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19.E : Régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes (Exercices) - Biologie

19.E : Régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes (Exercices) - Biologie


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19.1 (POB) Liaison spécifique à l'ADN par des protéines régulatrices.

Une protéine répresseur procaryote typique fait une distinction entre son site de liaison à l'ADN spécifique (opérateur) et l'ADN non spécifique par un facteur de 105 à 106. Une dizaine de molécules du répresseur par cellule sont suffisantes pour assurer un niveau élevé de répression. Supposons qu'un répresseur très similaire existe dans une cellule humaine et ait une spécificité similaire pour son site de liaison. Combien de copies du répresseur seraient nécessaires par cellule pour provoquer un niveau de répression similaire à celui observé dans la cellule procaryote ? (Indice : le E. colile génome contient environ 4,7 millions de paires de bases et le génome haploïde humain contient environ 2,4 milliards de paires de bases).

Utilisez les informations suivantes pour les 3 problèmes suivants. Imaginons qu'une partie de la régulation de l'expression du gène OB soit médiée par une protéine que nous appellerons OBF1. Il existe un site de liaison pour OBF1 dans le gène OB, et supposons que ce soit le seul site de liaison spécifique dans le génome haploïde, ou 2 sites spécifiques dans un génome diploïde. Le génome humain haploïde a environ 3 x 109 pb, ou 6 x 109 pb dans un génome diploïde. Si nous supposons qu'environ 33,3% de l'ADN nucléaire est dans une conformation de chromatine accessible, cela signifie qu'environ 2 x 109 pb d'ADN sont disponibles pour lier OBF1 de manière non spécifique.

19.2 Le diamètre d'un noyau de mammifère est d'environ 10 mm. Si vous modélisez un noyau comme une sphère, quel est son volume ? Quelle est la concentration molaire des sites de liaison spécifiques et non spécifiques dans le noyau ?

La liaison d'OBF1 à un site spécifique et à des sites non spécifiques est décrite par les équations suivantes.

Soit P = OBF1

Ds = un site de liaison spécifique dans l'ADN

Dns = un site de liaison non spécifique dans l'ADN génomique

P + D

Ks = = 1011 M-1 (éqn 2)

Kns = = 105 M-1 (éqn 3)

19.3 Quelle fraction de l'OBF1 (ou P dans les équations) n'est pas liée à des sites spécifiques ou non spécifiques dans l'ADN ?

19.4 Combien de molécules d'OBF1 sont nécessaires par noyau pour maintenir 90 % d'occupation des sites spécifiques ? Cette condition signifie

= 9

Utilisez les informations suivantes pour les sept questions suivantes.

Les agoutigène chez la souris contrôle la quantité et la distribution des pigments dans les poils du pelage. Certaines mutations de ce gène entraînent également une obésité à l'âge adulte, un syndrome de type diabète léger, une susceptibilité tumorale et une létalité embryonnaire récessive. Le gène code pour une protéine prédite de 131 acides aminés qui a les caractéristiques structurelles d'une protéine sécrétée, mais aucune homologie frappante avec d'autres protéines connues n'a été reconnue. Cette protéine est susceptible d'être un régulateur de la synthèse des pigments mélaniques, et elle peut également être un régulateur métabolique plus général.

Supposons que vous étudiez la réglementation de la agoutigène, et ont la capacité de transfecter une lignée cellulaire de mélanocytes, qui transcrit le type sauvage agouti gène, et une lignée cellulaire adipocytaire, qui transcrit le type sauvage agoutigène qu'à un niveau très faible. De plus, vous savez déjà que le promoteur basal est dans un segment d'ADN situé entre -100 et +50. Vous effectuez des suppressions progressives en 5' d'un fragment qui comprend -300 à +50, le liez à un gène rapporteur de luciférase et transfectez les constructions dans des cellules mélanocytaires et adipocytaires, avec les résultats suivants.

19.5. Que concluez-vous sur la région entre -250 et -200 ?

19.6. Que concluez-vous sur la région entre -200 et -150 ?

19.7. Que concluez-vous sur la région entre -150 et -100 ?

Vous étudiez également la liaison des protéines nucléaires à ces segments d'ADN situés en amont de la agoutigène. Des extraits contenant des protéines nucléaires de mélanocytes ont été testés pour leur capacité à se lier aux fragments délimités dans la série de délétions ci-dessus.

Le fragment de -150 à -100 a été utilisé comme sonde marquée dans un essai de déplacement de mobilité. La mobilité de la sonde libre est montrée dans la piste 1, et le modèle après liaison à l'extrait nucléaire de mélanocyte est montré dans la piste 2. Les pistes 3-14 montrent les changements de mobilité après l'ajout des concurrents à la réaction de liaison ; le triangle au-dessus des couloirs indique qu'un nombre croissant de concurrents est utilisé dans les couloirs successifs. "Self" est le même fragment de -150 à -100 qui est utilisé comme sonde, mais il est non marqué et présent en excès par rapport à la sonde marquée (pistes 3 à 5). Un ADN complètement différent (ADN de E. coli cisaillé) a été utilisé comme compétiteur non spécifique (pistes 6-8). Deux oligonucléotides duplex différents, l'un contenant le site de liaison pour AP1 (pistes 9-11) et l'autre contenant le site de liaison pour Sp1 (pistes 12-14) ont également été testés. Les cases plus minces et moins densément remplies indiquent des bandes de moins d'intensité que les bandes plus sombres et plus épaisses. Utilisez ces résultats pour répondre aux deux questions suivantes.

19.8. Que concluez-vous de ces données ?

19.9. Quelle séquence dans le segment -150 à -100 pourriez-vous vous attendre à être liée dans les noyaux des mélanocytes ?

19.10. Le fragment de -200 à -150 a également été utilisé comme sonde marquée dans un essai de déplacement de mobilité similaire à celui décrit pour le segment de -150 à -100, comme indiqué ci-dessous.

Que concluez-vous de ces données ?

19.11. Certains allèles mutants du agouti gène sont exprimés de manière ectopique (c'est-à-dire dans le mauvais tissu). En utilisant simplement les informations sur les suppressions 5' ci-dessus, quelle région est un candidat probable pour la position d'une mutation de perte de fonction qui conduit à une expression ectopique dans le tissu adipeux ?

19.12 (POB) Domaines fonctionnels dans les protéines régulatrices.

Un biochimiste remplace le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4 de levure par le domaine de liaison à l'ADN du répresseur lambda (CI) et constate que la protéine modifiée ne fonctionne plus comme un activateur de la transcription (elle ne régule plus la transcription du FILLEopéron dans la levure). Que pourrait-on faire au site de liaison GAL4 dans l'ADN pour rendre la protéine modifiée fonctionnelle en activant FILLEtranscription de l'opéron ?

19.13 Quel est le domaine de liaison à l'ADN du facteur de transcription Sp1 ?

19.14 Quel est le domaine de dimérisation du facteur de transcription AP1 ?

19.15 (ASC) Décrire trois mécanismes de régulation de l'activité des facteurs de transcription.

19.16 (ASC) Vous avez construit un ensemble de plasmides contenant une série d'insertions de nucléotides espacées le long du gène du récepteur des glucocorticoïdes. Chaque insertion code pour trois ou quatre acides aminés. Les positions cartographiques des différentes insertions dans la séquence codante du gène récepteur sont les suivantes :

0 Séquence codant pour le récepteur des glucocorticoïdes 783

| |

| |

| |

Insertion : A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S

Les plasmides contenant le gène récepteur peuvent être exprimés fonctionnellement dans les cellules CV-1 et COS, qui contiennent un gène sensible aux stéroïdes. À l'aide de ces cellules, vous déterminez l'effet de chacune de ces insertions dans le récepteur sur l'induction du gène sensible aux stéroïdes et sur la liaison de la dexaméthasone stéroïde synthétique. Les résultats de ces analyses sont résumés dans le tableau ci-dessous.

Induction d'insertion Liaison de la dexaméthasone

Un ++++ ++++

B ++++ ++++

C ++++ ++++

D 0 ++++

E 0 ++++

F 0 ++++

G ++++ ++++

H ++++ ++++

je + ++++

J ++++ ++++

K 0 ++++

L 0 ++++

M 0 ++++

N + ++++

O +++ +++++

P ++++ ++++

Q 0 0

R 0 0

S 0 0

type sauvage ++++ ++++

a) À partir de cette analyse, combien de domaines fonctionnels différents le récepteur des glucocorticoïdes possède-t-il ? Indiquer la position de ces domaines par rapport à la carte d'insertion.

b) Quel domaine est le domaine de liaison aux stéroïdes ?

c) Comment pourriez-vous déterminer lequel des domaines est le domaine de liaison à l'ADN ?


La combinaison de réseaux métaboliques régulateurs inférés et reconstruits améliore la prédiction du phénotype chez la levure

Affiliations Laboratoire clé pour la génétique des troubles du développement et neuropsychiatriques (Ministère de l'Éducation), Instituts Bio-X, Université Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, Chine, École des sciences de la vie et de la biotechnologie, Université Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, Chine, Institut des systèmes Biologie, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Center for Infectious Disease Research, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Département de biostatistique, Université de Washington, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Center for Infectious Disease Research, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois, Urbana-Champaign, Illinois, États-Unis d'Amérique Amérique

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Departments of Biology and Microbiology & Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, Californie, États-Unis États d'Amérique

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique, Center for Infectious Disease Research, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, États-Unis d'Amérique


Résumé

L'épissage alternatif des transcrits eucaryotes est un mécanisme qui permet aux cellules de générer une grande diversité de protéines à partir d'un nombre limité de gènes. Les mécanismes et les résultats de l'épissage alternatif des transcrits individuels sont relativement bien compris, et les efforts récents ont été orientés vers l'étude des réseaux d'épissage. Il est devenu évident que les réseaux d'épissage coordonnés régulent le développement des tissus et des organes, et que l'épissage alternatif a des fonctions physiologiques importantes dans différents processus de développement chez l'homme.


Résultats

SARS-CoV-2 RdRp Backtracked Complexes pour Cryo-EM.

Auparavant, les complexes DdRp backtracked (BTC) étaient générés pour les études structurelles par incubation directe de la DdRp avec des échafaudages ADN-ARN contenant des nucléotides non appariés à l'extrémité 3' de l'ARN (27, 28, 30), ces échafaudages BTC se lient à Watson-Crick en aval. paires de bases de l'hybride ARN-ADN positionnées dans le site actif DdRp et le segment 3' simple brin d'ARN mésapparié sortant du tunnel d'entrée DdRp NTP. Pour étudier les RdRp BTC, nous avons donc conçu et testé des échafaudages d'ARN basés sur notre échafaudage RTC SARS-CoV-2 d'origine mais avec trois ou cinq nucléotides de cytosine non appariés ajoutés à l'extrémité 3′ du produit ARN (p-ARN) (BTC3 et BTC5 échafaudages Fig. 1UNE). Les mésappariements consécutifs à l'extrémité 3' de l'ARN-p ont été conçus pour générer des BTC stables et homogènes pour l'analyse biochimique et structurelle. Nous ne proposons pas que les mésappariements consécutifs soient biologiquement pertinents.

Complexe de retour en arrière SARS-CoV-2. (UNE) Échafaudages d'ARN : (Sommet) Échafaudage RTC (14) (Bas) backtrack échafaudages complexes (BTC3 et BTC5). (B) Un essai de déplacement de mobilité électrophorétique sur gel natif révèle que l'holo-RdRp nécessite nsp13 (ADP-AlF3) pour lier efficacement les échafaudages BTC. (C) Structures cryo-EM des BTC SARS-CoV-2. La densité cryo-EM transparente [local-résolution-filtrée (47)] est montrée avec les modèles raffinés superposés (Annexe SI, tableau S1). Les modèles et la densité sont colorés en fonction de la clé. Deux BTC majeurs ont été observés (Annexe SI, Fig. S2), l'un contenant un protomère nsp13 (nsp131-BTC5), et un contenant deux promoteurs nsp13 (nsp132-BTC5). Nous désignons le promoteur nsp13 commun aux deux structures nsp13.1 et l'autre nsp13.2 (14). Les sphères cyan indiquent le chemin du segment 5' de l'ARNt simple brin, dont certains sont engagés avec nsp13.1 dans les deux structures.

Des tests de déplacement de mobilité électrophorétique native ont révélé que bien que l'holo-RdRp (nsp7/nsp82/nsp12) lié l'échafaudage RTC comme observé précédemment (Fig. 1B, voie 1, Annexe SI, Fig. S1UNE, et réf. 14), nsp13 était nécessaire pour une liaison efficace aux échafaudages BTC (Fig. 1B). Des complexes nsp13–holo-RdRp stables avec des échafaudages BTC ont également été observés par spectrométrie de masse native (Annexe SI, Fig. S1 B et C).

