matrice uniquement et de balayages linéaires d'intensité de la fibronectine et du collagène I le long de la ligne blanche indiquée dans l'image de la matrice uniquement à gauche. (B) ECM assemblé avec Ficoll. (C) Densité cellulaire. (D) Intensité totale de la fibronectine marquée par Alexa-647. (E) Intensité additionnée du collagène I coloré aux anticorps. (F) Zone de substrat recouverte de fibres de fibronectine telle que quantifiée à l'aide d'un seuil défini pour distinguer les fibres de l'arrière-plan et du revêtement. 50 à 120 images ont été analysées pour chaque condition. D–F montrent les valeurs normalisées à la moyenne sans Ficoll. Substrats en verre préadsorbés avec 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée Alexa-647). Cellules cultivées dans MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine, 100 M L -acide ascorbique 2-phosphate et 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée Alexa-647). ***indique p < 0,001, ****indique p < 0,0001. Des images respectives en niveaux de gris de chaque canal peuvent être trouvées dans ESI Fig. 2.† ESI Movie 3† montre des images alternées de fibronectine et de collagène I pour apprécier leur corrélation spatiale. La quantification de la matrice de fibronectine par coloration d'anticorps peut être trouvée dans ESI Fig. 4.†

Un ECM dense a été assemblé en 6 jours avec et sans Ficoll

3 Assemblage ECM après 6 jours avec et sans Ficoll. (A) ECM assemblé sans Ficoll. La première rangée montre une image de fluorescence à grand champ des fibroblastes et de la matrice, suivie d'images de fibronectine marquée à l'Alexa-647 et de collagène I coloré à l'anticorps seul. La deuxième rangée montre une zone agrandie de l'image ci-dessus : premières cellules et matrice, suivies d'images de fibronectine et de collagène I seuls. (B) ECM assemblé avec Ficoll. (C) Densité cellulaire. (D) Intensité totale de la fibronectine marquée par Alexa-647. (E) Intensité additionnée du collagène I coloré aux anticorps. 70 à 150 images ont été analysées pour chaque condition (30 images analysées pour la densité cellulaire). D et E montrent des valeurs normalisées à la moyenne sans Ficoll. Substrats en verre préadsorbés avec 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée Alexa-647). Cellules cultivées dans MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine, 100 M L-acide ascorbique 2-phosphate et 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée Alexa-647). ****indique p < 0,0001. Des images respectives en niveaux de gris de chaque canal peuvent être trouvées dans ESI Fig. 3.† ESI Movie 4† montre une pile z de matrices de 6 jours produites avec et sans Ficoll pour apprécier la corrélation spatiale de la fibronectine et du collagène I. Quantification de la matrice de fibronectine par coloration d'anticorps peut être trouvé dans ESI Fig. 4.†

L'augmentation de l'assemblage des fibres de fibronectine n'est pas attribuable à des changements dans certaines fonctions des fibroblastes

4 Le Ficoll n'a pas d'effet majeur sur les fonctions mécaniques des cellules vitales. Les niveaux de protéines ont été évalués au niveau cellulaire unique par microscopie à immunofluorescence après 24 heures de traitement Ficoll par rapport au témoin. (A) Zone cellulaire. (B) Intensité additionnée de la kinase d'adhésion focale phosphorylée par cellule. (C) Intensité totale de la chaîne légère de myosine phosphorylée 2 par cellule. (D) Intensité additionnée de l'actine filamenteuse par cellule. (E) Pourcentage du champ de vision de l'image avec revêtement de fibronectine retiré, divisé par le nombre de cellules dans l'image. Environ 20 images analysées par condition. (F) Ratio d'intensité moyenne de la lamine A à la lamine B. (G) Ratio d'intensité moyenne de la protéine associée oui dans le noyau au cytoplasme. (H) Rapport d'intensité moyenne du facteur de transcription A lié à la myocardine dans le noyau par rapport au cytoplasme. (I) Intensité additionnée de l'acétylation de l'histone 3 à la lysine 9 dans le noyau. (J) Intensité additionnée de la triméthylation de l'histone 3 à la lysine 27 dans le noyau. Pour A–D et F–J, chaque point de données représente une cellule. Au moins 100 cellules individuelles ont été analysées par condition. Toutes les valeurs, à l'exception des ratios, ont été normalisées à la moyenne sans Ficoll. Substrats en verre préadsorbés avec 50 g mL −1 fibronectine plasmatique non marquée. Cellules cultivées dans du MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine et 100 M de L-acide ascorbique 2-phosphate, mais pas de fibronectine plasmatique supplémentaire (à part celle dans le sérum).

Ficoll augmente la quantité de fibronectine à la surface du verre où elle est facilement accessible pour l'assemblage de fibres à médiation cellulaire

5 Ficoll augmente l'adsorption de la fibronectine à la surface du verre pendant la culture cellulaire. (A) Images d'immunofluorescence à champ large de fibronectine colorée par anticorps après 2 jours de culture avec et sans Ficoll, avec des encarts ci-dessous montrant les zones non perturbées de revêtement de fibronectine (pas de fibroblastes ou de fibres ECM) qui ont été analysées. (B) Intensité de la fibronectine additionnée divisée par zone. Substrats en verre préadsorbés avec 50 g mL −1 fibronectine plasmatique non marquée. Cellules cultivées dans du MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine et 100 M de L-acide ascorbique 2-phosphate, mais pas de fibronectine plasmatique supplémentaire (à part celle dans le sérum). Voir ESI Fig. 5† pour les résultats avec la fibronectine plasmatique supplémentée au milieu. ****indique p < 0,0001.

Avec l'augmentation de la matrice de fibronectine induite par Ficoll, il y a plus de fibronectine non étirée pour agir comme modèle pour l'assemblage du collagène I

Figure 6 Ficoll augmente le nombre de sites de nucléation qui peuvent induire la polymérisation du collagène I évaluée par fibronectine-FRET, même si la distribution des souches de fibronectine n'est pas significativement altérée. (A) Images confocales des ratios fibronectine-FRET à la surface du verre (où les premières fibres de la matrice sont assemblées) après 2 jours de culture sans et avec Ficoll. (B) Histogrammes représentatifs du rapport FRET compilés à partir de 21 images pour chaque condition : 7 images chacune à partir de 3 échantillons différents. Les lignes verticales en pointillés représentent les rapports FRET moyens dans 4 M de GdnHCl (à gauche) et dans 1 M de GdnHCl (à droite) – voir ESI Fig. 6† pour la courbe d'étalonnage. (C) Nombre de pixels avec un rapport FRET supérieur à celui de la fibronectine dans 1 M GdnHCl. Chaque point représente une seule mesure d'une image. Substrats en verre préadsorbés avec 50 g mL −1 fibronectine plasmatique non marquée. Cellules cultivées dans MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine, 100 M L-acide ascorbique 2-phosphate et 50 g mL −1 fibronectine plasmatique (10 % marquée FRET). **indique p < 0,01.

La réticulation de la fibronectine adsorbée au substrat inhibe l'assemblage de la matrice accélérée par Ficoll

7 Ficoll n'augmente pas l'assemblage des fibres de collagène I lorsque le revêtement de fibronectine préadsorbé est réticulé au substrat avant l'ensemencement cellulaire. (A) Images d'immunofluorescence à champ large de matrice assemblées sur revêtement de fibronectine réticulé (50 g mL −1 , non marqué) après 2 jours de culture. La première image est celle des fibroblastes et de la matrice, suivie d'images agrandies de la fibronectine et du collagène I seuls. Les zones sombres dans le canal de la fibronectine sont des ombres cellulaires et non un revêtement récolté - voir ESI Fig. 7† pour confirmation. (B) Intensité totale du collagène I, normalisée à la moyenne sans Ficoll. (C et D) Idem pour le revêtement de fibronectine adsorbée (50 μg mL −1 , sans étiquette). Cellules cultivées dans du MEM Alpha supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine et 100 M de phosphate d'acide ascorbique 2 L, mais pas de fibronectine plasmatique supplémentaire (à part celle dans le sérum). ****indique p < 0,0001. ESI Movie 1† montre comment les cellules sont capables de récolter un revêtement de fibronectine adsorbé, qui est inhibé par la réticulation de la fibronectine au verre.

La préadsorption de la fibronectine sur le substrat de verre accélère encore l'assemblage de la matrice dans des conditions de surpeuplement

8 La supplémentation en fibronectine sous forme de revêtement adsorbé améliore l'assemblage de la matrice en présence de Ficoll après 2 jours. (A–C) Production de tissus en présence de Ficoll sur du verre non revêtu par rapport au verre revêtu de 50 g mL −1 fibronectine plasmatique humaine adsorbée (non marquée). (A) Densité cellulaire. (B) Intensité totale de la fibronectine colorée par anticorps. (C) L'intensité additionnée du collagène I. B et C est normalisée à la valeur moyenne sur du verre non revêtu. (D–F) Impact supplémentaire de l'ajout de 50 μg mL −1 fibronectine plasmatique humaine soluble (non marquée) lorsqu'il y a déjà un revêtement de fibronectine adsorbé. Cellules cultivées dans du MEM Alpha additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, de 1 % de pénicilline-streptomycine et de 100 M de L-acide ascorbique 2 phosphate. ****indique p < 0,0001.

Une revue de l'adsorption des protéines sur les biocéramiques

La biocéramique, en raison de ses excellentes propriétés biocompatibles et mécaniques, a toujours été considérée comme le matériau le plus prometteur pour la réparation des tissus durs. Il est bien connu qu'une réponse cellulaire appropriée aux surfaces biocéramiques est essentielle pour la régénération et l'intégration des tissus. Comme le in vivo implants, les biocéramiques implantées sont immédiatement recouvertes de protéines provenant du sang et des fluides corporels, et c'est à travers cette couche enduite que les cellules détectent et réagissent aux implants étrangers. Par conséquent, l'adsorption des protéines est critique dans la séquence des activités biologiques. Cependant, les mécanismes biologiques des interactions des biocéramiques et des protéines sont encore mal compris. Dans cette revue, nous récapitulerons les études récentes sur les interactions biocéramique-protéine.

1. Introduction

Le mot céramique a été développé il y a longtemps, on dit qu'il vient d'un mot grec pour la poterie [1]. Une céramique traditionnelle est un solide inorganique préparé généralement par chauffage et refroidissement ultérieur. Les céramiques peuvent être cristallines, partiellement cristallines ou amorphes [2]. Parce que les céramiques les plus courantes sont cristallines [3], la définition de la céramique traditionnelle fait souvent référence à des matériaux cristallins inorganiques, par opposition au verre [4-6]. Avec le développement rapide des sciences interdisciplinaires, y compris les matériaux, la médecine et l'écologie, la biocéramique a également émergé et s'est développée rapidement [7,8], et la définition de la biocéramique va bien au-delà de la céramique traditionnelle. En tant que résultat multidisciplinaire, les produits relatifs de la biocéramique ont atteint un stade florissant [9,10].

Les biocéramiques suscitent un grand intérêt en raison de leur excellente biocompatibilité [11,12]. Au cours des dernières décennies, un grand nombre de biocéramiques ont été développées et appliquées [13,14], telles que les céramiques à base de phosphate de calcium (Ca-P), l'oxyde de titane, l'alumine, la zircone, le bioverre, etc. Parmi ces biocéramiques, le Ca- ceux basés sur P, par exemple l'hydroxyapatite (HA), le phosphate tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) sont les plus étudiés [15-17]. En raison de composants chimiques similaires, ces céramiques ont une excellente biocompatibilité et bioactivité [18,19]. Cependant, les applications médicales des céramiques à base de Ca-P sont limitées aux petits implants, grains et revêtements de remplissage en raison de leurs faibles propriétés mécaniques [20]. Le titane, l'alumine et la zircone sont les céramiques à base de métaux inorganiques les plus utilisées [21,22]. Ces biocéramiques à base de métal présentent une résistance mécanique élevée, une excellente résistance à la corrosion et à l'usure et une bonne biocompatibilité [10,23]. Ils sont donc fréquemment utilisés dans les sites à forte charge comme l'implant pygal, dentaire et sous-maxillaire.

Pour fabriquer la biocéramique, les propriétés chimiques, physiques et mécaniques de ces matériaux ont été largement étudiées dans des recherches antérieures [24-27]. L'ostéoinductivité et la régénération osseuse des biocéramiques étant bien connues et prouvées [28,29], les recherches se concentrent davantage sur la compréhension des mécanismes de la bioactivité [30-33]. Les travaux en cours portent principalement sur deux aspects. L'un se concentre sur l'étude des événements biologiques qui se produisent in vivo entre la biocéramique et les tissus vivants [34–38]. L'autre tente de révéler les mécanismes de formation des couches d'apatite ou le processus de régénération sur les biocéramiques implantées [18,39]. Cependant, les deux travaux sont étroitement liés à l'adsorption des protéines sur la surface biocéramique.

L'adsorption des protéines est une propriété unique des biocéramiques [11,40]. Lorsque des biocéramiques sont implantées dans un corps vivant, les protéines des fluides corporels environnants seront spontanément adsorbées sur leurs surfaces, puis l'attachement, la prolifération et la migration cellulaire se produisent [41-43]. Ainsi, le comportement d'adsorption des protéines joue un rôle vital lors de la régénération du tissu osseux [44,45].

Dans cet article, nous nous concentrons principalement sur l'adsorption des protéines des biocéramiques, en particulier nous divisons les biocéramiques en deux classes : les céramiques Ca-P et non-Ca-P. Étant donné que les éléments chimiques des céramiques Ca-P sont similaires à ceux des os naturels, le Ca-P en tant que matériaux de substitution osseuse présente une excellente biocompatibilité, bioactivité et ostéoconductivité. Cependant, leurs applications sont limitées à de petits implants non porteurs, à grains ou comme revêtements de métaux en raison de leurs mauvaises propriétés mécaniques. Une autre catégorie est généralement classée en non-Ca-P, comme l'oxyde de titane, l'alumine, la zircone, etc. Ces céramiques sont traditionnelles et ont été largement utilisées dans la réparation des tissus durs. Le phénomène d'adsorption de protéines a attiré beaucoup d'attention dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. Cependant, les caractéristiques d'adsorption des protéines de différents biomatériaux et les mécanismes sur l'effet de l'efficacité d'adsorption doivent être clarifiés davantage. Une connaissance approfondie de l'adsorption des protéines est non seulement bénéfique pour l'optimisation de la structure de surface des biomatériaux, mais également utile pour développer des applications spécifiques dans le domaine de la biomédecine.

2. Évolution de la biocéramique dans l'ingénierie des tissus durs

Pour passer en revue le développement de la biocéramique [22,46–48], on peut généralement la classer en trois étapes. La figure 1 montre le schéma de l'évolution des biocéramiques. La première génération est appelée céramique inerte, qui visait à se substituer à l'os naturel. Par exemple, la zircone [49–52], le titane [53–55] et l'alumine [56–58] sont principalement utilisés dans la fabrication de têtes fémorales pour remplacer les os endommagés [59]. Bien que ces céramiques soient biocompatibles, le corps vivant réagit généralement contre les implants car ils sont étrangers, et ces implants eux-mêmes sont susceptibles de ne jamais se transformer en os. La deuxième génération est appelée céramique bioactive, qui visait à imiter certaines fonctions liées à la biominéralisation. Les céramiques bioactives ont donné des résultats prometteurs dans les années 1970. Ces céramiques peuvent réagir avec les fluides physiologiques et former une apatite de type biologique. En présence de cellules vivantes, cette apatite peut former un nouvel os. L'HA et certains autres composites Ca-P sont des céramiques bioactives typiques [60–62]. Ces biocéramiques présentent d'excellentes propriétés de biocompatibilité, mais les applications médicales sont limitées aux petites charges [63,64], aux grains et aux revêtements [65-68] en raison de leurs mauvaises propriétés mécaniques. La troisième génération de biocéramiques visait à fournir un système d'échafaudage adéquat pouvant aider à la régénération des tissus vivants [69]. En optimisant les biomatériaux et en contrôlant l'interface implant-tissu, le système d'implant sophistiqué peut induire la régénération des tissus et aider à les récupérer. Certaines céramiques Ca-P rapportées présentent une ostéoinductivité et sont considérées comme ayant une certaine capacité de régénération osseuse. Le but final de l'ingénierie tissulaire tente de développer des matériaux artificiels capables de remplacer la fonction des tissus biologiques dans des situations où le corps vivant est endommagé et ne peut pas fonctionner par lui-même [70]. Les biocéramiques idéales [69,71] ont non seulement besoin de la capacité de récupérer ou de régénérer les tissus endommagés, mais aussi de demander à remplir leurs fonctions naturelles.

Figure 1. Schéma de l'évolution de la biocéramique.

3. Adsorption de protéines sur céramique Ca-P

En tant que principale composition inorganique des tissus durs d'un corps, les biocéramiques Ca-P ont une excellente bioactivité et une bonne capacité d'ostéoconduction ou d'ostéoinduction [8,72-79], et ont été largement adoptées dans la réparation osseuse ou les applications orthopédiques. Le tableau 1 répertorie la plupart des composés Ca-P et leur rapport molaire calcium/phosphore (rapport Ca/P) et leur stabilité [78]. Il est bien connu que l'adsorption des protéines joue un rôle important dans la détermination des propriétés biologiques du Ca-P. De nombreuses études sur les comportements d'adsorption des protéines ont été réalisées afin de mieux comprendre le mécanisme d'adsorption des protéines et les raisons pour lesquelles les biocéramiques Ca-P ont d'excellentes propriétés biologiques. Les résultats et les conclusions ont considérablement élargi nos connaissances sur la bioactivité et l'ostéoinductivité.

Tableau 1. Les biocéramiques Ca-P [78].

Ces dernières années, les méthodologies biologiques, physico-chimiques et leur combinaison ont été largement adoptées dans la recherche sur l'adsorption des protéines sur les matériaux. Avec le développement rapide de la technologie informatique, la méthode de simulation a été de plus en plus appliquée dans ce domaine et nous a fourni de nombreuses informations sur l'adsorption au niveau atomique. De nombreuses facettes de l'adsorption des protéines ont attiré beaucoup d'attention. Par exemple, l'effet de différentes propriétés des matériaux sur le comportement d'adsorption, telles que les composants chimiques et les propriétés de surface l'effet de différentes propriétés et environnements de protéines sur le comportement d'adsorption, tels que le pH d'une solution de protéines, l'acidité/basicité ou la charge électrique de protéines et le changement de conformation des protéines lors de l'adsorption sur la surface. Dee et al. [80] ont montré les principales propriétés des protéines et des surfaces qui affectent l'adsorption dans les tableaux 2 et 3.

Tableau 2. Propriétés des protéines qui affectent l'adsorption des protéines [80].

Tableau 3. Propriétés des surfaces qui affectent l'adsorption des protéines [80].

Nous passerons en revue l'adsorption des protéines sur les biocéramiques Ca-P sur la base de ces propriétés en détail dans les sections suivantes.

3.1. L'effet des propriétés de la protéine Ca-P sur l'adsorption des protéines

3.1.1. Caractéristiques de surface de Ca-P
Topographie

La caractéristique physico-chimique de la surface du matériau est l'un des facteurs décisifs de l'adsorption des protéines. La topographie de surface, telle que la rugosité, la porosité, la taille des pores et la taille des particules, etc., détermine l'échelle de la surface qui interagit avec les molécules de protéines. Une surface plus exposée peut fournir plus de sites d'interaction pour l'adsorption des protéines. Ces sites lient les molécules de protéines de différentes manières, telles que la force électrostatique, l'hydrophobie, etc. Il est généralement admis que plus la surface spécifique/surface spécifique (SSA) est élevée, plus la quantité d'adsorption de protéines est élevée, sur la base de nombreux résultats expérimentaux. Essentiellement, la modulation de la rugosité, de la porosité, de la taille des pores et de la taille des particules du matériau crée une plus grande surface qui peut bénéficier à l'adsorption des protéines. Notez que l'augmentation de la surface n'est pas seulement valable pour améliorer l'adsorption des protéines sur les biocéramiques Ca-P, mais également valable pour d'autres matériaux.