La modélisation a suggéré qu'environ cinq nucléotides d'ARN simple brin rétrogradé à l'extrémité 3' de l'ARN p seraient suffisants pour traverser le tunnel d'entrée RdRp NTP. Par conséquent, pour déterminer l'organisation structurelle du SARS-CoV-2 BTC, nous avons assemblé nsp13 (ADP-AlF3) et holo-RdRp avec le BTC5 échafaudage (Fig. 1UNE ci-après dénommé BTC5) et analysé les échantillons par cryo-EM monoparticule. L'échantillon comprenait deux grandes classes : nsp131-BTC5 (résolution nominale de 3,4 Å) et nsp132-BTC5 (3.6 Fig. 1C et Annexe SI, Figues. S2 et S3). L'analyse des deux structures affinées a révélé que la partie RdRp de chaque structure était essentiellement identique (rmsd de 927 nsp12 positions α-carbone <0.3 Å Annexe SI, Tableau S2), tandis que la disposition du protomère commun nsp13 (nsp13.1) était divergente (rmsd de 590 nsp13 positions α-carbone >8 Å Annexe SI, tableau S2). Pour éliminer l'hétérogénéité structurelle dans les sous-unités nsp13 et obtenir une vue à plus haute résolution du BTC, les particules des deux classes ont été combinées et affinées localement à l'intérieur d'un masque appliqué autour de l'holo-RdRp et de l'ARN (à l'exclusion des sous-unités nsp13), conduisant à la BTC5carte combinée (locale) (3.2 Å Fig. 1C et Annexe SI, Figues. S2 et S3 et tableau S1).

Les cartes cryo-EM (Figs. 1C et 2) a révélé deux différences significatives avec les structures nsp13-RTC (14) : 1) L'ARN matrice simple brin en aval (ARNt) engagé avec nsp13.1 a été résolu (Fig. 2UNE), et 2) un segment 3' d'ARN-p simple brin a été extrudé dans le tunnel d'entrée RdRp NTP (Fig. 2B).

Cartes de densité cryo-EM. (UNE, La gauche) Vue d'ensemble de nsp132-BTC5. Nsp13.2 est supprimé (contour) pour plus de clarté. La zone encadrée est agrandie sur la droite. (UNE, Droit) Vue agrandie du segment t-ARN (+14-5′-CCCAUGU-3′-+8) enfermé dans la sous-unité d'hélicase nsp13.1. La carte de densité cryo-EM (du nsp132-BTC structure) pour l'ARN est affiché (maille bleue). (B, La gauche) Vue d'ensemble de la CTB5structure (locale). La zone encadrée est agrandie sur la droite. (B, Droit) Vue agrandie de la région autour du site actif de RdRp, montrant le t-ARN (cyan) et le p-ARN (rouge) avec le segment d'ARN rétrogradé. La carte de densité cryo-EM pour l'ARN [de BTC5(local)] s'affiche (maille bleue). (C) BTC5Cartes de densité cryo-EM (locales) autour des motifs conservés nsp12 F, C et E. Les résidus sélectionnés sont marqués.

Nsp13 se lie à l'ARNt simple brin en aval.

Dans le nsp131-BTC5 et nsp132-BTC5 cartes cryo-EM, le segment 5' simple brin de l'ARNt a été engagé avec nsp13.1. Cette région de la densité cryo-EM était bien résolue (Fig. 2UNE), permettant l'identification du segment t-ARN engagé dans l'hélicase comme +14 à +8 (numérotation définie dans la Fig. 1UNE), 5′ CCCAUGU 3′ . Le segment de cinq nucléotides reliant le t-ARN entre l'hélicase et le RdRp (+7 à +3) était désordonné et non modélisé.

Le tunnel d'entrée SARS-CoV-2 RdRp NTP s'adapte à l'ARN rétrogradé.

Les cartes cryo-EM ont également résolu un segment de p-ARN 3' simple brin du BTC5 échafaudage extrudé dans le tunnel d'entrée RdRp NTP (Fig. 2B), confirmant la formation d'un BTC (Fig. 3UNE). L'architecture globale du SARS-CoV-2 BTC est analogue aux BTC DdRp (Fig. 3 et réf. 14). L'hélice de pont DdRp (BH) (35) sépare la fente du site actif DdRp en un canal pour l'ADN matrice en aval (au-dessus du BH Fig. 3B) et le tunnel d'entrée NTP (sous le BH Fig. 3B). De même, le motif viral RdRp F (Annexe SI, illustration S4UNE et réf. 32) sert d'élément structurel de séparation des brins pour l'ARN rétrogradé (Fig. 3UNE). L'ARNt en aval passe au-dessus du motif F, tandis que l'ARN rétrograde sort du tunnel d'entrée du NTP sous le motif F (Fig. 3UNE).

BTC SARS-CoV-2 RdRp et DdRp. (UNE et B) SARS-CoV-2 RdRp (UNE) et DdRp (B) BTC. (Sommet) Les protéines sont représentées sous forme de surfaces moléculaires transparentes et les acides nucléiques sous forme de sphères atomiques. Les régions encadrées sont agrandies en bas. (Bas) Vue en coupe agrandie. Les protéines sont représentées sous forme de surfaces moléculaires et d'acides nucléiques sous forme de bâtonnets avec une surface moléculaire transparente. (UNE) Le SARS-CoV-2 BTC5(local). Nsp8a et nsp12 sont affichés (nsp7 et nsp8b sont supprimés pour plus de clarté). Le motif Nsp12 F est représenté sous la forme d'un ruban d'épine dorsale magenta (Sommet). ARN rétrograde (+1C à +3C du BTC5-échafaudage Fig. 1UNE) extrude le tunnel d'entrée NTP. (B) Un DdRp (Saccharomyces cerevisiae Pol II) BTC [Protein Data Bank (PDB) ID code 3PO2 (29)]. Le BH est représenté sous la forme d'un ruban de squelette magenta. L'ARN rétrogradé sort du tunnel d'entrée NTP/canal secondaire/entonnoir. (C) Vues de l'extérieur dans les tunnels d'entrée NTP du SARS-CoV-2 (La gauche) Et un S. cerevisiae DdRp [Code d'identification PDB 3GTP (27)] BTC. Les surfaces des protéines sont colorées par le potentiel de surface électrostatique [calculé à l'aide de l'APBS (48)]. L'ARN rétrogradé est représenté sous forme de sphères atomiques avec des atomes de carbone jaunes.

Le tunnel d'entrée RdRp NTP fournit un environnement stérique et électrostatique propice à la canalisation de l'ARN rétrogradé hors du site actif sans interactions protéine polaire-ARN spécifiques qui pourraient entraver le mouvement de l'ARN (Fig. 3C et 4). La comparaison du potentiel de surface électrostatique des tunnels d'entrée NTP du SARS-CoV-2 RdRp avec des DdRps eucaryotes et bactériens révèle un environnement de surface électrostatique global similaire qui peut faciliter l'entrée d'ARN en retour (Fig. 3C et Annexe SI, illustration S4B), y compris une « piste » de résidus Arg et Lys conservés chargés positivement du motif F (SARS-CoV-2 nsp12 K545, K551, R553 et R555 Fig. 4 et Annexe SI, illustration S4UNE). Les résidus conservés des motifs RdRp C et E complètent l'environnement du tunnel d'entrée du site actif/NTP entourant l'ARN rétrogradé (Fig. 4 et Annexe SI, illustration S4UNE).

Interactions protéine-ARN dans le BTC. (UNE, Sommet) Vue d'ensemble du BTC5(local). Les protéines sont représentées comme des surfaces moléculaires transparentes et les acides nucléiques comme des sphères atomiques. Nsp8a et nsp12 sont affichés (nsp7 et nsp8b sont supprimés pour plus de clarté). Les motifs Nsp12 C, E et F sont représentés sous forme de rubans d'épine dorsale (colorés selon la clé en bas). La région encadrée est agrandie ci-dessous. (UNE, Bas) L'ARN est représenté de -2 à +3. Les protéines sont représentées comme des surfaces moléculaires transparentes. Les motifs RdRp C, E et F sont représentés sous forme de rubans de squelette transparents (colorés selon la clé) avec des chaînes latérales de résidus qui s'approchent de l'ARN rétrogradé (≤4,5 ) illustré. (B) Schéma illustrant les mêmes interactions protéine-ARN que UNE. Dessiné à l'aide de Nucplot (49).

Dans les nsp13-RTC, l'échafaudage RTC (Fig. 1UNE) est lié dans un état post-transloqué (14) le 3'-p-ARN A est apparié en base au t-ARN U au site -1 près du nsp12-D760 catalytique (Fig. 5UNE). La base t-ARN suivante (A à +1) est positionnée pour recevoir le substrat NTP entrant, mais le site pour le substrat NTP entrant est vide (Fig. 5UNE). En revanche, les structures BTC ont été transloquées d'une paire de bases par rapport aux RTC la paire de bases correspondant à la paire de bases A-U Watson-Crick à l'extrémité 3' du p-ARN (situé dans le site -1 des RTC ) était en position -2 des BTC (Figs. 1UNE, 4 et 5B). La position -1 du BTC était occupée par le premier mésappariement C-A le p-ARN -1C a fait une liaison hydrogène non Watson-Crick avec l'ARN t A opposé (Figs. 4 et 5B). Les trois nucléotides d'ARN-p non appariés suivants (+1C, +2C et +3C) se sont retrouvés dans le tunnel d'entrée du NTP (Figs. 4 et 5B). Le nucléotide 3' du BTC5 échafaudage p-ARN (+4C Fig. 1UNE) était exposé au solvant à l'extrémité tournée vers l'extérieur du tunnel d'entrée du NTP et manquait de densité et n'a donc pas été modélisé (Fig. 2B). La trajectoire des nucléotides reculés aux positions +1/+2 était fortement courbée en raison des contraintes spatiales des résidus du motif F (Fig. 4UNE).

Comparaison de l'ARN proximal du site actif dans les structures RTC et BTC et à partir de simulations d'un nucléotide mésapparié à l'extrémité 3' du p-ARN. (UNE et B) Comparaison de l'ARN proximal du site actif dans le RTC [UNE Code d'identification PDB 6XEZ (14)], BTC5(locale) (B), et à partir d'instantanés sélectionnés de simulations de dynamique moléculaire d'un complexe -1U + 1C (C). Les schémas indiquent les nucléotides montrés dans le contexte du RTC (UNE) et BTC5 échafaudages (B séquences d'échafaudage complètes illustrées à la figure 1UNE) ou généré à partir du BTC5 échafaudage pour les simulations (C). Les atomes de carbone du t-ARN sont colorés en cyan et le p-ARN sont de couleur saumon, sauf dans le cas des Cs mésappariés à l'extrémité 3', qui sont colorés en rouge foncé. Les liaisons hydrogène d'appariement de bases Watson-Crick sont désignées par des lignes pointillées gris foncé, d'autres liaisons hydrogène par des lignes pointillées rouges. Le motif Nsp12 C est représenté par un ruban de squelette jaune-orange et la chaîne latérale de D760 est représentée par des sphères atomiques. (UNE) Le RTC est dans un état post-transloqué, avec la paire de bases A–U à l'extrémité 3′ de l'ARN-p en position -1 (14). (B) Le CTB5L'ARN (local) est transloqué par rapport au RTC la paire de bases correspondant à A–U à l'extrémité 3' de l'ARN RTC en position -1 est en position -2 de l'ARN BTC. Un mésappariement C-A occupe le site BTC -1. Le chemin Cs non concordant +1, +2 et +3 dans le tunnel d'entrée RdRp NTP (indiqué par des lignes ondulées noires). Le +4C (présent dans le BTC5 échafaudage Fig. 1UNE) est exposé au solvant, désordonné et non modélisé. (C) Simulations de dynamique moléculaire du nsp132–BTC-1U+1C complexe. Le complexe a été simulé avec trois répétitions (traces vertes, bleues et orange). Les valeurs Rmsd tracées en fonction du temps représentent la RMSd des atomes lourds du +1C du p-ARN par rapport à la configuration de départ (Matériaux et méthodes). Les histogrammes rmsd (tracés sur la droite) sont un agrégat des trois réplicats. Deux structures tirées d'une des simulations sont présentées, l'une montrant le +1C du p-ARN dans le site actif (t = 0 s) et l'autre montrant le +1C effiloché dans le tunnel d'entrée NTP (t = 4,5 µs).

Nsp13 stimule le retour en arrière.