Une plus grande rugosité pourrait conduire à une plus grande surface, mais cela peut ne pas être invariable à l'échelle nanométrique. Dos Santos et al. [81] ont trouvé que l'adsorption d'albumine et de fibronectine sur HA (revêtu d'Au ou non) avec une nano-rugosité inférieure (32 ± 6 nm) était plus élevée que celle observée sur du β-TCP (revêtu d'Au ou non) au cours du temps. Cai et al. [82] ont également montré que la rugosité nanométrique sur les surfaces en titane avait peu d'effet sur la structure et la quantité d'albumine et de fibrinogène adsorbés. Cependant, l'adsorption de molécules plus grosses comme le collagène peut être influencée par les différents degrés de rugosité sur les surfaces polymères [83]. Des différences ont été observées non seulement dans la quantité de protéines mais aussi dans leur structure. La raison peut être que lorsque l'échelle de rugosité augmente de nanomètres à micromètres, la topographie peut apparaître lisse pour la protéine, compte tenu de la taille de la protéine, et avoir peu d'effet sur le processus d'adsorption [84,85]. À l'heure actuelle, on sait que la rugosité nanométrique du Ca-P peut affecter le processus d'adsorption des protéines, mais d'autres études doivent être menées pour comprendre les tendances influentes, en particulier pour différentes adsorptions de protéines sur différentes surfaces de Ca-P.

La porosité, la taille/distribution des pores et la taille des particules ont également un impact sur l'adsorption des protéines en régulant la surface. La présence de porosité augmente fortement la surface des matériaux et améliore l'adsorption des protéines. Zhu et al. [86] ont rapporté que la quantité de protéines totales adsorbées sur Ca-P biphasique poreux (BCP (HA/TCP = 7 : 3)) était bien supérieure à celle sur BCP dense. Beaucoup de pores avec la distribution de taille de 100 à 500 m de diamètre présentés sur BCP poreux, et de nombreux micropores répartis sur la paroi des macropores. L'augmentation de la surface des matériaux est principalement attribuée à la présence de macropores et de micropores. Une porosité plus élevée conduit à une surface plus élevée. La porosité pourrait encore augmenter l'adsorption des protéines et l'attachement cellulaire ultérieur [87]. De nombreuses autres études ont également prouvé l'effet de la porosité sur l'adsorption des protéines sur Ca-P [88-90]. La plupart des protéines subiraient un réarrangement structurel ou conformationnel après adsorption sur la surface du substrat [80]. Le comportement des protéines adsorbées sur Ca-P poreux est un processus d'adsorption multicouche et celui sur Ca-P dense est un processus monocouche. Elle pourrait être attribuée à l'effet de retenue des structures poreuses [86]. De plus, l'effet des structures poreuses sur l'adsorption des protéines a été considéré comme une interprétation du potentiel ostéoinducteur des biocéramiques Ca-P après implantation sur des sites ectopiques [91,92]. Les biocéramiques Ca-P peuvent adsorber et enrichir les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) natives des fluides corporels, qui induisent la formation osseuse de manière dose-dépendante [93]. Si le seuil de concentration locale de BMP pour déclencher l'ostéoinduction est satisfait, les biocéramiques Ca-P pourraient avoir le potentiel d'être ostéoinductrices. La structure poreuse du Ca-P augmente le SSA, ce qui amène le Ca-P à lier plus de BMP, et joue un rôle vital pour l'ostéoinductivité des biocéramiques Ca-P. Pendant ce temps, la taille des pores est un autre facteur qui contrôle l'adsorption des protéines. Il devrait être en corrélation avec la taille des protéines et la taille des cellules. Si le nano/méso-pore est plus petit que la protéine, la protéine ne pourrait pas être adsorbée dans les pores et donc la surface efficace pour cette adsorption de protéine doit être diminuée. Au contraire, la protéine est facilement piégée dans les mésopores et améliore l'adsorption. De nombreux résultats expérimentaux ont validé ce phénomène. Fujii et al. [94] ont rapporté que les nanocristaux de HA substitué par du zinc (Zn-HA) avec une certaine teneur en Zn étaient plus appropriés pour β2-microglobuline (β2-MG) que pour l'adsorption de l'albumine de sérum bovin (BSA), qui est attribuée à la taille des pores présentée sur Zn-HA étant appropriée pour β2-Adsorption de MG. La même histoire s'est également produite sur le carbonate HA et d'autres Ca-P [95-97]. Pendant ce temps, la taille des cellules est une référence clé pour la sélection de la taille des macropores. La taille moyenne des cellules du corps est d'environ 50 m, ainsi des micropores de 0 à 100 m ont été adoptés dans les biocéramiques Ca-P poreuses pour favoriser l'adhésion cellulaire, et des macropores de 100 à 500 m pour favoriser la croissance tissulaire [91,92]. Quant à la granulométrie, elle est principalement corrélée avec la SSA. Une taille de particule plus petite conduit à une SSA plus élevée, ce qui améliore l'adsorption des protéines [96, 98]. Rouahi et al. [88] ont rapporté que la poudre d'HA avec des particules de 100 nm entraînait une adsorption des protéines plus élevée que celle de la poudre d'HA avec des particules de 1 m. Cela a été attribué à la SSA plus élevée de la poudre d'HA à l'échelle nanométrique par rapport à l'HA à l'échelle microscopique. Ainsi, la quantité de protéines adsorbées sur les poudres était positivement corrélée à leur SSA. En combinant l'effet de la porosité, il devrait être que plus le SSA des particules de Ca-P est élevé, plus leur adsorption de protéines est élevée, plus la micro-porosité des céramiques est faible, plus leur adsorption de protéines est faible et plus l'attachement cellulaire initial est faible, comme indiqué dans la figure 2.

Figure 2. Schéma de la corrélation inverse existant entre la SSA, la capacité d'adsorption des protéines de la poudre d'HA et l'adsorption des protéines et l'attachement et la croissance des cellules sur des céramiques HA frittées [88].

Il convient de noter que l'augmentation de la SSA ne signifie pas que la taille des particules est aussi petite que possible. Car, lorsque la taille est de l'ordre du nanomètre, de nombreux facteurs sont susceptibles de changer (par exemple, les défauts de surface augmentent en proportion inverse de la taille des particules) [99]. Certains effets spécifiques des nanomatériaux pourraient avoir un impact sur l'adsorption des protéines. Malheureusement, il existe peu d'études sur l'effet nano sur l'adsorption des protéines à la surface du Ca-P.

Propriétés chimiques du Ca-P

Il est bien connu que les comportements d'adsorption des protéines peuvent être contrôlés par les paramètres de surface du substrat [100-103]. Les propriétés chimiques de la surface du matériau jouent un rôle important dans la détermination de l'efficacité d'adsorption des protéines et de la quantité de protéines adsorbées par interaction entre les groupes fonctionnels du substrat et des protéines, voire la conformation des protéines adsorbées. La nature chimique de la surface peut induire des interactions protéine-surface plus importantes par le biais d'interactions électrostatiques ou hydrophobes [104]. Il est généralement admis que la force électrostatique a joué un rôle vital dans le processus d'adsorption des protéines et a été prouvée par de nombreuses études expérimentales et de simulation informatique [98, 105-107]. Les ions ou groupes chargés sur la surface du substrat peuvent lier les groupes fonctionnels chargés, y compris le groupe amino, le groupe carbonyle, le groupe carboxyle et le groupe aromatique, etc., sur les molécules de protéine pour dominer l'adsorption des protéines. Les ions ou groupes liés à la surface du substrat ou aux protéines sont généralement appelés sites d'adsorption. De nombreuses recherches se sont concentrées sur l'effet du composant chimique ou du taux de solubilité/dégradation et du potentiel zêta du matériau sur l'adsorption des protéines. Essentiellement, ces effets visent simplement à réguler la densité de charge, la distribution de charge ou la distribution des sites d'adsorption sur la surface du substrat afin de favoriser la liaison aux protéines. Ca 2+ et PO4 3− sont considérés comme les sites de liaison aux protéines sur les surfaces Ca-P et constituent la principale force motrice de l'adsorption des protéines [105, 108, 109]. Différents matériaux de substrat de composant ont des structures différentes qui peuvent conduire à une distribution différente des sites de charge/d'adsorption sur les surfaces. Par exemple, la distribution d'ions ou de groupes chargés (principalement Ca 2+ et PO4 3− ) sur HA est très différent de celui sur OCP (figure 3). La même histoire s'est également produite sur d'autres Ca-P. Cette différence pourrait induire la différence de charge nette sur la surface du substrat. On sait que les protéines peuvent être divisées en deux types généralement, l'une est une protéine acide dont le point isoélectrique (pI) < 7 et l'autre est une protéine basique dont le pI > 7. Lorsque le pH est de 7,4, qui est égal à celui du pH physiologique. l'environnement, la protéine acide et la protéine basique portent respectivement une charge négative et une charge positive. L'interaction électrostatique entre la surface du substrat et les protéines pourrait être affectée par la charge de surface et la charge nette des protéines dans différentes solutions. Zhu et al. [98] ont rapporté que HA, BCP et TCP avaient une charge de surface négative et préféraient adsorber plus de lysozyme de protéine basique (LSZ) que de protéine acide BSA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4. HA avec une charge nette de surface plus élevée et donc une valeur plus élevée du potentiel zêta présentait une adsorption LSZ plus élevée en raison de l'attraction électrostatique plus forte entre eux. Une autre protéine basique, transforming growth factor-β1 (TGF-β1), qui peut favoriser la prolifération et la différenciation des cellules ostéoformatrices [110], a également préféré s'adsorber sur le BCP poreux avec un potentiel zêta plus élevé que celui du BCP dense chez le rat. sérum et in vivo [86]. Ohta et al. [111] ont rapporté que les sites de charge positive Ca 2+ adsorbaient les protéines acides et les PO négatifs4 3− sites liés aux protéines basiques. L'ordre des rapports des sites Ca sur P a été estimé comme étant DCPD > OCP > HA DCPA ≫ β-TCP, ce qui est en accord avec l'ordre des potentiels zêta de surface. Et la quantité de protéines adsorbées est proportionnelle à la charge de surface. Le type de protéines adsorbées dépend de la distribution des sites Ca, P. L'effet de la distribution des ions ou groupes chargés sur l'adsorption des protéines est relativement évident sur le Ca-P amorphe. Il n'y a pas de différence significative dans l'adsorption des protéines trouvée entre l'HA amorphe et la fluorapatite car leur structure de surface n'est pas très ordonnée par rapport à la position de Ca 2+ , PO4 les ions 3−, OH− et F−. Ainsi, la différence de nombre de sites de liaison et de force d'adsorption qui dépend également des protéines est minimisée [112].