L'holo-RdRp de type sauvage SARS-CoV-2 nécessitait l'hélicase nsp13 pour lier efficacement les échafaudages BTC (Fig. 1B). Cependant, nous avons observé que l'holo-RdRp contenant nsp12 avec une seule substitution d'acide aminé (D760A) ne nécessitait pas nsp13 pour lier les échafaudages BTC (Annexe SI, Fig. S1UNE, voie 4). Nsp12-D760 est un résidu conservé du motif RdRp C qui chélate un ion Mg 2+ crucial dans les complexes catalytiques (Annexe SI, illustration S4UNE et réf. 32), mais dans les structures RdRp dépourvues de substrat (y compris les structures BTC), les ions Mg 2+ sont absents (14, 36, 37). Les résidus catalytiques Asp des DdRps chélatent typiquement l'ion Mg 2+ même en l'absence de substrat (31, 38), et ce Mg 2+ est retenu dans les structures rétrogrades DdRp (27 ⇓ –30). Nos structures RdRp BTC suggèrent qu'en l'absence d'un ion Mg 2+ D760 présente une barrière électrostatique au squelette phosphate de l'ARN rétrogradé (Fig. 5B), expliquant la nécessité pour l'hélicase de surmonter cette barrière et pourquoi la suppression du D760 stabilise la liaison aux échafaudages BTC.

Pour générer les BTC SARS-CoV-2 pour les études structurelles, nous avons utilisé le BTC5 échafaudage avec cinq Cs non appariés à l'extrémité 3' de l'ARN-p (Fig. 1UNE). Pour étudier la formation de BTC SARS-CoV-2 à partir d'un échafaudage RTC (extrémité 3' de l'ARN p appairé entièrement Watson-Crick), nous avons analysé la réticulation induite par l'ultraviolet (UV) à partir de l'avant-dernier incorporé au 4-thio-U. à l'extrémité 3' de l'ARN-p [RTC(4-thio-U)-échafaudage Annexe SI, illustration S5UNE et réf. 39]. La réticulation était absolument dépendante de la présence de 4-thio-U dans l'ARN, établissant la spécificité (Annexe SI, illustration S5B). Les RTC assemblés avec la nsp12 de type sauvage et l'échafaudage RTC (4-thio-U) ont donné une faible réticulation nsp12-ARN lors de l'exposition aux UV (Annexe SI, illustration S5UNE, voie 1). Ces conditions favorisent un RTC post-transloqué (14, 36, 37) avec le 4-thio-U séquestré dans l'hybride ARN-ARN et donc non disponible pour la réticulation protéine-ARN. La réticulation de l'ARN-p à nsp12 a été considérablement augmentée par l'ajout de nsp13 avec 2 mM d'adénosine 5′-triphosphate (ATP) (Annexe SI, illustration S5UNE, voie 2). Dans ces conditions, nous proposons que l'activité de translocation de nsp13 ait fait reculer une fraction des complexes, libérant le 4-thio-U de l'hybride ARN-ARN pour la réticulation vers nsp12. La réticulation en présence de nsp13 mais en l'absence d'ATP réduit la réticulation de nsp12 (Annexe SI, illustration S5UNE, voie 7 contre voie 2), soutenant la proposition selon laquelle l'activité de translocation nsp13 facilite le retour en arrière. Remplacement de nsp12 de type sauvage par nsp12-D760A (nsp12* Annexe SI, illustration S5UNE, voies 4 à 6, 9 et 10), ce qui est plus sujet au retour en arrière (Annexe SI, Fig. S1UNE), a montré les mêmes tendances mais avec une augmentation de la réticulation de l'ARN nsp12 dépendante des UV, la réticulation maximale se produisant dans les conditions censées favoriser le plus le retour en arrière (Annexe SI, illustration S5UNE, voie 5). Ces résultats confirment l'opinion selon laquelle nsp13 facilite le retour en arrière du SARS-CoV-2 RdRp.

Un nucléotide incompatible à l'extrémité 3' de l'ARN-p s'effiloche spontanément et entre dans le tunnel d'entrée RdRp NTP.

Le SARS-CoV-2 RTC est une réplicase/transcriptase hautement processive et rapide, capable de répliquer une matrice d'ARN 1-kb à un taux moyen de ∼170 nt/s (40). Cependant, des études sur d'autres RdRps viraux suggèrent qu'une mauvaise incorporation ralentit le taux d'allongement global et peut induire un retour en arrière (41 ⇓ -43). Nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire pour explorer le devenir d'un nucléotide mésapparié incorporé à l'extrémité 3' de l'ARN-p. Commencer par le nsp132-BTC5 structure, le -1C a été muté en U, et les +2 à +4 Cs ont été supprimés. L'ARN-p prétransloqué résultant avait un -1U correspondant et un +1C non apparié (-1U + 1C Fig. 5C). Dans trois simulations de 5 s, nous avons observé le +1C mésapparié en 3′ alternant entre deux positions, soit restant à proximité du site actif (rmsd <3.5 Å) soit s'effilochant de l'hybride p-ARN:t-ARN vers ou dans le tunnel d'entrée NTP (rmsd >3.5 Fig. 5C). Sur la base de l'analyse des simulations agrégées -1U + 1C, le +1C non apparié a passé environ 40 % du temps près du site actif et environ 60 % du temps effiloché vers ou dans le tunnel d'entrée du NTP. Dans les simulations de contrôle avec une extrémité 3′ du p-ARN entièrement appariée (−1U + 1U), le +1U apparié à l'extrémité 3′ du p-ARN ne s'effilochait pas et passait 100 % du temps dans la poche du site actif (Annexe SI, fig. S6).

Nucléotides −36 à +14 du BTC5 échafaudage t-ARN (tel que défini dans la Fig. 1UNE) ont été inclus dans les simulations. Les régions liées à nsp13.1 (+8 à +14) et à nsp12 (-36 à +2) étaient stables au cours de la période de simulation. Les nucléotides de l'ARNt +3 à +7 (la partie reliant l'ARNt lié à la nsp12 et à la nsp13.1) étaient très dynamiques, ce qui correspond à l'absence de densité cryo-EM bien définie pour cette région de la t -ARN. On note que les simulations renseignent sur le cheminement des ARN effilochés mais pas sur le rôle de nsp13 dans le backtracking.


E-4. Analyse comparative de l'expression génique basée sur des modules : coexpression évolutive conservée chez Bacillus subtilis et Escherichia coli

Zarrineh P XE "Zarrineh P" (1,*), Fierro C XE "Fierro C" (2), Sánchez-Rodríguez A XE "Sánchez-Rodríguez A" (2), De Moor B XE "De Moor B" (1), Marchal K XE "Marchal K" ( 2)

Des recueils d'expression de plus en plus à grande échelle pour différentes espèces deviennent disponibles. En exploitant la modularité du réseau de coexpression, ces recueils peuvent être utilisés pour identifier des voies ou des processus pour lesquels le comportement d'expression est conservé entre différentes espèces. Cependant, comparer les réseaux de modules à travers les espèces n'est pas anodin car la définition d'un module biologiquement vrai n'est pas fixe, mais dépend du seuil de distance qui définit le degré de coexpression avec les modules.

Matériaux et méthodes

Nous avons développé une approche de cocluster inter-espèces COMODO (COnserved MODules across Organisms). COMODO utilise en entrée des données de microarray et une cartographie d'homologie entre les gènes et fournit en sortie des paires de modules conservés. COMODO recherche des modules de coexpression conservés dans des recueils d'expression de microarrays hétérogènes. Les tailles de modules sont sélectionnées de manière à maximiser le nombre d'orthologues qui relient les deux modules par rapport au nombre total de gènes dans chaque module qui contribuent à une paire de modules conservée.

Résultats

Nous avons appliqué notre méthodologie pour étudier la conservation de la coexpression entre Escherichia coli et Bacillus subtilis. Nous avons identifié plusieurs voies et processus pour lesquels la coexpression transcriptionnelle a été conservée sur la longue distance évolutive qui sépare les deux organismes procaryotes. Comme on pouvait s'y attendre, les opérons semblaient être l'un des principaux mécanismes garantissant le comportement de coexpression entre les gènes, non seulement au sein d'une espèce, mais également entre les espèces. Le mécanisme par lequel les gènes étaient corégulés transcriptionnellement semblait être beaucoup moins conservé que leur comportement de coexpression lui-même.

Discussion

Nous avons développé une méthode pour rechercher des modules conservés entre deux espèces. L'application de cette méthode a permis de détecter les deux processus pour lesquels le comportement d'expression est conservé sur la grande distance évolutive qui sépare E. coli de B. subtilis ou lorsque des sous-parties des processus diffèrent en termes d'expression. d'utiliser le meilleur coup d'explosion réciproque bidirectionnel, il offre la possibilité de rechercher des relations d'orthologie fonctionnellement vraies.

Peyman Zarrineh ( Cette adresse e-mail est protégée contre les robots des spammeurs, vous devez activer le JavaScript pour la visualiser )

Katholieke Universiteit Leuven

Affiliations d'auteurs

(1) Département de génie électrique, Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 10, 3001 Leuven, Belgique. (2) Département des systèmes microbiens et moléculaires, Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 20, 3001 Leuven, Belgique.

Remerciements

Ce travail est soutenu par : 1) KUL : GOA AMBioRICS, GOA/08/011, CoE EF/05/007, SymBioSys CREA/08/023 2) IWT : SBO-BioFrame 3) IUAP P6/25 (BioMaGNet) 4) FWO IOK-B9725-G.0329.09 5) ZKB8933/CREA/08/023/BOF, 6) HFSP-RGY0079/2007C.


Conclusion

La recherche a fourni des isoformes pleine longueur à l'échelle du transcriptome de P.americana et P.icosandra, fournissant des informations sur le succès invasif de P.americana. Des lignes directrices pour la sélection de gènes de référence appropriés sous différents tissus dans une espèce végétale ou parmi des espèces végétales variées ont été recommandées en outre. Aucun gène particulier n'a été exprimé de manière constante dans différentes conditions expérimentales indiquant la nécessité d'une identification de gène de référence. Ces résultats faciliteraient l'exploration d'études de génomique fonctionnelle et comparative chez les Phytolaccaceae pour mieux comprendre la biologie végétale.


Matériaux et méthodes

Tableau des réactifs et des outils

Réactif/Ressource Référence ou source Identifiant ou numéro de catalogue
Modèles expérimentaux
C57BL/6J (M. musculus) Rivière Charles C57BL/6J
C57BL/6J (M. musculus) Nfil3 −/− van der Kallen et al ( 2015 ) N / A
Cellules AML12 (M. musculus) ATCC CRL-2254
HEK293 (H. sapiens) ATCC CRL-1573
ADN recombinant
pcDNA3.1-mNFIL3 Addgene Chat # 34572
pSGG5-hHNF4A Suaud et al ( 1999 ) N / A
Anticorps
Exemple: Lapin-anti-H3 Abcam Chat # ab1791
ACTB Sigma-Aldrich Cat # A5441 (WB)
BRD4 Laboratoires éthyliques Cat # A301-985A100 (puce)
BRD4 Wu et al ( 2006 ) S.O. (BM)
DDIT3 Santa Cruz N° de chat sc7351 (WB)
FOXA2 Abcam N° de chat ab23630 (WB, WES)
Histone H3 La signalisation cellulaire CST 3638S (WB)
H3K27ac Motif actif N° de chat 39685 (puce)
HNF4A Persée Cat # PP-H1415-00 (WB, WES)
LMNA Santa Cruz Cat # sc20681 (WB, WES)
NFIL3 La signalisation cellulaire Cat # CST 14312S (WB)
NR1H4 Persée Cat # PP-A9033A-00 (WB)
p-Y416-SRC La signalisation cellulaire Cat # CST 6943S (WB)
SRC La signalisation cellulaire Cat # CST 2109S (WB)
XBP1 La signalisation cellulaire Cat # CST 12782S (WES)
TFIIB Santa Cruz N° de chat sc7225 (WB)
EP300 Motif actif N° de cat. 61401 (IP)
EP300 Santa Cruz Cat # sc-585 (WES)
IgG Santa Cruz Cat # sc-2025 (IP)
Anti-souris conjugué à HRP Sigma-Aldrich Cat # A4416 (WB)
Anti-lapin conjugué à HRP Sigma-Aldrich Cat # A0545 (WB)
Module de séparation Wes de 12 à 230 kDa ProtéineSimple Cat# SM-W004
Module de séparation Jess ou Wes de 66 à 440 kDa ProtéineSimple N° de chat SM-W008
Oligonucléotides et réactifs à base de séquences
Amorces qPCR Cette étude Tableau EV5
Produits chimiques, enzymes et autres réactifs
Exemple: T7 Endonucléase I Biolabs de la Nouvelle-Angleterre N° de chat M03020S
Thapsigargin Sigma-Aldrich N° de chat T9033
Tunicamycine Sigma-Aldrich N° de chat T7765
MG132 Sigma-Aldrich N° de chat M7449
PP2 Sigma-Aldrich N° de chat P0042
Cycloheximide Sigma-Aldrich N° de chat C7698
JQ1 Sigma-Aldrich N° de chat SML1524
Trichostatine A Sigma-Aldrich N° de chat T8552
C646 Sigma-Aldrich N° de chat SML0002
MZ1 Tocris Chat # 6154
TUDCA Sigma-Aldrich N° de chat T0266
AAP Sigma-Aldrich N° de chat SML0309
STF083010 Sigma-Aldrich N° de chat SML0409
ISRIB Sigma-Aldrich N° de chat SML0843
AEBSF Euromedex Chat # 50985
jetPEI Transfection Polyplus Chat # 101-40
Kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité Biosystèmes appliqués N° de chat 4368813
Brilliant II Sybr Green QPCR Master mix Biotechnologies Agilent N° de chat 600831
Glutarate de disuccinimidyle (DSG) Thermo Fischer Scientifique N° de chat 20593
Formaldéhyde Sigma-Aldrich N° de chat F8775
Benzonase Sigma-Aldrich N° de chat E1014
Protéine A Sépharose GE Santé N° de chat GE17-1279-01
Protéine G Sépharose GE Santé N° de chat GE17-0618-01
Cocktail complet d'inhibiteurs de protéase Roche N° de chat 11836145001
Cocktail d'inhibiteur de phosphatase Sigma-Aldrich N° de chat P044
Protéinase K Qiagen Chat # 19133
ARNt Sigma-Aldrich N° de chat R5636
Médium de William (MPH) Lonza N° de chat BE12761F
DMEM/F12 (AML12) Néerlandais N° de chat P04-41250
DMEM (HEK293) Gibco-Life Technologies Chat #31966
Collagène Roche N° de chat 11179179001
Collagénase Sigma-Aldrich N° de chat C5138
ARNt de levure Sigma-Aldrich N° de chat R5636
Extraire tout (Trizol) Eurobio GEXEXT04-0U
Logiciel
Partek Genomics Suite 6.6 Partek N / A
DESéq 1.26.0 Anders et Huber (2010) N / A
FactoMineR 1.41 et al ( 2008 ) N / A
STIM v1.3.11 Ernst et al ( 2005 ) N / A
GÉANT Vandel et al ( 2018 ) N / A
Galaxie Afgan et al ( 2018 ) N / A
R Équipe de base R ( 2015 ) N / A
paquet aplpack v1.3.2 R Équipe de base R ( 2015 ) N / A
Suite ToppGene Chen et al ( 2009 ) N / A
GSEA v3.0 Subramanien et al ( 2005 ) N / A
BubbleGUM v1.3.19 Spinelli et al ( 2015 ) N / A
Nœud papillon 2 Langmead et Salzberg ( 2012 ) N / A
Navigateur de génome intégré (IGB 9.0.1) Libérer et al ( 2016 ) N / A
MACS2 Chen et al ( 2015 ) N / A
Classement des Super-Enhancers (ROSE) Aimé et al ( 2013 ), Whyte et al ( 2013 ) N / A
csaw v1.6.1 Lun et Smyth (2014, 2016) N / A
Analyse de chevauchement de locus (LOLA 1.4.0) Sheffield et Bock (2016) N / A
gplots v3.0.1 Warnes et al ( 2016 ) N / A
package graphique R Équipe de base R ( 2015 ) N / A
Prisme v5 et 8 GraphPad N / A
GeneSnap v7.12.06 Syngène N / A
Studio d'images Lite v5.2 LI-COR Biosciences N / A
Boussole ProtéineSimple N / A
bioDBnet Mudunuri et al ( 2009 ) N / A
Autre
Trieur d'afflux Becton Dickinson N / A
Bioanalyseur Agilent 2100 Biotechnologies Agilent N / A
MoGene-2_0-st Affymetrix N / A
Scanner GeneChip™ 3000 7G Biosystèmes appliqués N° de chat 00-0210
Station fluidique GeneChip™ 450 Biosystèmes appliqués N° de chat 00-0079
Biorupteur Pico Diagénode N° de chat B01060010
Kit de purification PCR MinElute Qiagen N° de chat 2800
Activité ALT Thermo Fischer Scientifique N° de chat 981769
Activité AST Thermo Fischer Scientifique N° de chat 981771
KONELAB 20 Thermo Fischer Scientifique N° de chat 981801
Illumina Hi-Seq 4000 Illumina N / A
G-box Syngène N / A
Western simple, système WES ProtéineSimple N / A
Système de transcription/traduction à couplage rapide TnT® Promega N° de chat L5020
Système d'imagerie iBright™ CL1500 Thermo Fischer Scientifique A44240

Méthodes et protocoles

Culture de cellules

La lignée cellulaire d'hépatocytes de souris immortalisée AML12 a été obtenue auprès de l'ATCC (CRL-2254) et cultivée comme décrit précédemment (Ploton et al, 2018 ). Des hépatocytes primaires de souris (MPH) ont été préparés à partir de foies de souris mâles C57BL/6J âgées de 10 semaines (Charles River) comme décrit dans Bantubungi et al (2014) et cultivées sur des plaques recouvertes de collagène dans du milieu William sans sérum (Ploton et al, 2018 ). Des cellules non parenchymateuses (NPC) provenant des mêmes foies ont été obtenues par centrifugation différentielle. Brièvement, les homogénats de foie obtenus après perfusion ont été pressés à travers une passoire cellulaire de 70 µm et centrifugés pendant 5 min à 27 g. Les pastilles issues de cette première centrifugation ont été lavées et centrifugées à nouveau 2 fois pendant 5 min à 27 g pour obtenir la fraction MPH. Les surnageants de la première centrifugation ont été collectés et centrifugés 5 min à 400 g pour obtenir la fraction NPC. La séparation de MPH et de NPC a été confirmée en surveillant l'expression de gènes marqueurs sélectionnés (Annexe Fig S2D). Le traitement du stress aigu du réticulum endoplasmique (ERS) dans le MPH est défini comme un traitement de 4 heures avec 1 M de thapsigargine. Le véhicule (0,04 % de DMSO) a été utilisé comme témoin. Dans toutes les figures de cette étude, l'ERS en MPH est défini comme un traitement de 4 h avec 1 M de thapsigargine, sauf indication contraire (des temps de traitement plus courts ou plus longs avec des concentrations différentes ont également été utilisés dans certaines expériences comme spécifiquement indiqué dans les figures et leurs légendes). Les expériences impliquant MZ1 ou JQ1 ont été réalisées en pré-traitant MPH pendant 3 h avec 0,01, 0,1 ou 1 M de MZ1 ou 1 h avec 500 nM de JQ1 avant l'ajout de 1 M de thapsigargine pendant 4 h. Des expériences impliquant C646 ont été réalisées en co-traitant MPH avec 5, 10 ou 20 M de C646 et 1 M de thapsigargine pendant 4 h. Des expériences impliquant la trichostatine A ont été réalisées en co-traitant MPH avec 1 M de trichostatine A et 1 M de thapsigargine pendant 4 h. Des expériences impliquant du cycloheximide ont été réalisées en co-traitant du MPH avec 0, 1 ou 10 g/ml de cycloheximide et 1 M de thapsigargine pendant 4 h. Des expériences impliquant PBA, ISRIB, MG132 ou PP2 ont été réalisées en pré-traitant MPH pendant 30 min avec 5 mM de PBA, 1 M d'ISRIB, 10 M de MG132 ou 10 M de PP2 avant l'ajout de 1 M de thapsigargine pendant 1 ou 4 h. Des expériences impliquant des inhibiteurs des trois bras de l'UPR ont été réalisées en pré-exposant des cellules AML12 à 30 M de STF083010, 200 M d'ISRIB ou 100 M d'AEBSF pendant 2 h puis en les traitant pendant 4 h avec 1 M de thapsigargine ou 2 g/ml tunicamycine.

Des hépatocytes isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ont été obtenus en exécutant directement la fraction MPH dans un trieur Influx (Becton Dickinson) équipé d'une buse de 200 m et réglé à une pression de 3,6 psi et une fréquence de 6,3 kHz. La pression du fluide de l'échantillon a été ajustée pour atteindre un taux d'événements de 2 000 événements/s. Les hépatocytes ont été identifiés comme des événements FSChi SSChi et triés sur un mode « pur » avec une efficacité de tri de 80 %.

Les cellules HEK293 ont été cultivées comme dans Ploton et al ( 2018 ) et transfecté à l'aide de jetPEI (Polyplus Transfection) selon les instructions du fabricant.

Produits chimiques

Tous les produits chimiques utilisés dans cette étude sont fournis dans le tableau Réactifs et outils.

Expériences animales

Des souris mâles C57BL/6J de type sauvage (WT) ont été achetées à Charles River à l'âge de 8 semaines et logées dans des cages standard dans une pièce à température contrôlée (22-24°C) avec un cycle obscurité-lumière de 12 h. Ils avaient ad libitum accès à l'eau du robinet et à la nourriture standard et ont été autorisés à s'acclimater pendant 2 semaines avant le début du protocole expérimental. L'ERS a été induite par injection intrapéritonéale de tunicamycine en utilisant 1 g/g de poids corporel de souris (Sigma-Aldrich, #T7765) ou un véhicule (dextrose 150 mM), et le foie a été prélevé 8 h plus tard (cinq souris par groupe). Les Nfil3 Les souris −/− (NFIL3 KO) utilisées dans cette étude (fond C57BL/6J) ont été précédemment décrites (van der Kallen et al, 2015 ). Des compagnons de portée WT ont été utilisés comme témoins. Des souris âgées de 10 semaines ont été traitées avec de la tunicamycine ou un véhicule comme décrit ci-dessus, et le foie a été prélevé 8 h après l'injection (huit souris par groupe). Pour induire l'ERS dans le muscle, 30 g de tunicamycine ont été injectés par voie intramusculaire dans le muscle gastrocnémien. La jambe controlatérale a été injectée avec une solution saline et utilisée comme contrôle. Les muscles ont été prélevés 24 h après l'injection (neuf souris par groupe).

Deux modèles différents de sepsis ont été utilisés. Pour le modèle d'injection bactérienne (BIM) du sepsis (sepsis BIM ), des souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 8 × 10 8 UFC de vivant E. coli Les bactéries (DH5α) ou PBS (témoins) et le foie ont été prélevés 16 h plus tard (six souris par groupe). Dans une expérience distincte, les souris ont été prétraitées pendant 4 jours consécutifs avec de l'acide tauroursodésoxycholique (injection intrapéritonéale de TUDCA de 500 mpk/jour) ou un véhicule (PBS) suivi d'une injection bactérienne 2 h après la dernière administration de TUDCA le quatrième jour (10 souris par groupe), et sacrifié 6 h après l'injection bactérienne, ce qui est suffisant pour induire la perte de TF de LIVER-ID (Annexe Fig S22C). Pour le modèle de septicémie par ligature et ponction caecale (CLP) (septicémie CLP ), des souris mâles de type sauvage C57BL/6J âgées de 24 semaines ont été réparties au hasard dans la septicémie CLP ou un contrôle sain nourri par paire et sacrifiées après 10, 30 h, ou 3 jours (15 souris par groupe par point de temps). Les souris des groupes CLP sepsis ont été soumises à une CLP à ponction unique suivie d'une réanimation liquidienne par voie intraveineuse comme décrit précédemment (Derde et al, 2017 ). Brièvement, les souris ont été anesthésiées, un cathéter a été inséré dans la veine jugulaire centrale, et la procédure chirurgicale CLP a été réalisée (ligature à 50 % du caecum à la moitié de la distance entre le pôle distal et la base du caecum et une seule ponction à travers -and-through) suivie d'une réanimation liquidienne par voie intraveineuse. Elles ont reçu des analgésiques et des antibiotiques 6 h après la CLP puis toutes les 12 h pour le reste de l'expérience et les souris du groupe « jour 3 » (phase prolongée) ont reçu une nutrition parentérale dès le matin après la chirurgie pour imiter la situation clinique humaine . Les données rapportées pour la conception CLP du sepsis correspondent au point de temps de 10 h (phase aiguë), sauf indication contraire. Des souris saines nourries par paires ont été utilisées comme contrôle.

Toutes les études animales ont été réalisées conformément aux spécifications de l'UE concernant l'utilisation d'animaux de laboratoire et approuvées par le Comité d'éthique du Nord-Pas de Calais (pour les traitements ERS et la conception BIM du sepsis) ou le Comité d'éthique de la KU Leuven (P093/2014) (pour les la conception CLP du sepsis).

Analyses biochimiques

Les activités plasmatiques d'aspartate aminotransférase (AST) et d'alanine aminotransférase (ALT) ont été déterminées par des dosages colorimétriques (Thermo Fischer Scientific) en utilisant du sérum obtenu après prélèvement sanguin rétro-orbital.

Analyses PCR quantitatives en temps réel de l'expression des gènes

L'extraction d'ARN, la transcription inverse et la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) ont été effectuées comme décrit précédemment (Dubois-Chevalier et al, 2017 ). Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau EV5. Toutes les amorces ont été conçues pour s'hybrider à différents exons, et la génération d'amplicons corrects uniques a été vérifiée par dissociation de la courbe de fusion. Les niveaux d'expression des gènes murins ont été normalisés à l'aide d'hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase (Hprt) (expériences de septicémie CLP) ou de cyclophiline A (PPia) (toutes les autres expériences) des niveaux d'expression génique de ménage comme contrôle interne. Les niveaux d'expression des gènes humains ont été normalisés à l'aide d'ARN ribosomique 18S (ARN18S5). Pour les analyses d'expression génique, in vitro les expériences (AML12 et MPH) ont été répétées au moins trois fois (expériences indépendantes), chaque expérience étant réalisée en triple technique. Pour in vivo souris, nous avons utilisé au moins cinq animaux par condition expérimentale (génotype ou traitement). Le nombre de répétitions biologiques est indiqué dans les légendes des figures.