Figure 3. La vue de dessus de la distribution des ions chargés ou des groupes sur (une) HA (001) et (b) OCP (100) avions. Ca, vert P, violet O, rouge.

Les lacunes et les défauts à la surface des cristaux de Ca-P ont également un impact sur l'adsorption des protéines [109]. Webster et al. [113] et Ergoun et al. [114] ont rapporté que la quantité de BSA adsorbée était diminuée par le Zn 2+ substitué dans le cristal de HA. Fujii et al. [94] ont trouvé que la SSA du Zn-HA augmentait avec l'augmentation de la teneur en Zn et que les quantités de BSA adsorbées sur le Zn-HA diminuaient avec l'augmentation de la teneur en Zn malgré l'augmentation de la SSA. Cela pourrait être attribué à la disposition spéciale des ions ou des groupes sur le HA substitué, qui a conduit le Zn-HA à une adsorption hautement sélective de β2-MG combinant avec l'effet de topographie. Elangovan et al. [115] ont rapporté que moins de protéines salivaires acides riches en proline (PRP1) étaient adsorbées sur HA carbonaté (CHA) que sur HA, et un degré plus faible d'adsorption de BSA sur CHA que HA avec une teneur en carbonate croissante, citant des changements dans la morphologie et la texture des cristaux comme cause possible [116]. Cependant, Takemoto et al. [96] ont trouvé qu'une teneur plus élevée en carbonate de CHA adsorbait plus β2-MG que les inférieurs. Sévitch et al. [89] ont également rapporté les différents comportements d'adsorption de trois peptides artificiels sur CHA et HA. En conséquence, ces différences d'adsorption provoquées par un défaut/substitution de matériau sont attribuées à la différence de distribution des sites de liaison ou de densité/distribution de charge de surface sur les surfaces du substrat. Compte tenu de la variation des groupes de charge sur les protéines, l'adsorption sélective des protéines sur différents composants/structures Ca-P est facile à comprendre.

L'environnement d'incubation est également un facteur important qui a un impact sur l'adsorption des protéines. Différents types d'ions dans la solution sont redistribués sous le contrôle des charges de surface du substrat, ce qui entraîne une modification des propriétés de la solution autour de la surface. Les contre-ions dans la solution sont attirés par la surface du substrat et rendent les molécules d'eau voisines plus ordonnées. Ces différences dans la distribution des charges de surface causées par l'incubation dans la solution ont le potentiel d'améliorer ou d'inhiber l'adsorption des protéines sur les surfaces du matériau. Par conséquent, différentes solutions pourraient induire différents comportements d'adsorption de protéines. Cependant, pour les biocéramiques Ca-P, les solutions d'incubation ont des propriétés similaires selon le domaine d'application Ca-P. PBS, solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), sérum et in vivo sont principalement utilisés pour l'étude de l'adsorption des protéines sur Ca-P. Mais les différences entre les différentes solutions sont rarement signalées. Le pH est un facteur important qui affecte les propriétés électriques de la solution d'incubation. Des études ont montré qu'une diminution du pH entraînait une augmentation de l'adsorption des protéines acides et de l'affinité de liaison [117]. Pendant ce temps, la solubilité du Ca-P est un paramètre important pour influencer les propriétés de la solution. Un exemple représentatif d'adsorption de protéines sur BCP et HA s'est produit. Il est connu que le β-TCP a une solubilité plus élevée que HA [118] et la dissolution de Ca 2+ , PO4 3− et d'autres ions du β-TCP entraîneraient une augmentation de la force ionique de la solution. Une force ionique plus élevée dans la solution pourrait inciter la protéine à exposer plus de résidus ionisés polaires au solvant [117,119]. Ainsi, la quantité de protéine adsorbée sur le BCP pourrait être augmentée par l'interaction plus forte entre la protéine et les sites de liaison à la surface du BCP, qui a toujours une plus grande capacité à adsorber les protéines que l'HA, compte tenu de l'effet de la topographie en même temps. 97]. Cela pourrait également être la raison pour laquelle le BCP a une meilleure ostéoinductivité que l'HA. Pour les biocéramiques, la température de frittage a un effet important sur la solubilité du Ca-P dans la solution d'incubation en fonction des différences de leurs propriétés thermodynamiques [88]. Une température plus élevée entraîne une cristallinité plus élevée, donc une solubilité plus faible [25,120–122].

Propriétés hydrophobes du Ca-P

Outre la force électrostatique, l'interaction hydrophobe est un autre moyen important d'induire une plus grande affinité protéine-surface. Il est généralement vrai qu'une surface hydrophobe adsorbera les protéines plus fortement qu'une surface hydrophile chargée de manière neutre et donc adsorbera une plus grande quantité de protéines [123-125]. Les protéines auront tendance à s'adsorber sur la surface hydrophobe par des plaques hydrophobes de résidus présents dans la structure amphiphile de la protéine. La protéine se déplierait et étendrait son noyau hydrophobe sur la surface en raison de la force motrice thermodynamique pour réduire la surface hydrophobe nette du système exposé au solvant [125,126]. Les groupes fonctionnels chargés et polaires des protéines auront tendance à interagir avec la surface hydrophile. Pour les biocéramiques Ca-P, le BCP a une hydrophobie plus élevée que celle du HA, mais inférieure à celle du β-TCP selon les résultats de mesure de l'angle de contact [127,128]. Cela pourrait être une autre raison pour laquelle le BCP a une plus grande capacité à adsorber les protéines que le HA.

Globalement, l'effet des propriétés chimiques et hydrophobes du biomatériau sur l'adsorption des protéines peut être illustré sur la figure 4 [80]. Toutes les variations des paramètres des matériaux du substrat, tels que le composant, le potentiel zêta, le défaut de cristallin et de solubilité, etc., servent simplement à réguler les propriétés chimiques ou l'hydrophobie des matériaux afin d'obtenir une charge de surface, des sites de liaison et une distribution de sites polaires appropriés pour améliorer ou inhiber l'adsorption des protéines.

Figure 4. Schéma illustrant l'importance des propriétés chimiques et hydrophobes dans l'adsorption des protéines [80].

Sur la base de l'examen ci-dessus, il est clair que les biocéramiques Ca-P obéissent également à la régulation générale de l'adsorption des protéines sur les matériaux substrats. En résumé, la porosité et la SSA plus élevées, la taille des particules relativement plus petite, la distribution de charge de surface appropriée, la distribution des sites de liaison et hydrophobes/polaires pour différents types de protéines et d'environnements d'incubation profitent à l'adsorption des protéines sur les biocéramiques Ca-P.

3.1.2. Propriétés des protéines et leurs changements de conformation lors de l'adsorption sur la surface Ca-P
Les propriétés de structure des protéines

Les propriétés de structure des protéines qui influencent l'activité de surface sont liées à la structure primaire de la protéine, ce qui signifie que la séquence d'acides aminés affecte les interactions protéine-surface. Les plus grosses protéines ont plus de sites de liaison pour interagir avec la surface du substrat. Ainsi, les molécules plus grosses ont le potentiel d'être davantage adsorbées à la surface. Cependant, pour un système à plusieurs composants, le taux de transfert de masse de la molécule de soluté vers une surface est directement lié à sa concentration et inversement à son poids moléculaire [126,129]. En conséquence, pour les systèmes multiprotéiques tels que le sérum, les protéines les plus concentrées et les plus petites qui auraient un taux de diffusion plus élevé ont tendance à s'adsorber d'abord sur la surface, puis sont déplacées par des protéines plus grosses et plus fortement interagissant qui peuvent être adsorbées plus tard. C'est ce qu'on appelle l'effet Vroman [130,131]. Pendant ce temps, les acides aminés chargés d'hydrophobie sont généralement situés à l'extérieur des protéines et sont principalement responsables de l'adsorption sur les surfaces. De la même manière que les propriétés de surface du Ca-P, la distribution des sites de charge/liaison sur les protéines joue également un rôle important dans l'adsorption des protéines. Fait intéressant, les protéines montrent souvent une plus grande activité de surface près de leur point isoélectrique [80,132-134]. Cela pourrait être attribué à l'interaction plus faible entre les molécules de protéines. Les propriétés de dépliement/d'étalement de la protéine et sa stabilité ont également un impact sur l'adsorption. Le dépliement/l'étalement d'une protéine est susceptible d'exposer davantage de sites pour le contact protéine-surface. Les protéines moins stables sont susceptibles de se déployer davantage ou plus rapidement. Bien que les acides aminés polaires et chargés hydrophiles soient généralement situés à l'extérieur de la molécule et les résidus hydrophobes à l'intérieur, les acides aminés hydrophobes ont également la possibilité d'interagir avec les surfaces. Dans le même temps, le dépliement/étalement des protéines peut exposer des régions hydrophobes et permettre une interaction avec la surface [80].