Puces d'expression génique

L'ARN a été extrait du MPH traité pendant 4 h avec 1 M de thapsigargine (trois expériences indépendantes), des foies de compagnons de portée NFIL3 KO et WT traités pendant 8 h avec 1 g/g de tunicamycine (cinq souris par génotype par traitement), ou des muscles gastrocnémiens de WT souris traitées pendant 24 h avec 30 g de tunicamycine (muscles de contrôle traités et controlatéraux de neuf souris) et a été vérifiée en quantité et en qualité à l'aide du bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Biotechnologies) avant d'être traitée pour analyse à l'aide de puces MoGene-2_0-st Affymetrix selon les instructions du fabricant. Les données ont été analysées comme décrit ci-après et ont été soumises à GEO sous le numéro d'accès GSE122508.

Analyses de données transcriptomiques

Indice de spécificité hépatique

L'indice de spécificité hépatique a été calculé comme la différence d'expression normalisée dans le foie et la moyenne d'expression normalisée dans les tissus témoins en utilisant les données de BioGPS (tableau EV6).

Normalisation des puces à ADN et identification des gènes différentiellement exprimés

Les données transcriptomiques brutes des puces à ADN Affymetrix ont été normalisées avec Partek Genomics Suite 6.6 à l'aide d'une correction de fond par Robust Multi-array Average (RMA), d'une normalisation quantile et d'une synthèse via un polissage médian. Des analyses en composantes principales (ACP) ont été utilisées pour le contrôle de la qualité des données. Les valeurs RMA ont également été utilisées pour afficher les changements d'expression pour les ensembles de gènes sélectionnés dans différentes figures. Des analyses d'expression différentielle ont été effectuées au niveau de l'ensemble de sondes avec Partek Genomics Suite. Les gènes dérégulés ont été définis en tenant compte de toute interaction potentielle de facteurs dans la conception expérimentale originale et en utilisant une méthode de Benjamini-Hochberg corrigée. P-valeur seuil (FDR) fixée à 0,05.

Analyses de données RNA-seq unicellulaires

Comptages bruts à partir de données transcriptomiques unicellulaires (447 cellules de E10,5 à E17,5 Yang et al, 2017 ) ont été normalisés par estimation du facteur de taille de la bibliothèque avec DESeq 1.26.0 (Anders & Huber, 2010 ) selon Brenneke et al (2013). L'ACP a été réalisée sur des données normalisées en utilisant FactoMineR 1.41 (Lê et al, 2008 ). Ensuite, l'expression moyenne des gènes ERS DOWN ou ERS UP a été projetée pour chaque cellule sur un graphique PCA 2D.

Identification de modèles préférentiels d'expression génique après une hépatectomie partielle

Les gènes avec différents profils d'expression temporelle ont été identifiés à l'aide du Short Time-series Expression Miner (STEM v1.3.11 Ernst et al, 2005 ), qui adapte les modèles dynamiques d'expression génique aux profils modèles. Les expressions géniques normalisées (rpkm) ont été obtenues à partir de Rib et al ( 2018 ), et l'expression moyenne des réplicats a été utilisée. Les paramètres ont été définis sur « log normaliser les données », 4 pour « changement d'unité maximal dans les profils de modèle entre les points de temps », -0,05 pour « changement d'expression absolu minimal » et FDR pour « Méthode de correction ».

Comparaison de l'ampleur des changements transcriptomiques se produisant dans le foie de souris

Pour rendre les changements de pli comparables à ceux obtenus en utilisant RNA-seq, les données des puces à ADN ont été normalisées à l'aide de l'outil Affymetrix Power (Thermo Fisher Scientific) exécuté via la suite d'outils GIANT (Vandel et al, 2018 ) sur une instance locale de Galaxy (Afgan et al, 2018 ). La normalisation a été réglée sur « scale intensité + rma » et le niveau de normalisation sur « probeset ». Les valeurs d'expression normalisées récupérées pour les études qui ont utilisé RNA-seq (tableau EV6) étaient log2-transformé. Pour chaque ensemble de données, une valeur d'expression unique par gène a été définie en utilisant des symboles de gènes comme identifiants et en faisant la moyenne des valeurs obtenues à partir de réplicats. Changements de pli (log2) ont ensuite été calculés sur des données mises à l'échelle, qui ont été obtenues à l'aide de la fonction d'échelle du package R « graphiques » (R Core Team, 2015 ) sur chaque jeu de données séparément. Ceci a été réalisé en utilisant la moyenne globale (moyenne de toutes les valeurs d'expression dans toutes les conditions d'intérêt dans une étude donnée) pour le paramètre « centre » et l'écart type global pour le paramètre « échelle ». Seuls les gènes communs à tous les ensembles de données analysés ont été pris en compte pour les analyses ultérieures, et pour chaque ensemble de données, les 20 % de gènes inférieurs ayant la plus faible expression dans le foie ont été rejetés. Les Bagplots ont été dessinés à l'aide de la fonction « bagplot » du package R « aplpack » (v1.3.2) en utilisant les paramètres par défaut (R Core Team, 2015 ). Les Bagplots sont des boxplots bivariés montrant l'étalement des données à l'aide d'un « sac » contenant 50 % des points de données avec la plus grande profondeur (autour de la médiane) et son extension par une « boucle » dont la limite exclut les valeurs aberrantes (Rousseeuw et al, 1999 ).

Comparaison du transcriptome des foies lésés avec celui du foie de souris en développement

Les données transcriptomiques des lésions hépatiques ont été regroupées et les effets de lot ont été corrigés avec la fonction « ComBat » du paquet R « sva » (Poireau et al, 2019) en utilisant l'étude de différenciation du foie de souris comme lot de référence (voir le tableau EV6 pour les détails concernant les ensembles de données utilisés). Les paramètres ont été définis sur « mean.only = T » et « par.prior = T ». Chaque étude a été définie comme un lot différent où la condition de contrôle (c. Ensuite, une PCA a été calculée uniquement sur l'étude de différenciation hépatique de souris avec la fonction « PCA » de FactomineR (Lê et al, 2008 en utilisant « scale.unit = F »). Les études sur les lésions hépatiques ont été considérées comme des individus supplémentaires. Enfin, la première composante principale (représentant 63,55 % de la variabilité de l'étude de différenciation hépatique chez la souris) a été tracée et utilisée pour projeter les études sur les lésions hépatiques. Les données correspondant aux foies de souris prénatales ont été utilisées dans les analyses mais ont été rejetées pour la visualisation des données.

Analyses d'enrichissement fonctionnel

Des analyses d'enrichissement fonctionnel ont été réalisées à l'aide de la suite ToppGene (Chen et al, 2009 ). KEGG Pathways avec correction de Bonferroni P < 10 -3 et processus biologiques d'ontologie génétique (GO) avec correction de Bonferroni P < 10 -6 ont été considérés et des termes similaires ont été fusionnés.

Analyses d'enrichissement du jeu de gènes

Les analyses d'enrichissement du jeu de gènes (GSEA) ont été effectuées à l'aide du logiciel GSEA (v3.0) développé au Broad Institute (Subramanian et al, 2005 ). Nous avons utilisé 1 000 permutations d'ensembles de gènes et les paramètres suivants : « pondéré » comme statistique d'enrichissement et « différence de classes » comme mesure de classement des gènes. Le classement a été effectué par le logiciel GSEA en utilisant la valeur d'expression moyenne par gène lorsque plusieurs ensembles de sondes étaient présents dans le microarray. En plus des graphiques d'enrichissement, les chiffres fournissent également le NES et le FDR, qui sont respectivement le score d'enrichissement normalisé et le taux de fausses découvertes fournis par le logiciel GSEA. Dans des expériences avec plusieurs conditions, l'outil BubbleGUM (GSEA Unlimited Map v1.3.19 Spinelli et al, 2015 ) a été utilisé pour intégrer et comparer de nombreux résultats GSEA avec correction de tests multiples. Des analyses d'enrichissement de termes GO non orientées ont été effectuées à l'aide de l'ensemble de gènes « MousePath_GO_gmt.gmt » de la base de connaissances Gene Set (préimpression GSKB : Lai et al, 2016 ).

Immunoprécipitation de la chromatine

Les MPH (3 × 10 6 cellules) ont été fixés pendant 30 min à température ambiante avec du glutarate de disuccinimidyle suivi d'une incubation de 10 min avec du formaldéhyde à 1 % et d'une incubation de 5 min avec de la glycine 125 mM. Après deux lavages avec du PBS glacé, les cellules ont été grattées dans du PBS, sédimentées par centrifugation à 400 g pendant 5 min, remis en suspension dans un tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS et 1 × PIC de Roche) et soniqué pendant 4 min (quatre cycles 30 s ON/30 s OFF en utilisant Bioruptor Pico de Diagenode). Le foie de souris (200 mg de tissu) a été coupé en petits morceaux dans du PBS glacé, pressé à travers un tamis cellulaire de 70 µm suivi de quelques passages à travers une aiguille 18G. La fixation, la lyse et la sonication ont été effectuées comme décrit pour le MPH. La chromatine (50 g pour la puce H3K27ac et 200 g pour la puce BRD4) a été diluée 10 fois dans du tampon de dilution (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl) et incubée pendant la nuit avec 2 µg d'anticorps H3K27ac (Active Motif, #39685) ou 3 µg d'anticorps BRD4 (Bethyl Labs, #A301-985A100) à 4°C. Le lendemain, un mélange de billes de sépharose A/G (GE Healthcare) a été ajouté pendant 4 h à 4°C en présence de 70 µg/ml d'ARNt de levure (Sigma-Aldrich). Les billes ont été lavées trois fois avec du tampon RIPA (50 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,7 % de désoxycholate de Na, 1 % de NP-40 et 500 mM de LiCl) contenant 10 g/ml d'ARNt de levure et une fois avec du tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). L'ADN a ensuite été élué dans 100 mM de NaHCO3 contenant 1 % de SDS et incubé pendant une nuit à 65°C pour une réticulation inverse. La purification de l'ADN a été réalisée à l'aide du kit de purification MinElute PCR (Qiagen, #2800), et les échantillons ont été soumis à des analyses qPCR. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau EV5.

La puce H3K27ac et les échantillons d'entrée de MPH traités pendant 4 h avec 1 M de thapsigargine ou de véhicule (0,04 % de DMSO) provenant de trois expériences indépendantes ont en outre été envoyés pour séquençage sur un Illumina Hi-seq 4000 en tant que lectures de 50 bases simples selon les instructions du fabricant. instructions. Les données ont été analysées comme décrit ci-après et ont été soumises à GEO sous le numéro d'accès GSE122508.

Analyses de données ChIP-seq

Le contrôle de la qualité des données ChIP-seq et le retraitement uniforme, y compris le mappage vers la version mm10 du génome de la souris et la normalisation du signal ont été décrits dans Dubois-Chevalier et al ( 2017 ) sauf Bowtie 2 (mode sensible Langmead et al, 2009 ) a été utilisé pour les analyses BRD4 ChIP-seq. Les données ChIP-seq ont été visualisées à l'aide du navigateur de génome intégré (IGB 9.0.1 Freese et al, 2016 ).

Identification large du domaine H3K4me3 et définition du gène d'identité

H3K4me3 ENCODE ChIP-seq données de plusieurs tissus de souris (Shen et al, 2012 Tableau EV6) ont été utilisés pour appeler de larges régions enrichies en H3K4me3 à l'aide de MACS2 comme décrit dans Chen et al (2015). Les domaines larges H3K4me3 ont été définis comme ceux couvrant plus de trois fois la taille médiane de toutes les régions enrichies en H3K4me3 dans un tissu donné. Les domaines larges H3K4me3 du foie de souris ont été séparés en domaines d'identité du foie (LIVER-ID), qui ont été définis comme de larges domaines H3K4me3 spécifiques au foie (c'est-à-dire détectés dans < 25% des autres tissus analysés) et dans les domaines ubiquitaires (UBQ) . Les domaines LIVER-ID et UBQ ont ensuite été attribués aux gènes selon le chevauchement des TSS de la base de données GENCODE (M9) et al, 2019 ), résultant en 621 gènes LIVER-ID et 657 gènes UBQ qui sont répertoriés dans le tableau EV1. Les TF de ces listes de gènes ont ensuite été obtenus par comparaison avec les TF de souris répertoriés dans Animal TFDB 2.0 (Zhang et al, 2015 ). L'identité musculaire (MUSCLE-ID) et les gènes UBQ, répertoriés dans le tableau EV4, ont été définis de manière similaire à l'aide des données H3K4me3 ChIP-seq du consortium ROADMAP traitées par Chen et al (2015). La conversion des noms de gènes humains en souris a été effectuée à l'aide de l'outil dbOrtho de bioDBnet (Mudunuri et al, 2009 ).