Compte tenu du domaine d'application des biocéramiques Ca-P, les protéines cibles les plus adoptées dans l'enquête comprennent les protéines acides, telles que l'albumine sérique, la fibronectine, le fibrinogène et les phosphoprotéines osseuses, et les protéines basiques, telles que le lysozyme et le TGF-β1. Mais la recherche systématique des types d'adsorption de protéines sur Ca-P est rarement rapportée. Cependant, des études plus approfondies doivent être menées. Récemment, des peptides artificiels ont été utilisés pour étudier plus avant le comportement méticuleux de l'adsorption des protéines [89].

Les changements de conformation des protéines lors de l'adsorption sur la surface Ca-P

De nombreuses études ont montré que la conformation des protéines serait modifiée lorsqu'elles sont adsorbées sur la surface du substrat, et l'étendue est principalement liée aux propriétés de surface du substrat et aux caractéristiques de la solution de protéines [135-140]. Les changements de conformation des protéines adsorbées ont de grands effets sur l'activité biologique des matériaux substrats et les interactions cellulaires dépendent fortement de la nature du changement de conformation [141]. A noter que tous les changements ne sont pas bénéfiques pour l'attachement cellulaire : la fibronectine dénaturée ne supportera plus l'adhésion et la croissance des cellules [112]. En particulier, c'est un facteur vital pour influencer la bioactivité des biocéramiques Ca-P. Par exemple, Gibbons et al. [142] ont rapporté qu'il y avait des différences significatives dans l'affinité des bactéries orales pour les protéines salivaires adsorbées sur HA par rapport aux protéines en solution. D'autre part, si la conformation est altérée, différents acides aminés pourraient être exposés à la surface de la protéine, ce qui pourrait par conséquent modifier la façon dont la molécule se lie au substrat. La microscopie à force atomique (AFM), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)/la réflectance interne totale atténuée (ATR) et la spectrométrie de masse à ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS) sont les méthodes les plus adoptées pour l'étude de la conformation des protéines [83,112,138,140,142 –145].

Zeng et al. [112] ont montré que l'augmentation plus importante du rapport Amide I/Amide II de BSA était observée sur du BSA adsorbé sur une surface Ca-P, plutôt que sur des surfaces de titane (Ti) et de germanium (Ge). Une plus grande quantité de protéine a été adsorbée sur la surface Ca-P. Ce résultat indique que la BSA a perdu la structure de l'hélice en raison de l'adsorption sur toutes les surfaces et que la plus grande perte s'est produite sur les surfaces Ca-P. Cependant, il est difficile de savoir en quoi la structure de l'hélice s'est transformée en raison de l'adsorption. Les grands changements de conformation du BSA adsorbé sur le Ca-P pourraient également être attribués aux interactions électrostatiques. Les distributions des sites de liaison jouent un rôle important dans ce processus. Xie et al. [145] ont montré que la conformation de la BSA adsorbée changeait au cours de la transformation de la brushite en HA. Dans ce processus, les résultats FTIR/ATR ont montré que le pourcentage de surface de la bande dominante (Amide I) à 1650 cm -1 était diminué et que celui de 1630 cm -1 était augmenté. Elangovan et al. [115] ont étudié les changements de conformation du PRP1 acide lors de son adsorption sur HA et CHA. En solution, de grandes portions de PRP1 ont la structure hélicoïdale de polyproline hydratée de type II (PPII) en plus de la structure de bobine aléatoire. Après adsorption sur HA et CHA, PRP1 perd une partie considérable de PPII hydraté et de domaine de bobine aléatoire, indiquant qu'une grande proportion des protéines est composée de tours . Les changements de conformation étaient plus importants dans PRP1 adsorbé sur HA que sur CHA, et moins de protéines adsorbées sur CHA que sur HA. Elle est également attribuée à la distribution différente des sites de liaison ou des ions/groupes électrostatiques sur CHA et HA. Dans le même temps, la teneur en carbonate du Ca-P pourrait avoir un effet notable sur l'étendue des changements de conformation des protéines. D'autre part, la conformation et la structure du résidu, du peptide et de la protéine affectent également le comportement de nucléation des précipités Ca-P. Une simulation de dynamique moléculaire (MD) de la nucléation de Ca-P sur des peptides modèles, à partir de la sialoprotéine osseuse (BSP), avec une conformation différente présentée, a indiqué qu'il a été démontré que les séquences Glu contiguës hautement conservées sont les domaines de nucléation de Ca-P, ce qui est cohérent avec les résultats expérimentaux. Dans certaines simulations de la conformation -hélicoïdale, la possibilité de favoriser la nucléation de la matrice de HA a été observée, mais pas dans la conformation de bobine aléatoire [146].

La conformation des protéines est très importante pour la bioactivité ou l'ostéoinductivité des biocéramiques Ca-P, cependant, il n'y a pas beaucoup d'études se concentrant sur ce domaine pour Ca-P. Il est important de noter que d'autres recherches sur l'effet des changements de conformation des protéines sur la réponse biologique au Ca-P sont rarement rapportées. Les facteurs qui pourraient avoir un impact sur la conformation des protéines et l'étendue de son influence ne sont pas encore clairs. Une étude systématique de la relation entre les propriétés des biocéramiques Ca-P, la conformation des protéines et leur réponse biologique est très nécessaire.

3.2. Interactions entre les protéines et le Ca-P

3.2.1. Interactions

Tous les comportements d'adsorption de protéines sur Ca-P sont le résultat de l'interaction entre les protéines et Ca-P. Différents comportements d'interaction à l'interface organique-inorganique peuvent conduire à différentes propriétés d'adsorption et de structure des protéines, de morphologie, de taille, d'orientation, de nucléation et de croissance des précipités Ca-P. Les recherches sur l'interaction entre les protéines et le Ca-P, combinant la méthode d'analyse théorique, sont utiles pour mieux comprendre le mécanisme d'adsorption des protéines, voire de biominéralisation.

L'interaction des protéines avec Ca-P dépend principalement de la force électrostatique, et parfois de la liaison hydrogène, ce qui a été prouvé par des résultats de simulation expérimentale et informatique [106,107,117]. Protéines adsorbées sur les surfaces de Ca-P principalement via des sites Ca positifs, liant des groupes carboxylate négatifs et des sites P/OH négatifs, liant des groupes amino positifs dans la protéine, tandis que d'autres groupes tels que le groupe guanido chargé, les groupes amino neutres et hydroxyles, ont une interaction relativement faible avec les surfaces. Différentes protéines ont différents arrangements de groupes chargés qui conduisent à différents comportements d'adsorption. Comme les cristaux de Ca-P ont des structures différentes sur leurs plans, compte tenu de la reconnaissance des formes entre les surfaces cristallines et les molécules [147], les protéines pourraient avoir la propriété d'adsorption sélective sur les plans de surface du Ca-P, ce qui pourrait être la raison des effets des protéines sur morphologie, taille et orientation des cristaux de Ca-P. Par exemple, les protéines acides sont préférentiellement adsorbées sur la face (100) des cristaux d'HA et d'OCP [148]. Alors que la force de l'interaction entre l'amélogénine et les faces cristallines de l'OCP était de l'ordre de (010) > (001) > (100), ce qui indiquait que l'adsorption de l'amélogénine sur l'OCP devrait bloquer la croissance de (010) face [149]. Différents arrangements de groupes carboxylates et de groupes amino entraînent différents types de résidus dans la protéine, appelés résidus acide et résidu basique qui sont respectivement négatifs et positifs. Ainsi, sur la base de l'attraction électrostatique, les protéines acides doivent de préférence être adsorbées sur les surfaces à base de sites Ca, les protéines basiques préférentiellement adsorbées sur les surfaces à base de sites P/OH les résidus acides de préférence liés aux sites Ca, les résidus basiques préférentiellement liés à les sites P/OH. Dans l'ensemble, de nombreuses protéines liées à la minéralisation sont acides et phosphorylées, et on pense qu'elles jouent un rôle clé dans la biominéralisation [150]. Les phosphoprotéines acides sont évidemment riches en résidus acides, acide aspartique (Asp) et acide glutamique (Glu), mais contiennent également des résidus basiques, arginine (Arg) et lysine (Lys). Glu a préféré s'adsorber fortement sur la face HA (001), ce qui a entraîné la formation de HA glycine (Gly) en forme de plaque n'a montré aucune adsorption préférentielle significative sur les surfaces de HA, ce qui a entraîné un HA en forme de tige [86,111,151].

3.2.2. Simulation de dynamique moléculaire de l'adsorption de protéines

Avec le développement rapide de la technologie informatique, la méthode de simulation a été de plus en plus appliquée dans le domaine de l'adsorption des protéines et nous a fourni une grande partie des informations sur l'interaction Ca-P-protéines au niveau atomique. La méthode de simulation MD est principalement utilisée et a été largement appliquée en chimie et en biologie. La simulation MD est une technique basée sur la mécanique classique et qui calcule les comportements dépendant du temps d'un système moléculaire. Dans cette méthodologie de calcul, les atomes sont décrits comme des corps mous. Combinant des paramètres de champ de force appropriés pour les protéines, la simulation MD a été largement appliquée dans la recherche d'adsorption de protéines sur substrat solide [152,153]. Dans la recherche sur les biomatériaux, il a également commencé à jouer un rôle de plus en plus important. Par exemple, le comportement d'adsorption de l'oligopeptide, des tripeptides Arg-Gly-Asp (RGD), de la fibronectine et de la HSA sur la surface du rutile (110) a été étudié par MD sur la base du champ de force d'Amber [154,155] et du champ de force de Charmm [156]. Le changement de conformation de HSA en cours d'adsorption sur une surface de nanotube de carbone est également simulé par la méthode MD basée sur le champ de force de Charmm [157]. Les comportements interactifs entre différents sous-domaines des surfaces HSA et graphite avec ou sans eau [158,159], et le comportement d'adsorption de certains oligopeptides sur des surfaces de quartz ont été évalués par MD sur la base du champ de force CVFF [160].