Identification du super-amplificateur

Pour définir les super-amplificateurs BRD4 (SE), nous avons d'abord utilisé MACS2 pour identifier les pics enrichis (taille effective du génome = 2150570000, bande passante = 300, mfold = 5-50, FDR (valeur q) = 0,05, tags en double max en même temps location = 1) en utilisant les lectures mappées préalablement filtrées pour supprimer les doublons et les lectures mappées sur les régions de faux positifs que nous avions identifiées à Dubois-Chevalier et al (2017). Les SE ont été identifiés en appliquant l'ordre de classement des super-amplificateurs (ROSE Loven et al, 2013 Pourquoi et al, 2013) sur les résultats de l'appel de crête BRD4 en utilisant les entrées ChIP-seq du foie de souris (GSE26345) comme contrôle (réglage : -s 12500, -t 0).

Identification des modifications de H3K27ac induites par l'ERS aigu

Les régions présentant des changements significatifs dans les signaux H3K27ac ChIP-seq induits par l'ERS ont été identifiées à l'aide de csaw 1.6.1 (Lun & Smyth, 2014 , 2016 ). Les lectures mappées ont été précédemment filtrées pour supprimer les doublons et les lectures mappées aux régions de la liste noire ENCODE (Encode_Project_Consortium, 2012) ou aux régions faussement positives de la souris ChIP-seq que nous avions identifiées à Dubois-Chevalier et al (2017). Les lignes de commande et la liste complète des paramètres utilisés sont fournies dans le code informatique EV1. Brièvement, le génome a été regroupé et les lectures comptées, les bins avec un signal de niveau de fond tel que défini à l'aide d'échantillons d'entrée ont été rejetés avant la normalisation en utilisant une régression de loess. Enfin, après estimation de la dispersion avec la fonction estimateDisp, une analyse différentielle appariée a été réalisée sur ces données filtrées et normalisées à l'aide de glmQLFit. Les bacs chevauchant les pics H3K27ac (régions larges appelées avec MACS2 en utilisant un pool de tous les ensembles de données et entrées ChIP-seq H3K27ac comme contrôle - paramètres : q-val étroit = ​​0,001 et q-val large = 0,01) ont été identifiés à l'aide de findOverlaps de GenomicRanges 1.24.3 (Laurent et al, paramètres 2013 : minoverlap = 75, maxgap = 0). Les casiers chevauchant un seul pic H3K27ac ont été combinés à l'aide de combineOverlaps, et seuls les casiers fusionnés avec FDR 0,05 ont été pris en compte (les casiers fusionnés avec FDR > 0,05 ont été définis comme des régions H3K27ac inchangées). Le rapport des bacs UP à DOWN dans les régions fusionnées a ensuite été calculé, et les régions H3K27ac UP ou DOWN ont été définies comme celles ayant un rapport ≥ 2 ou ≤ 0,5, respectivement. Les coordonnées des régions H3K27ac UP, DOWN et inchangées sont fournies dans l'ensemble de données EV1. Les signaux Bigwig ont été calculés en utilisant le signal normalisé loess sur chaque ensemble de données et/ou en faisant la moyenne du signal normalisé loess entre les réplicats. Les gènes ont été attribués aux régions H3K27ac comme suit : Premièrement, les gènes dont le TSS de la base de données GENCODE (M9) et al, 2019 ) chevauche directement les régions H3K27ac ont été récupérées. De plus, le H3K27ac distal a été lié à des gènes potentiellement régulés à l'aide de CisMapper (O'Connor et al, 2017 ) tel que décrit précédemment dans (Dubois-Chevalier et al, 2017 ).

Analyses de régulateurs transcriptionnels recrutés dans des régions présentant des modifications de H3K27ac induites par un SRE aigu

Afin d'identifier les TF dont la liaison est enrichie dans les régions H3K27ac UP et H3K27ac DOWN, nous avons utilisé l'analyse de chevauchement de locus (LOLA 1.4.0 Sheffield & Bock, 2016) pour comparer la liaison TF dans UP, DOWN et ALL (c'est-à-dire comprenant également H3K27ac inchangé) régions. Les sites de liaison au TF de souris ont été extraits de la base de données de régulation de la transcription génétique (GTRD) (Metaclusters of GTRD version 16.07 Yevshin et al, 2017 ). Les entrées ont été rejetées et les ensembles de données ChIP-seq ont été attribués aux TF en utilisant les informations de nomenclature fournies par les auteurs. Une heatmap du log-odds ratio a été générée à l'aide de la fonction heatmap.2 du package R « gplots » (v3.0.1 Warnes et al, 2016 ) et le clustering hiérarchique à l'aide de la fonction hclust du package R « Stats » (en utilisant la distance euclidienne et la méthode d'agglomération ward.D2 R Core Team, 2015 ). Une liste des TF de chaque cluster est présentée dans le tableau EV2.

Les régions H3K27ac UP, DOWN ou inchangées se chevauchaient avec cis-modules de régulation (CRM) définis dans Dubois-Chevalier et al (2017) basé sur la co-liaison de 47 régulateurs transcriptionnels dans le foie de souris. La co-liaison combinatoire des régulateurs transcriptionnels à H3K27ac UP, DOWN ou inchangé a été analysée à l'aide d'analyses de mise à l'échelle multidimensionnelle (MDS) comme décrit dans Dubois-Chevalier et al (2017). Les tracés ont été réalisés avec la fonction smoothScatter du package R « graphics » (R Core Team, 2015 ) en utilisant une échelle de couleurs conservée.

Récupération de données publiques transcriptomiques et génomiques fonctionnelles

Les données publiques utilisées dans cette étude ont été téléchargées à partir de Gene Expression Omnibus (GEO http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Edgar et al, 2002 ), ENCODER (Yue et al, 2014 ), UCSC Genome Browser (Dreszer et al, 2012 ), ou BioGPS (Souris MOE430 Gene Atlas Wu et al, 2016 ) et sont répertoriés dans le tableau EV6.

Échantillons humains

Biopsies hépatiques post-mortem de patients admis à l'unité de soins intensifs (USI) de l'hôpital universitaire de Louvain avec sepsis (m = 64), décédés après un séjour médian en soins intensifs de 10 jours (IQR 6–20 jours), ont été comparés à des patients appariés subissant une chirurgie rectale restauratrice élective (m = 18). Le consentement éclairé écrit a été obtenu des patients ou de leur proche parent et des volontaires. Les protocoles d'étude et les formulaires de consentement ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel de la KU Leuven (ML1094, ML1820 et ML2707). La bilirubine a été quantifiée à l'aide d'un test automatisé de routine standard dans le laboratoire clinique de l'hôpital universitaire.

Extraction de protéines

Extraits totaux

Les cellules MPH et AML12 ont été grattées dans du PBS glacé, sédimentées par centrifugation à 400 g pendant 5 min, lysé dans du tampon Laemmli 6 × (175 mM Tris-HCl pH 6,8, 15 % de glycérol, 5 % de SDS, 300 mM de DTT et 0,01 % de bleu de bromophénol) et soniqué pendant 10 min. Le foie de souris a été coupé en petits morceaux dans du PBS glacé et pressé à travers une passoire à cellules de 70 µm. Le culot obtenu après centrifugation à 400 g pendant 5 min a été lysée et soniquée comme décrit pour le MPH. Les transferts de Western présentés dans cette étude ont été obtenus en utilisant des extraits cellulaires totaux, sauf indication contraire.

Extraits nucléaires

Les MPH ont été grattés dans du PBS glacé et le foie de souris a été coupé en petits morceaux dans du PBS glacé et pressé à travers une passoire cellulaire de 70 µm. Les pastilles ont été obtenues par centrifugation à 400 g pendant 5 min, lysé dans un tampon hypotonique (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,2 % de NP-40 et 1 × PIC de Roche) et incubé 5 min à 4°C. Les échantillons ont été centrifugés à 600 g pendant 5 min à 4°C et les surnageants constituaient la fraction cytoplasmique. Les culots nucléaires ont été lysés dans du Nucleus Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40 et 1 × PIC de Roche). Le tampon hypotonique et le tampon de lyse du noyau ont été complétés avec un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase (#P044 de Sigma-Aldrich) ainsi qu'avec 5 mM de butyrate de sodium et 5 M de trichostatine A pour l'inhibition de la désacétylase. Après incubation pendant 30 min à 4°C, les échantillons ont été soniqués pendant 10 min et centrifugés à 16 000 g pendant 5 min à 4°C. Laemmli 6x a été ajouté aux surnageants qui ont été utilisés pour l'immunotransfert de Western.

Fraction de chromatine

Les MPH ont été grattés dans du PBS glacé, agglomérés par centrifugation à 400 g pendant 5 min, lysé dans le tampon A (50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 340 mM de saccharose, 10 % de glycérol, 1 mM de DTT et 1 x PIC de Roche), et incubé pendant 10 min à 4°C. Les échantillons ont été centrifugés à 1 300 g pendant 5 min à 4°C, et les surnageants ont été jetés. Les culots nucléaires ont été lavés avec le tampon A et ensuite lysés dans la solution B (3 mM d'EDTA, 0,2 mM d'EGTA, 1 mM de DTT et 1 x PIC de Roche). Après incubation pendant 30 min à 4°C, les échantillons ont été centrifugés à 1700 g pendant 5 min à 4°C et les surnageants ont été jetés. Les culots de chromatine ont été lavés avec la solution B, remis en suspension dans le tampon C (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM MgCl2, et 83 U/μl de benzonase), et incubé pendant 20 min à 4°C. Du tampon Laemmli 6x a été ajouté avant le chargement pour l'immunotransfert Western.

Plasmides et in vitro transcription et traduction

Les constructions pcDNA3.1-mNFIL3 (Addgene 34572) et pSGG5-hHNF4A ont été utilisées pour in vitro transcription et traduction (in vitro TNT) à l'aide du système de transcription/traduction à couplage rapide TnT ® (Promega).

Immunotransfert occidental

Essais Western blot (WB)

Cent g de protéines ont été séparés par SDS-PAGE à 10 % et immunodétectés par immunoblot Western en utilisant les anticorps primaires répertoriés dans le tableau Réactifs et outils. Les anticorps primaires ont été détectés en utilisant des anticorps secondaires conjugués à la HRP (Sigma-Aldrich). Les images ont été acquises à l'aide d'une G-box (Syngene, Cambridge, Royaume-Uni) ou à l'aide du système d'imagerie iBright™ CL1500 (Thermo Fisher Scientific). Les quantifications ont été effectuées à l'aide d'Image Studio Lite v5.2 (LI-COR Biosciences, Lincoln, États-Unis) et les intensités de bande ont été définies à l'aide de la valeur du signal (somme de l'intensité des pixels dans une forme moins la valeur de fond).

Dosages immunologiques occidentaux simples (WES)

Des dosages simples basés sur la taille Western ont été effectués sur un système WES tel que recommandé par le fabricant (ProteinSimple, San Jose, USA). Les concentrations en protéines allaient de 0,25 à 0,8 g/μl selon la protéine cible. Les anticorps primaires sont répertoriés dans le tableau Réactifs et outils. Les anticorps secondaires ont été fournis par le fabricant (PS-MK14 et PS-MK15, ProteinSimple). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel Compass (ProteinSimple). Les quantifications ont été obtenues en utilisant l'aire sous le pic de la protéine d'intérêt.

Tests de co-immunoprécipitation

Les cellules MPH ont été remises en suspension dans un tampon hypotonique (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,2 % de NP-40 et des inhibiteurs de protéase) et le culot a été lysé pendant 30 min. Après 10 min de sonication (cycles marche/arrêt de 30 s avec un Bioruptor (Diagenode) et centrifugation, 500 g de protéines nucléaires de la fraction soluble ont été dilués avec deux volumes d'un tampon contenant 25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, et incubé pendant une nuit avec 2 ug d'anticorps p300 (motif actif, #61401) ou d'IgG de souris contrôle (sc-2025, Santa Cruz). Les échantillons ont ensuite été incubés pendant 4 h avec des billes magnétiques (Life technologies) préalablement bloquées avec 5 mg/ml de sérum albumine bovine et lavées 4 fois à l'aide d'un tampon de lavage glacé contenant 25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 0,2 % de NP-40 et d'inhibiteurs de protéase. Les billes ont finalement été éluées dans du tampon Laemmli 6x.

Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide des logiciels Prism (GraphPad, San Diego, CA) et R (R Core Team, 2015). Les tests spécifiques et les corrections pour les tests multiples qui ont été utilisés ainsi que le nombre d'échantillons par condition sont indiqués dans les légendes des figures. Dans tous les cas, la signification statistique a été considérée comme atteinte lorsque P- les valeurs étaient inférieures à 0,05, ce qui était indiqué par * ou # . Tous les graphiques à barres montrent des moyennes ± SD (écarts types). Les boîtes à moustaches sont composées d'une boîte du 25 e au 75 e centile avec la médiane comme ligne et min à max comme moustaches.