Pendant ce temps, de nombreux travaux de MD sur l'interaction entre la protéine et le Ca-P ont été effectués. Les simulations basées sur le champ de force de Charmm de la fibronectine de type III avec différentes orientations et l'adsorption de BMP-7 sur la surface HA (001) ont indiqué que l'énergie électrostatique joue un rôle dominant dans l'interaction entre les charges -COO - et -NH3 + sont les groupes les plus forts qui interagissent avec la surface HA [106,107]. Les simulations CVFF basées sur le champ de force de l'adsorption d'acide polyacrylique sur la surface de l'HA ont indiqué qu'il existe des sites potentiels pour la chélation et la formation de liaisons hydrogène entre l'HA et l'acide polyacrylique, qui dépendent de la surface exposée de l'HA. Le groupe COO − fortement attaché aux atomes de calcium et est un site plus important pour la minéralisation HA que le groupe COOH [161,162]. La simulation basée sur le champ de force d'Amber de l'interaction entre le tri-peptide Hyp-Pro-Gly dans la protéine de collagène et les surfaces HA a indiqué que ce tri-peptide interagissait principalement avec HA (1 0), plutôt que le plan HA (001) selon les résultats de l'énergie d'adsorption, ce qui est en accord avec une expérience selon laquelle dans l'os naturel la surface (1 0) croît préférentiellement à partir d'une matrice de collagène [163-165]. L'adsorption des acides aminés Gly et Glu sur la surface HA a été étudiée par MD sur la base d'un BHM mixte et du champ de force de Lennard_Jones. Ses résultats ont indiqué que les acides aminés adsorbés sur les surfaces HA (001) et (100), avec leurs groupes aminés positifs occupant des sites calciques vacants, et leurs groupes carboxylates négatifs occupant des sites P ou OH vacants, formaient précisément et une couche d'adsorption ordonnée Glu préféré s'adsorber fortement sur la surface de HA (001), ce qui a entraîné la formation de HA en forme de plaque. Cependant, Gly n'a pas montré d'adsorption préférentielle significative entre ces deux surfaces HA [151]. De plus, la question de savoir comment BSP favorise la nucléation de HA a également été étudiée par simulation MD basée sur le champ de force de Charmm, qui a simulé l'interaction entre différents peptides conformationnels dans les ions BSP et Ca/P en solution aqueuse. Les résultats ont montré qu'un triangle équilatéral de Ca 2+ s'est formé autour de la surface d'un peptide à conformation -hélicoïdale, qui correspondait à la distribution de Ca 2+ sur la surface (001) du cristal de HA. Il a indiqué que les séquences Glu contiguës hautement conservées devraient être les domaines de nucléation [146].

Bien que la simulation MD ait été utilisée dans de nombreux domaines de recherche, il convient de noter la limitation des calculs MD lors de l'application des résultats aux expériences. Les échelles de temps et d'espace de simulation ne peuvent pas correspondre aux environnements réels pour la limitation de la puissance informatique. De plus, des différences entre les paramètres des champs de force qui ont été calculés sur la base de la mécanique quantique et les résultats pratiques existaient également. Ainsi, il existe toujours un certain écart entre les résultats des calculs et les données expérimentales. Néanmoins, la tendance générale et les informations détaillées au niveau atomique sont utiles pour prédire et expliquer les phénomènes d'adsorption et sont suffisantes pour restreindre les tests expérimentaux ou réduire le coût d'analyse, même si les résultats de la simulation peuvent ne pas être les résultats exacts.

4. Adsorption de protéines sur des céramiques non Ca-P

Au-delà des céramiques Ca-P, l'adsorption des protéines sur les céramiques non Ca-P est plus compliquée car les substrats adsorbants sont incertains [166,167]. Contrairement aux céramiques Ca-P, les caractéristiques physiques et chimiques de la surface des céramiques non Ca-P sont différentes et elles sont plus sensibles à l'adsorption des protéines [168].

De nombreux facteurs pourraient affecter l'adsorption des protéines. Les facteurs dominants dans les céramiques non Ca-P sont différents. Cependant, l'adsorption des protéines est principalement déterminée par trois catégories : les propriétés des protéines [169,170], les propriétés des substrats et des milieux [171-173] et les interactions protéine-substrat [37,174-177]. La figure 5 montre un schéma des facteurs d'influence en ce qui concerne l'adsorption des protéines.

Figure 5. Les facteurs d'influence des adsorptions protéiques.

4.1. Facteurs d'influence des protéines

Les propriétés des matériaux sont des caractéristiques naturelles pour décider de leur affinité d'adsorption [178,179]. Le phénomène d'adsorption, d'une part, est fortement affecté par la nature des protéines adsorbantes elles-mêmes. Norde & Anusiem [180] a divisé les protéines en deux classes, les protéines « dures » et « molles ». Les protéines « dures » ont une forte cohérence interne et des réarrangements structurels qui n'apportent que de faibles contributions au processus d'adsorption. Ces protéines préfèrent être adsorbées sur des surfaces hydrophobes, alors qu'elles peuvent également être adsorbées sur des surfaces hydrophiles si elles sont attirées électrostatiquement [181,182]. Les protéines « molles », qui ont une stabilité structurelle plus faible, peuvent être adsorbées même dans des conditions plus rigoureuses. Par exemple, sur des surfaces hydrophiles et électrostatiquement repoussantes, ces protéines présentent également une grande force motrice pour l'adsorption en raison de leurs réarrangements structurels [183]. Sur ce point, le fameux « effet Vroman » [184-186] soutient également que les propriétés des protéines peuvent grandement décider de leur adsorption. C'est-à-dire que sur la même surface adsorbante, la propriété naturelle de la protéine peut être un facteur critique pour l'adsorption.

Une étude de Jachimska & Pajor [187] a observé que l'angle de contact est très sensible au degré d'adsorption des protéines sur une surface solide. L'angle de contact maximum a été observé lorsque le BSA et le mica étaient chargés de manière opposée. Ils ont également observé qu'un potentiel zêta positif plus élevé de la BSA est en corrélation avec un angle de contact plus élevé. Et à un potentiel zêta positif plus élevé, la BSA présentait une affinité de liaison plus élevée. Ceci est en accord avec l'opinion selon laquelle la surface hydrophobe montre une meilleure affinité d'adsorption des protéines [188,189]. Jachimska a également observé que même lorsque le potentiel zêta effectif de la BSA était négatif, ce qui présentait de mauvaises propriétés hydrophobes, une certaine quantité de BSA était également adsorbée. Ce phénomène peut provenir de la distribution hétérogène des charges à travers les molécules de BSA. Étant donné que la distribution de charge à travers une molécule de BSA est hétérogène et contient des tracés positifs et négatifs, les tracés positifs seraient la zone de liaison efficace, afin d'aider l'adsorption.

4.2. Facteurs d'influence des substrats et des médias

Les caractéristiques physico-chimiques des substrats et milieux adsorbants sont l'autre catégorie de facteurs responsables de la capacité de fixation des protéines. De nombreux facteurs d'influence des adsorbants devraient prendre en compte, par exemple, la composition chimique [190], le comportement de dissolution ou le pH [79,191–193], le degré de cristallisation [194], la microstructure, l'hydrophobie [195–198], le potentiel [199 ], rugosité de surface [200-202] réactivité de surface [203], etc.

De toute évidence, différents types de substrats adsorbants affecteraient grandement les résultats d'adsorption des protéines. Dans la recherche de Rosengren et al. [204], deux vitrocéramiques bioactives, RKKP et AP40, qui ne diffèrent que par leur teneur en Lanthanun et Tantale, ont montré de grandes différences de capacité ostéo-intégrative lorsqu'elles sont implantées chez des rats ostéogéniques [205, 206]. Leur enquête révèle que les différences de capacité ostéo-intégrative présentées par deux matériaux sont dues au fait que les deux matériaux attirent soit des ensembles différents de protéines, soit des quantités différentes de protéines spécifiques, qui peuvent activer ou supprimer la réponse de l'hôte. Van Oss et al. [207] ont présenté des recherches sur l'adsorption de l'albumine sur différentes surfaces d'oxyde inorganique. Ils ont comparé l'adsorption de HSA sur SiO2, SnO2 et ZrO2, et les résultats correspondants ont montré que l'adsorption de HSA était de 500,8 g m 2 sur le SiO2 surface, alors qu'elle était de 968,2 g m 2 et 1157,9 g m 2 sur le SnO2 et ZrO2 superficie, respectivement. SiO2 était assez hydrophile et porte une charge négative plus élevée, à la fois l'hydrophilie et le fort potentiel ζ négatif ont entraîné la répulsion des surfaces de silice par les protéines adsorbées à pH neutre. Rosengren et al. [204] ont révélé que la quantité de protéines plasmatiques adsorbées sur les différents matériaux pouvait être très différente. Après le même traitement adsorbé, les plasmas de liaison étaient de 0,42 mg m -2 sur hydroxyapatite, 0,22 mg m -2 sur zircone et 0,20 mg m -2 sur alumine. De plus, différentes formes des matériaux influencent également l'adsorption, par ex. plaque dense, solide, structure poreuse ou dépôts de poudre, etc.

Une surface hydrophobe est idéale pour favoriser la liaison protéique. Tanaka et al. [208] et Jeyachandran et al. [209] ont observé que la BSA s'adsorberait plutôt sur les surfaces hydrophobes que sur les surfaces hydrophiles. Selon leur rapport, la force électrostatique d'attraction ou de répulsion entre les molécules de BSA et la surface ne joue pas un rôle primordial dans la détermination du comportement d'adsorption de la protéine.

Démanèche et al. [210] ont étudié l'adsorption de BSA sur une surface de mica, observant que les modèles d'adsorption de protéines de BSA sont fonction du pH. Bergers et al. [211] ont également révélé que l'adsorption des protéines était sensible au pH. Ils ont étudié le rôle de l'électrostatique et de l'effet du pH dans le processus d'adsorption des protéines, et un résultat a été observé qu'à faible force ionique, un ensemble de protéines modèles est responsable du pH du milieu d'incubation. Cette dépendance au pH pourrait être attribuée à la charge positive moyenne de la protéine.