Bovine MSTN promoteur de gène

L'étude de 1,6 kb de la région amont bovine a montré qu'elle présente 79% d'identité de séquence avec la région régulatrice 5' humaine et porte également de nombreux sites de liaison putatifs, dont un site CAAT, trois boîtes TATA, en plus d'un MEF2, qui s'est avéré augmenter l'activité du promoteur in vitro [19, 40] (voir le fichier supplémentaire 1). Dix E-box putatifs sont organisés en trois clusters au sein du promoteur bovin (Fig. 1), avec les deux clusters proximaux contenant six E-box, qui sont suffisants pour stimuler le même niveau d'activité du promoteur observé pour les dix E-box [ 19]. La E-box numéro 6 semble avoir un rôle crucial dans la régulation, et a été indiquée comme le site de liaison préférentiel pour les MRF MYOD et MYF5, pouvant compenser la perte des autres E-box. Conformément au rôle des boîtes E dans la conduite de l'expression des gènes via les MRF, il a été démontré que le promoteur est spécifique du muscle, présentant une faible activité lorsqu'il est transfecté dans des fibroblastes [19].

Ce bovin MSTN promoteur a été cloné en amont du gène rapporteur de la luciférase, transfecté dans des cellules C2C12 et traité avec des concentrations croissantes de protéine MSTN de type sauvage. Cela a entraîné une réduction de l'activité du promoteur, indiquant que MSTN promoteur est sous le contrôle négatif de la protéine MSTN [41]. Cependant, lors de l'utilisation de la protéine MSTN mutée de bovins piémontais, qui présente une transition de cystéine à tyrosine dans le domaine actif C-terminal, l'activité du promoteur n'a pas été significativement affectée. De plus, la rétroaction négative de MSTN promoteur par la protéine MSTN s'est avéré dépendant des récepteurs ActRIIB et ALK5, et de la protéine SMAD7. Le promoteur du gène de SMAD7 s'est également avéré être activé par la protéine MSTN de type sauvage, mais pas par la MSTN piémontaise muté, tandis que MSTN il a été démontré que l'activité du promoteur réduisait lors de l'expression de SMAD7. Ces observations indiquent que la MSTN est autorégulé négativement par la protéine MSTN d'une manière dépendante de SMAD7, et la protéine MSTN mutée observée dans certaines races bovines à double musculature perd la capacité de le faire, ce qui entraîne une augmentation de MSTN ARNm chez ces animaux [41].

Des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ont déjà été détectés dans la région régulatrice 5' bovine de plusieurs races, telles que les taureaux bleu belge, piémontais, limousine, marchigiana, noir et blanc, Holstein, Hanwoo, Jeju Black Cattle et Qinchuan [40 , 42,43,44,45]. Les plus pertinents sont résumés dans le tableau 1. Dans certains d'entre eux, une association directe entre les polymorphismes promoteurs et le phénotype a été trouvée, ce qui renforce l'utilisation potentielle de MSTN promoteur en tant que marqueur moléculaire, ainsi qu'une cible potentielle pour la manipulation dans l'amélioration des caractéristiques économiques des races bovines, comme discuté plus en détail dans la section Applications potentielles. Il est pertinent de noter qu'outre les effets sur la musculature, certains SNP étaient également associés au dépôt de graisse [42], corroborant un rôle de MSTN dans l'équilibre entre les myoblastes et la différenciation préadipocytaire et le dépôt muscle/graisse.


Résumé

Les systèmes à deux composants (TCS) sont de courtes voies de signalisation se produisant généralement chez les procaryotes. Ils régulent fréquemment les réponses aux stimuli procaryotes et présentent donc également un intérêt pour l'ingénierie en biotechnologie et en biologie synthétique. Le but de cette étude est de mieux comprendre et décrire le recâblage du TCS tout en étudiant différents scénarios d'évolution. Basée sur des écrans à grande échelle de TCS dans différents organismes, cette étude fournit des données détaillées, des alignements concrets et une analyse de structure sur trois scénarios de modification généraux, où les TCS ont été recâblés pour de nouvelles réponses et fonctions : (i) échanges dans la séquence au sein d'un seul TCS domaines, (ii) échange de domaines TCS entiers (iii) ajout de nouveaux composants modulant la fonction TCS. En conséquence, le remplacement des cassettes de stimulus et de promoteur pour recâbler le TCS est bien défini en exploitant les alignements donnés ici. Les exemples de TCS divergents ne sont pas triviaux et la conception est difficile. Les protéines de connexion conçues peuvent également être utiles pour modifier le TCS dans certains cas.


19.E : Régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes (Exercices) - Biologie

L'activation des lymphocytes T induit des modifications sélectives du lipidome cellulaire

Tapio Lonnberg 1 , Laxman Yetukuri 2 , Tuulikki Seppanen-Laakso 2 , Riitta Lahesmaa 1 , Matej Oresic 2

1 Centre de biotechnologie de Turku, Université de Turku et Université Abo Akademi, Turku, Finlande, 2 Centre de recherche technique VTT de Finlande, Espoo, Finlande

TABLE DES MATIÈRES 1. Résumé 2. Introduction 3. Matériel et méthodes 3.1. Isolement des cellules CD4+ 3.2. Stimulation et culture cellulaire 3.3. Récolte 3.4. Analyse lipidomique 3.5. Analyse de clustering 4. Résultats 4.1. Composition lipidique des cellules précurseurs naïves T helper 4.2. Altérations des concentrations de lipides en réponse à l'activation des lymphocytes T 4.3. Les modifications des longueurs et du degré de saturation des acides gras PC et PE au cours du développement de phénotypes de lymphocytes T activés 4.4. Régulation transcriptionnelle du métabolisme des lipides 5. Discussion 6. Remerciements 7. Références

L'activation de cellules T auxiliaires naissantes par la présentation d'un antigène apparenté initie un processus de signalisation intracellulaire complexe conduisant au développement d'une population de cellules effectrices fonctionnellement actives. Le passage de l'état naïf au repos à l'état activé implique un changement profond du métabolisme cellulaire, nécessaire à l'achèvement de plusieurs cycles de prolifération. En utilisant la spectrométrie de masse par chromatographie liquide ultra performante, nous avons analysé comment ce changement se reflète sur la composition lipidique cellulaire dans les lymphocytes T du sang du cordon ombilical humain. Nous avons constaté que des changements de concentration considérables ont lieu au cours des 72 premières heures après l'activation des récepteurs des cellules T, en corrélation avec les premiers cycles de division cellulaire induite par l'activation. Plus important encore, la composition des phosphatidylcholines et des phosphatidyléthanolamines présentait une tendance constante vers des espèces moléculaires plus courtes et plus saturées. Avec les données de transcriptomique connexes, les résultats suggèrent clairement l'induction de la synthèse d'acides gras de novo et l'accumulation d'acides gras synthétisés de manière endogène dans les membranes cellulaires, conduisant à un remodelage partiel du lipidome cellulaire dans la population de cellules effectrices nouvellement développée.

Les cellules T auxiliaires constituent la couche régulatrice la plus élevée du système immunitaire adaptatif, contrôlant l'activité de tous les types de cellules immunitaires en aval et coordonnant ainsi toutes les réponses immunitaires acquises.L'activité des cellules T auxiliaires elles-mêmes est déterminée par l'activation médiée par les récepteurs des cellules T par des complexes peptide-MHC apparentés et la différenciation subséquente influencée par les cytokines de sous-ensembles effecteurs fonctionnellement distincts, à savoir les cellules Th1, Th2 et Th17 (1-3). Ces processus sont des conditions préalables à la spécificité et à la mémoire qui caractérisent les réponses immunitaires acquises.

Étant donné que la fonction fondamentale de l'activation des lymphocytes T est de reconnaître les peptides pathogènes non-soi dans un environnement dominé par des molécules inoffensives et autonomes, une régulation extrêmement stricte et spécifique est requise. Il est important de noter que, contrairement aux fonctions de nombreux autres récepteurs de surface cellulaire, l'activation des cellules T ne suit pas la cinétique d'action de masse typique où la vitesse de la réaction est déterminée par les concentrations des molécules participantes. Au lieu de cela, un réseau remarquablement complexe de mécanismes de signalisation intracellulaire a évolué qui contrôle l'initiation, la durée et la force de l'activation (4-6).

Essentiellement, le modèle actuel soutient que la liaison du complexe peptide antigénique-MHC aux sous-unités du TCR α/ b conduit à la phosphorylation des domaines cytoplasmiques ITAM et est suivie par l'autophosphorylation de ZAP70. La phosphorylation de ZAP70, à son tour, conduit à l'activation des protéines d'échafaudage clés LAT et SLP76, permettant la diversification du signal dans de multiples voies, surtout Ras, PKC q et la signalisation intracellulaire médiée par le Ca 2+. Les preuves expérimentales d'études récentes à haut débit suggèrent qu'en fin de compte, l'activation des récepteurs des cellules T a des effets profonds sur la fonction cellulaire, comme illustré par la phosphorylation de plus de 400 protéines déjà une heure après la stimulation (7), et l'activation différentielle de plus de 6 000 gènes au sein de 48 heures après l'activation(8).

Le maintien d'une composition lipidique appropriée dans les membranes cellulaires est nécessaire pour assurer la fluidité membranaire, la topologie des protéines attachées, l'activité des enzymes liées à la membrane, le degré d'exposition des protéines de surface, la mobilité latérale des récepteurs et l'activation de voies de signalisation spécifiques. Compte tenu de l'importance de la composition lipidique membranaire, les cellules ont développé des mécanismes robustes pour maintenir l'homéostasie lipidique membranaire. Pour comprendre le métabolisme des lipides des lymphocytes T, il est donc important de mesurer ses produits finaux, les lipides cellulaires, au niveau moléculaire. L'approche dite lipidomique, couvrant un profil global de lipides structurellement et fonctionnellement divers, peut non seulement élucider la composition moléculaire lipidique des lymphocytes T, mais aussi fournir des indices sur les mécanismes derrière le contrôle de l'homéostasie lipidique cellulaire dans le processus de T. -activation cellulaire(9).

Dans quelle mesure les signaux conduisant à l'activation des cellules T sont réfléchis sur la composition lipidique cellulaire n'a jusqu'à présent pas été abordé de manière systémique. Jusqu'aux avancées récentes dans les approches basées sur la spectrométrie de masse (9-11), cette limitation a sans doute été attribuée davantage au manque d'outils efficaces qu'au manque d'intérêt, car les rôles spécifiques de certains lipides dans les étapes proximales de la signalisation TCR sont bien établis. . En particulier, l'activation des voies Ras et PKC q dépend de la production de diacylglycérol (DG) à partir du phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PI(4,5)P 2 ) de la membrane plasmique par la phospholipase C g (PLC g ) en réponse à l'engagement du TCR. L'autre produit de cette réaction, l'inositol (1,4,5) triphospate (IP 3 ), à son tour, médie la libération de Ca 2+ cytoplasmique et l'initiation de la signalisation médiée par Ca 2+ (12). De plus, des approches ciblées ont été récemment exploitées, par ex. dans le contexte des domaines membranaires plasmiques ordonnés par les lipides (13), et ont fourni des preuves solides à l'appui des rôles régulateurs pour des environnements lipidiques moléculaires spécifiques. Par conséquent, la question se pose de savoir si les étapes les plus en aval de l'activation des lymphocytes T et le développement consécutif de sous-ensembles de cellules effectrices sont également régulées par les lipides ou médiées par des intermédiaires lipidiques.

Nous présentons ici une analyse globale des profils lipidiques cellulaires dans les cellules T primaires du sang du cordon ombilical humain à la fois à l'état non stimulé et pendant une durée de 72 heures après l'activation des cellules T. De plus, les effets cumulatifs de l'IL-4, la cytokine clé favorisant le Th2, ont été mesurés. Les résultats ont indiqué des changements longitudinaux significatifs dans les concentrations de plusieurs glycérophospholipides. Il est important de noter qu'une augmentation systématique des concentrations de phosphatidylcholines et de phosphatidyléthanolamines saturées à chaîne courte a été mesurée, avec une diminution correspondante des espèces polyinsaturées plus longues.

À notre connaissance, nos données représentent actuellement le catalogue le plus complet de glycérophospholipides cellulaires, de sphingolipides et de triglycérides des cellules T humaines primaires, et suggèrent une plasticité considérable dans la composition lipidique globale des cellules T activées.