Selon certaines études antérieures, la capacité de liaison aux protéines des céramiques Ca-P et des céramiques non Ca-P est différente. Par exemple, le verre bioactif ne peut absorber qu'une petite quantité ou quelques types de protéines.En revanche, beaucoup plus de protéines et de plus grandes quantités peuvent être adsorbées sur les céramiques Ca-P [86,212-214]. En conséquence, il a été confirmé que le dépôt d'apatite de type osseux était l'un des facteurs responsables de l'accélération de la régénération osseuse. Par conséquent, les chercheurs ont essayé de modifier les propriétés de surface des biocéramiques pour améliorer l'adsorption des protéines et l'attachement cellulaire. La pré-formation d'une couche d'apatite est une idée dominante [215,216]. Les techniques biomimétiques et de pulvérisation plasma sont deux méthodes populaires utilisées pour fabriquer la couche d'hydroxyapatite sur la surface de la céramique [217-219]. La technique biomimétique traite les substrats dans le fluide corporel simulé (SBF) pour former une couche d'apatite à la surface. Ces deux méthodes ont montré de bons résultats pour favoriser l'adsorption des protéines et l'attachement cellulaire.

4.3. Les interactions protéine-substrat adsorbant

Les biocéramiques ne fonctionnent pas seules lors de l'adsorption des protéines. Les protéines, d'autre part, jouent également un rôle essentiel dans la détermination du processus d'adsorption des protéines [220]. Le mécanisme des interactions protéine-substrat adsorbant a été largement étudié. Il a été constaté que bien que la plupart des protéines soient soumises à une répulsion à macro-échelle lorsqu'elles s'approchent des surfaces hydrophiles dans un environnement à pH neutre, elles subissent également une attraction locale à micro-échelle sur une variété de sites, les surfaces hydrophiles étant entraînées par les cations plurivalents intégrés dans ces sites. Certaines études ont montré que l'échange cationique (par exemple, les biocéramiques sont traitées par les ions Ca 2+ et La 3+) peut rendre la surface chargée négativement beaucoup plus hydrophobe, favorisant ainsi fortement l'adsorption de diverses protéines.

Lorsque l'hydrophilie et l'hydrophobie sont proches l'une de l'autre à la surface de la biocéramique, l'effet hydrophobe ne joue pas un rôle important dans l'adsorption des protéines. Les interactions électrostatiques entre les céramiques et les protéines peuvent jouer le rôle dominant. A partir des résultats d'adsorption de protéines présentés dans les travaux de Beurer et al. [221] et Wierenga et al. [222], on peut conclure que la quantité de protéine adsorbée correspond fortement à la charge nette de la surface de la protéine et de la céramique. Rezwan et al. [220] ont étudié l'adsorption du lysozyme et du BCA sur des particules de silice et de silice recouvertes d'AlOOH, où les particules de silice non recouvertes et recouvertes d'AlOOH représentent des surfaces d'oxyde chargées négativement et positivement. Il a été constaté qu'au même pH (à pH 7), une protéine chargée de manière opposée à la surface de l'oxyde adsorbait des quantités beaucoup plus élevées. En revanche, les protéines de même charge ne se sont pas adsorbées, ou seulement en très faible quantité, à la surface de l'oxyde. Au cours du processus d'absorption, les protéines avec des chaînes latérales d'acides aminés chargées peuvent subir des interactions coulombiennes répulsives et attractives, qui pourraient jouer un rôle important sur l'adsorption des protéines.

Van Oss et al. [207] ont étudié des sites cationiques discrets et des interactions électrostatiques dans une solution de particules contenant des cations plurivalents. Ils ont observé que le lavage avec Na2L'EDTA peut désorber les protéines des surfaces des particules inorganiques. N / A2L'EDTA comprend de nombreux sites discrets avec un excès local de charge positive en raison de la présence de cations plurivalents. Ces sites locaux chargés positivement attirent les protéines chargées négativement non seulement par attraction électrostatique, mais aussi du fait qu'ils sont des accepteurs d'électrons, qui se lieront aux protéines qui sont des donneurs d'électrons.

5. Adsorption par compétition multiprotéique et effet Vroman

Un autre aspect intéressant de l'adsorption des protéines sur les biocéramiques est l'adsorption par compétition entre deux ou plusieurs protéines sur la même surface adsorbante [223-225]. Leo Vroman a d'abord observé que le fibrinogène s'adsorbait préférentiellement sur les surfaces de tantale à partir du plasma sanguin. Dès lors, de nombreux chercheurs ont trouvé et prouvé ce phénomène [186,226]. Ce type de phénomène d'adsorption multiprotéique est finalement nommé « l'effet Vroman ». L'effet Vroman décrit que dans un système de protéines mixtes, l'adsorption des protéines implique généralement une série d'étapes d'adsorption-déplacement, dans lesquelles les protéines de faible poids moléculaire sont d'abord adsorbées sur la surface, puis sont déplacées par les protéines de poids moléculaire relativement plus élevé. 227 228]. Par exemple, certains chercheurs [186] ont découvert que le poids moléculaire élevé du kininogène déplacerait le faible poids moléculaire du fibrinogène. Cependant, certaines protéines, telles que l'albumine sérique humaine, s'avèrent relativement résistantes au déplacement au niveau des surfaces hydrophobes.

L'adsorption compétitive des protéines dépend fortement des concentrations et des composants concurrents [223, 226]. Brash & Lyman [229] ont démontré que l'adsorption des protéines est directement proportionnelle à la concentration en protéines. Hyéran Nô et al. [230, 231] ont utilisé la méthode de déplétion standard pour mesurer l'adsorption multiprotéique en utilisant l'électrophorèse sur gel SDS comme outil de séparation et de quantification. Ils ont observé le comportement d'adsorption compétitive des protéines sur la même surface adsorbante hydrophobe et ont ainsi conclu que le changement de taille des protéines (principalement le poids moléculaire des protéines) affectait la cinétique d'adsorption des protéines. De plus, il semble que l'effet Vroman, au moins en partie, soit dû à un processus purement physique sans rapport avec la biochimie des protéines ou la cinétique d'adsorption des protéines.

En fait, l'adsorption compétitive des protéines est plus réaliste à la situation dans le corps vivant. Cependant, de nos jours, l'effet Vroman est un phénomène visible mais les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus n'ont pas encore été bien explorés.

6. Conclusions

Les adsorptions de protéines sont des questions très compliquées et des recherches supplémentaires sur les mécanismes concernant la nature de l'adsorption sont nécessaires. En particulier, dans le cadre des exigences de la médecine régénérative, davantage d'efforts doivent être déployés pour explorer les protéines adsorbées à la surface des biocéramiques, telles que les espèces de protéines adsorbées, la conformation des protéines et les interactions protéine-protéine. Ces facteurs sont susceptibles de réguler définitivement les cellules adhérentes, notamment les cellules souches, pour différencier des tissus particuliers. De plus, les méthodes et dispositifs disponibles et réalisables ont fait défaut jusqu'à présent. Ainsi, une autre tâche importante est de développer des méthodes et des dispositifs rationnels pour analyser avec précision les protéines adsorbées.


RÉSULTATS

Changements dépendant du substrat dans la conformation du Fn adsorbé

Fn adsorbe et médie l'adhésion cellulaire à une variété de substrats naturels et synthétiques (Klebe et al., 1981). Les surfaces couramment utilisées pour les études d'adsorption de Fn et d'adhésion cellulaire comprennent des polystyrènes de qualité pour culture bactérienne et tissulaire et des plaques enduites de collagène de type I. Le polystyrène bactérien ou non traité (appelé ci-dessous B) est hautement hydrophobe, tandis que le polystyrène (T) de qualité culture tissulaire a été traité en surface pour présenter une charge négative et réduire l'hydrophobie. L'adsorption de Fn purifié sur ces surfaces synthétiques a été mesurée en utilisant 125 I-Fn. L'adsorption a augmenté linéairement jusqu'à une concentration de revêtement de 10 g/ml, à laquelle elle a atteint des valeurs de saturation (Figure 1). Il n'y avait pas de différences significatives dans la densité de Fn adsorbé entre B et T, et ces valeurs sont en accord avec les mesures précédentes (Grinnell et Feld, 1981). Des niveaux de saturation de 350 à 400 ng/cm 2 représentent approximativement la quantité de Fn nécessaire pour produire un revêtement monocouche basé sur les dimensions de la molécule (Williams et al., 1982). La liaison de Fn au collagène de type I (C) sature à environ un tiers des niveaux pour les polystyrènes (Figure 1). Cette limite de saturation inférieure reflète la liaison de Fn à des domaines spécifiques sur le collagène, alors que d'autres zones du substrat sont bloquées par des régions sur le collagène qui ne se lient pas à Fn.

Fig. 1. Adsorption de Fn (moyenne ± SD trois expériences séparées en double) en fonction de la concentration de revêtement pour différents substrats. Les surfaces ont été recouvertes de différentes concentrations de Fn pendant 30 min et bloquées dans 1% de BSA pendant 30 min. L'adsorption de 125 I-Fn augmentait linéairement avec la concentration du revêtement jusqu'à ce que les niveaux de saturation atteignent ∼10 g/ml.

L'adsorption des protéines sur les surfaces implique de multiples interactions électrostatiques, hydrophobes, de liaison hydrogène et de van der Waals. L'adsorption de Fn sur les polystyrènes synthétiques est relativement non spécifique, et on s'attend à ce qu'elle se produise avec des molécules de Fn dans différentes orientations par rapport à la surface. Parce que l'adsorption de Fn sur B ou T est essentiellement irréversible, ce processus implique vraisemblablement des changements dans la conformation, ou une dénaturation partielle, de Fn. Il est probable que seule une partie des molécules adsorbées présentera un épitope particulier dans une position accessible à la liaison d'anticorps. Pour les molécules Fn dans lesquelles le domaine de liaison cellulaire est exposé, la conformation moyenne de ce domaine pourrait être influencée par les propriétés de surface (charge et hydrophobie) du substrat sous-jacent. Par exemple, parce que le domaine de liaison pour α5??1 l'intégrine dans Fn implique des sites de reconnaissance sur les 9e et 10e répétitions de type III (Pierschbacher et al., 1981 Aota et al., 1994), qui sont reliés par une liaison flexible (Leahy et al., 1996), l'orientation relative de ces domaines pourrait être altérée par les propriétés physico-chimiques de la surface.

Nous avons utilisé un ELISA modifié pour comparer l'adsorption de Fn aux polystyrènes non chargés, bactériens (B Figure 2, cercles ouverts) et chargés, en culture tissulaire (T Figure 2, cercles fermés) en utilisant un polyclonal et trois mAb spécifiques pour des épitopes distincts dans Fn. HFN7.1 est dirigé contre un épitope situé entre la synergie PHSRN et les sites RGD (Bowditch et al., 1991) et bloque l'adhésion cellulaire à Fn (Schoen et al., 1982). 3E1 réagit avec le domaine de liaison à l'héparine C-terminal et 4B2 se lie près du site de liaison de la gélatine (Pierschbacher et al., 1981). Sur la figure 2, l'axe des x a été normalisé à la quantité de Fn adsorbée sur la base des profils d'adsorption de la figure 1. L'axe des y est proportionnel à la quantité d'anticorps lié. Les mAb 3E1 et 4B2 n'ont montré aucune différence significative entre B et T dans la quantité de Fn adsorbée requise pour une liaison à saturation de 50 % pour chaque anticorps. Ces données suggèrent que ces épitopes ne sont pas affectés de manière différentielle dans l'adsorption sur ces surfaces. En revanche, pour HFN7.1, ∼10 fois plus de Fn est nécessaire pour lier la même quantité d'anticorps pour Fn adsorbé sur B par rapport à Fn sur T. Cette différence implique que l'affinité de liaison moyenne de HFN7.1 pour son épitope dans Fn adsorbé à B est significativement inférieur à celui de Fn sur T. Nous interprétons cette différence d'affinité de liaison pour refléter une différence dans la conformation moyenne de Fn adsorbé sur B par rapport à Fn adsorbé sur T. L'anticorps polyclonal a également présenté des différences significatives (10- pli) dans la liaison entre Fn adsorbé sur B et T, suggérant que les changements dans la conformation de Fn adsorbé s'étendent à l'extérieur de l'épitope pour HFN7.1.

Fig. 2. Test de liaison d'anticorps pour la conformation Fn. L'intensité de fluorescence relative (RFI, moyenne ± SD n = 3) pour la liaison d'anticorps en fonction de la densité de surface Fn adsorbée est indiquée. Différents anticorps anti-Fn ont été examinés : HFN7.1, 3E1, 4B2 et anticorps polyclonal Cappel. La liaison aux anticorps augmentait de manière sigmoïde avec le log de la densité surfacique Fn. Les changements dans les profils de liaison d'anticorps représentent des variations d'efficacité de liaison et reflètent des différences dans la conformation de Fn adsorbé sur les différents substrats.

Pour fournir une étape vers un contexte plus physiologique pour la Fn, nous avons analysé la liaison de ces anticorps à la Fn liée au collagène (Figure 2). La cinétique de liaison pour HFN7.1 et l'anticorps polyclonal anti-Fn adsorbé sur le collagène (C Figure 2, carrés fermés) étaient distinctes de la liaison à Fn adsorbée sur l'une ou l'autre des surfaces en polystyrène, et la liaison était systématiquement inférieure à la liaison à Fn sur T Sur la base du raisonnement développé ci-dessus, nous concluons que la conformation moyenne de Fn adsorbé sur le collagène est distincte de celle sur B ou T. Parce que les antisérums ont été fabriqués à Fn soluble (Pierschbacher et al., 1981 Schœn et al., 1982), leurs affinités plus faibles pour la Fn adsorbée sur C suggèrent que la conformation de la Fn soluble est également altérée dans le processus de liaison au collagène. Dans ce dosage, il est possible que certains épitopes soient inaccessibles en raison de l'orientation de la Fn liée. Cependant, le masquage des épitopes par le substrat ne peut expliquer à la fois les grandes différences d'affinité de liaison observées pour deux anticorps (HFN7.1 et polyclonal) et les petites différences d'affinité pour deux autres anticorps (3E1 et 4B2). Nous concluons ainsi que l'adsorption de Fn sur différentes surfaces, polystyrène non chargé, polystyrène chargé négativement ou collagène, produit des effets différents dans la conformation du Fn adsorbé. De plus, ces résultats suggèrent également que tous les domaines de Fn ne sont pas également influencés par l'interaction de la molécule avec le substrat. Enfin, des différences dans la conformation de Fn adsorbé sur différentes surfaces ont été démontrées indépendamment à l'aide de techniques biophysiques, notamment la résonance de spin électronique (Narasimhan et Lai, 1989), la spectroscopie infrarouge (Pitt et al., 1987), fluorescence à réflexion interne totale (Iwamoto et al., 1985), polarisation de fluorescence (Williams et al., 1982) et l'ombrage rotatif (Prix et al., 1982 Erickson et Carrell, 1983), ainsi que des tests biologiques, tels que la liaison aux anticorps (Grinnell et Feld, 1982 Underwood et al., 1993 Pettit et al., 1994) et la force d'adhésion cellulaire (Iuliano et al., 1993 García et al., 1998a).

Les variations de la conformation Fn entraînent des différences dans la liaison des intégrines

Parce qu'il y avait des différences dans la conformation de Fn adsorbé sur B, T et C, et ces différences ont influencé la liaison d'un mAb qui reconnaît un épitope dans le domaine de liaison cellulaire, il est possible que ces changements de conformation dépendant du substrat modifient l'intégrine se lier à la Fn adsorbée. Parce qu'il est extrêmement difficile de mesurer les constantes de liaison des intégrines à la surface des cellules à la Fn adsorbée, nous avons choisi d'examiner la quantité de lié5??1,3??1, etv??3intégrines, qui interagissent avec le domaine de liaison cellulaire dans Fn (Sonnenberg, 1993), pour les cellules plaquées sur les surfaces recouvertes de Fn. Cette approche utilise une procédure de réticulation et d'extraction dans laquelle les intégrines liées sont réticulées à la Fn liée au substrat à l'aide d'un réactif réversible et imperméable aux cellules (Figure 3A). Profitant du fait que la Fn adsorbée est résistante à l'extraction par des détergents (Grinnell et Feld, 1981 Haas et Culp, 1982), la majeure partie des composants cellulaires a ensuite été extraite à l'aide de 0,1% de SDS, laissant derrière elle une matrice extracellulaire liée à la boîte et à ses intégrines associées. Les intégrines liées ont été récupérées en inversant la réticulation et quantifiées par Western blot. Des expériences antérieures ont démontré que les intégrines exprimées en surface qui ne sont pas activées soit en raison de l'absence d'un signal d'activation ou d'un substrat approprié ne peuvent pas être réticulées à la matrice extracellulaire (Enomoto-Iwamoto et al., 1993 García et al., 1998b). Des expériences de coloration par immunofluorescence menées avant et après le clivage alcalin ont démontré que toutes les intégrines détectables ont été éliminées pour tous les substrats. Sur la base de nos mesures, nous nous attendons à ce que >90% des récepteurs réticulés soient récupérés.

Fig. 3. Analyse de liaison à l'intégrine pour les fibroblastes IMR-90 étalés sur différents substrats recouverts de Fn pendant 16 h dans des conditions sans sérum. (A) Schéma de principe de la procédure de réticulation et d'extraction. (1) Les cellules sont plaquées sur des substrats revêtus de Fn. (2) Les intégrines liées sont réticulées à la matrice extracellulaire à l'aide de sulfo-BSOCOES. (3) Les composants cellulaires, y compris les intégrines non liées, sont extraits à l'aide de 0,1% de SDS, laissant derrière eux Fn et ses intégrines réticulées. (4) La réticulation est inversée et les intégrines sont récupérées et quantifiées par Western blot. (B) Western blots représentatifs pour les sous-unités d'intégrine (α3,5,v,1, et3). Les transferts montrent les fractions solubles (+) et les fractions réticulées pour C, T et B. Pour β1, des fractions solubles pour chaque substrat (sc, st et sb) ont été utilisées pour normaliser le nombre de cellules et montrer deux bandes : intégrine exprimée en surface (lente) et précurseur d'intégrine intracellulaire (rapide).

Des fibroblastes humains IMR-90 ont été étalés pendant 16 h sur les différents substrats recouverts de Fn dans des conditions sans sérum. Ces cellules ont été choisies car elles expriment des taux constants d'intégrines dans ces conditions expérimentales. Les fractions d'intégrines solubles et réticulées ont été extraites, analysées par Western blot et quantifiées par imagerie fluorescente. Des fractions solubles (∼80-90% du pool cellulaire total d'intégrines) ont été utilisées pour normaliser les différences dans le nombre de cellules extraites parmi les substrats. Cette méthode biochimique a montré des différences dans la liaison de l'intégrine à Fn adsorbée sur les différents substrats (figure 3B). La quantification des intégrines liées (trois expériences indépendantes Tableau 1) a révélé des différences significatives entre les substrats pour α5 (p < 0,006) et1 (p < 0.05), alors qu'aucune différence n'a été détectée pour αv(p < 0,24) ou β3 (p < 0,83). ??3n'a été détecté que dans les fractions solubles. Les comparaisons par paires ont montré des différences significatives dans α5 liaison entre B et C (p < 0,007) et B et T (p < 0,04) et en β1liaison entre B et C (p < 0.05).

Tableau 1. Niveaux relatifs de sous-unités d'intégrine réticulées pour les fibroblastes IMR-90 plaqués sur B, T et C revêtus de Fn pendant 16 h, comme le montre la figure 3

Les niveaux relatifs ont été quantifiés à l'aide de substrats fluorescents et d'un imageur Storm. Les données de trois expériences distinctes sont présentées (moyenne ± SD). La signification statistique parmi les substrats a été évaluée à l'aide d'ANOVA et de comparaisons par paires.


Voir la vidéo: Mesures de surfaces spécifiques dun solide (Juillet 2022).


Commentaires:

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