Des échantillons de sang de cordon ombilical ont été obtenus auprès de donneurs de nouveau-nés sains de l'hôpital central de l'université de Turku. Les cellules mononucléées ont été isolées en utilisant une centrifugation en gradient de Ficoll (Amersham). Les cellules CD4+ ont été davantage purifiées en utilisant une sélection positive avec des billes Dynal magnétiques revêtues d'anti-CD4 (Invitrogen). La pureté typique de ces échantillons a été déterminée comme étant de l'ordre de 98 à 99 % (63).

3.2. Stimulation cellulaire et culture

Les cellules CD4+ ont été cultivées dans du milieu Yssel (milieu Dulbecco modifié Iscove (IMDM Invitrogen) additionné de concentré de milieu Yssel, pénicilline, streptomycine et 1% AB-sérum) à une densité de 2-3*10 6 cellules/ml sur 24 bien assiettes. Les cellules ont été activées en utilisant de l'anti-CD3 lié à la plaque (0,5 m g/puits) et de l'anti-CD28 soluble (0,5 m g/ml) (les deux anticorps de Beckman Coulter). La polarisation Th2 a été induite avec l'ajout d'IL-4 (10 ng/ml, R&D Systems).

Les cellules ont été récoltées à l'état non stimulé et à 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 et 72 heures après l'activation. La récolte et l'extinction métabolique ont été effectuées comme décrit par de Koning et al. (64), avec quelques modifications. En bref, le milieu de culture a été retiré, les cellules ont été remises en suspension dans du méthanol à -20 °C 50 % et sédimentées par centrifugation (770 g 20 min) à -20 °C. Le surnageant a été jeté et les cellules ont été stockées dans de l'azote liquide. .

Des aliquotes de cellules T cultivées contenant env. 2 millions de cellules ont été enrichies d'un mélange standard composé de 10 composés lipidiques (0,2 µg/échantillon) et mélangées à 100 µl de chloroforme/méthanol (2 : 1) par vortex pendant 2 min. Après 1 h de repos, les tubes ont été centrifugés à 10 000 tr/min pendant 3 min et la phase organique inférieure a été séparée dans un insert de flacon et mélangée avec un mélange standard contenant 3 composés lipidiques marqués (0,1 µg/échantillon).

L'analyse lipidomique a été réalisée comme décrit précédemment (65). En bref, les extraits lipidiques ont été analysés sur un spectromètre de masse Waters Q-Tof Premier (Waters) combiné à un Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography TM (Waters) en utilisant un système de solvant comprenant 1) de l'eau avec 1% de NH 4 Ac 1M et 0,1% HCOOH et 2) acétonitrile/isopropanol de qualité LC/MS (5:2) avec 1 % de NH 4 Ac 1 M, 0,1 % de HCOOH. Le gradient de 65% A / 35% B à 100% B a duré 6 min et le temps d'exécution total incluant une étape de rééquilibrage de 5 min était de 18 min. Une colonne Acquity UPLC TM BEH C18 1 à 50 mm avec des particules de 1,7 μm a été utilisée à 50 °C et à un débit de 0,200 ml/min. Le profilage lipidique a été réalisé en utilisant le mode ESI+ et les données ont été collectées dans une plage de masse de m/z 300-1200.

Les données ont été traitées à l'aide du logiciel MZmine 2 (66). L'identification des lipides a été réalisée à l'aide d'une bibliothèque spectrale interne comme décrit précédemment (67). Les espèces lipidiques pertinentes dans la bibliothèque ont été identifiées comme suit : En mode ion positif, les espèces moléculaires de PC forment des ions d'addition protonés (M+H) + ou sodiés (M+Na) + ainsi qu'un pic dominant à m/z 184, représentant le groupe de tête de choline. De plus, les adduits de PC sodium forment des pics caractéristiques à m/z (M+Na-59) + , (M+Na-205) + et (M+Na-183) + . L'identification des éthers lipidiques est généralement basée sur les valeurs m/z précises (généralement un produit d'addition protoné ou sodique) ainsi que sur l'ion fragment diagnostique au niveau MS/MS à m/z 184 en mode ion positif. L'ionisation négative par électronébulisation a été utilisée lorsque des détails concernant la composition en acides gras étaient requis. Comme les PE sont zwitterioniques, une électrospray positive et négative pourrait être utilisée pour caractériser leur fragmentation. Les espèces moléculaires PE forment des espèces protonées (M+H) + qui produisent un ion fragment majeur à m/z (M+H -141) + (en raison de la perte du groupe de tête) en mode positif ESI-MS/MS. Les éthanolamines plasmagènes (liées à l'éther) sont détectées sur la base de deux ions fragmentaires caractéristiques des positions sn-1 et sn-2. L'ESI-MS des espèces TG produit des ions d'addition d'ammonium qui sont fragmentés en MS/MS pour produire des fragments de type diacylglycérol ((DG) + ), qui sont informatifs pour identifier les espèces TG. L'ESI-MS n'est pas bien adapté à l'analyse du cholestérol libre. Les esters de cholestérol, cependant, forment des adduits d'ammonium en mode ion positif ainsi qu'un ion fragment à m/z 369 lors de la fragmentation induite par collision. En mode positif, l'analyse ESI-MS des sphingolipides, tels que la sphingomyéline (SM), forme un pic caractéristique de phosphocholine protonée à m/z 184. Les espèces PC et SM se distinguent sur la base de leur valeur m/z caractéristique (les espèces PC se produisent à pair à m/z et espèces SM à impair m/z). Les espèces SM produisent des ions (M+H) + ou (M+Na) + en mode d'ionisation positive et (M-CH3) - et (M+45) - des ions en ionisation négative. Les espèces céramides forment des espèces moléculaires protonées instables qui subissent une déshydratation pour former (M+H-H 2 O) + des pics en mode ion positif ESI. Les ions moléculaires observés dans des conditions d'ionisation négative sont très instructifs pour identifier les substituants acyle gras et base à longue chaîne du céramide. Les espèces de céramide produisent des ions (M-H) - et (M-H-30) - (en raison de la perte du groupe HCHO) dans des conditions d'ionisation négative. Alors que l'analyse en mode positif des bases à longue chaîne telles que la sphingosine (d18:1), la sphinganine (d18:0) et la 4-D-hydroxysphinganine (t18:0) subissent une déshydratation pour former des fragments à m/z 282/264, 284/266 et 300/282, l'analyse en mode ionique négatif des fragments sphingosine et phytosphingosine est caractérisée sur la base des fragments à m/z 237/263 et 225/255/267 respectivement.

La normalisation des données lipidomiques a été effectuée comme suit : tous les lipides monoacylés à l'exception des esters de cholestérol, tels que les monoacylglycérols et les monoacylglycérophospholipides ont été normalisés avec PC (17 : 0/0 : 0), tous les lipides diacyl à l'exception des phospholipides d'éthanolamine ont été normalisés avec PC (17 : 0 /17:0), les céramides avec Cer(d18:1/17:0), les phospholipides diacyl éthanolamine ont été normalisés avec PE (17:0/17:0), et les esters TG et cholestérol avec TG (17:0/ 17:0/17:0).

L'analyse de clustering a été effectuée à l'aide de R (version 2.10.1) en utilisant des métriques de distance Ward.

4.1. Composition lipidique des cellules précurseurs naïve T helper

La composition lipidique des cellules T auxiliaires humaines non stimulées a été analysée à partir d'échantillons de cellules de sang de cordon ombilical humain purifiées par CD4 en utilisant la spectrométrie de masse par chromatographie liquide ultra performante (UPLC-MS). Les analyses ont été effectuées à l'aide de quatre échantillons biologiques répliqués, chacun représentant un pool de cellules provenant de plusieurs individus.

En conséquence, au total 41 espèces lipidiques distinctes ont pu être identifiées de manière reproductible. La plupart d'entre eux représentaient les phosphatidylcholines (PC) et les phosphatidyléthanolamines (PE), qui sont les classes de lipides les plus abondantes à la fois en termes d'espèces identifiées et de concentration absolue, comme illustré à la figure 1. Les autres principales classes de lipides analysées comprenaient les sphingomyélines (SM) , les triacylglycérols (TG) et les diacylglycérols. La stratégie d'identification appliquée a abouti à l'attribution de la formule de la somme des lipides pour chacune des espèces mesurées, qui consistait en la classe du groupe de tête, le nombre total d'atomes de carbone de la chaîne latérale des acyles gras et le nombre de doubles liaisons de la chaîne latérale : par ex. PC (32:0) indiquant une phosphatidylcholine avec un nombre de carbones de 32 et aucune double liaison.

4.2. Modifications des concentrations de lipides en réponse à l'activation des lymphocytes T

L'activation par le récepteur des cellules T a une influence profonde sur l'activité transcriptionnelle et traductionnelle. Pour étudier comment ces effets se reflètent sur les concentrations de lipides cellulaires, des analyses lipidomiques basées sur l'UPLC-MS ont été effectuées pour des cellules CD4 + T de sang de cordon cultivées ex vivo au cours d'une série chronologique de 72 heures consistant en neuf points temporels après l'activation avec plaque- des anticorps anti-CD3 liés et des anticorps co-stimulateurs solubles anti-CD28. L'activation a été effectuée en présence ou en l'absence d'IL-4, la cytokine clé favorisant Th2, pour analyser si la différenciation du sous-ensemble Th induite par la cytokine avait des effets cumulatifs supplémentaires au cours de cette période.

Au total, 67 lipides ont été quantifiés avec succès à partir de tous les échantillons. Pour avoir une vue d'ensemble sur la régulation de ces lipides, une analyse de regroupement hiérarchique a été effectuée à la fois dans la direction de l'échantillon ainsi que dans l'axe de la cinétique temporelle des espèces lipidiques. Les résultats ont indiqué que les points temporels les plus récents (48 et 72 heures) présentaient les changements les plus distincts, tandis que les points temporels antérieurs se regroupaient plus étroitement (Figure 2). L'effet cumulatif potentiel de la stimulation par l'IL-4 semblait être presque négligeable et, en général, ne pouvait pas être distingué de manière fiable de la variation biologique, faisant ainsi du point de temps le facteur déterminant dans le regroupement dans la direction de l'échantillon.

En raison du regroupement dans le sens de la cinétique, les lipides identifiés présentaient au moins quatre types distincts de régulation : les lipides qui sont d'abord régulés à la hausse, mais diminuent à des moments ultérieurs ; la fin des séries chronologiques et celles qui restent relativement constantes tout au long de la série chronologique. Les profils de concentration au cours du temps de toutes les espèces analysées sont fournis dans les tableaux 1 et 2.

4.3. Modifications de la longueur des chaînes d'acides gras PC et PE et du degré de saturation au cours du développement de phénotypes de lymphocytes T activés

L'analyse de regroupement a indiqué que les changements de concentration les plus prononcés étaient associés aux espèces lipidiques des classes PC et PE. Un examen plus approfondi des résultats a suggéré que les grappes à régulation différentielle étaient constituées d'espèces lipidiques avec des compositions d'acides gras distinctes. Fait intéressant, les lipides qui étaient régulés à la baisse à 48 et 72 heures semblaient être enrichis en espèces polyinsaturées, tandis que les espèces lipidiques régulées à la hausse contenaient en moyenne une quantité nettement plus petite de doubles liaisons. Pour valider davantage ces changements quantitatifs dans les acides gras PC et PE et leurs implications potentielles sur la composition de la membrane cellulaire, l'expérience a été reproduite en utilisant des cellules isolées d'échantillons de sang de cordon de différents individus. Les espèces lipidiques ont été quantifiées à l'aide du flux de travail établi, ce qui a permis d'identifier 34 espèces de PC et de PE qui étaient en commun avec l'ensemble de données d'origine.

Pour étudier la corrélation de l'abondance relative avec la saturation en lipides et la longueur de la chaîne latérale, les 34 lipides PC et PE identifiés ont été regroupés sur la base du nombre de carbones de la chaîne latérale (󖼴 ou 󖾚) et du nombre de doubles liaisons de la chaîne latérale ( 𕟫 ou 𕟶) et leur concentration relative cumulative calculée. L'analyse des séries chronologiques de ces espèces lipidiques était conforme à la constatation que dans les cellules activées, les acides gras plus courts et moins saturés sont en général favorisés par rapport aux espèces polyinsaturées, et que ces changements sont significatifs en termes de concentrations de lipides totaux, entraînant un remodelage croissant de la lipidome cellulaire pendant les 72 premières heures suivant l'activation (Figure 3). La spécificité des changements de concentration était également évidente au niveau des espèces lipidiques individuelles (Figure 4). Dans la comparaison des points de temps les plus anciens et les plus récents (0,5 et 72 heures), les espèces de PC les plus significativement régulées à la hausse étaient à chaîne relativement courte et saturées (PC(30:0), PC(32:1), PC(32:2 ) et PC(34:2)), tandis que les espèces (PC(38:4) et PC(O-38:5)) étaient les plus nettement diminuées. Une tendance similaire, bien que moins constante, à des lipides plus courts et moins saturés a également été observée dans les lipides de la classe PE. Un modèle de régulation supplémentaire a été observé dans la régulation à la baisse d'amplitude variable des espèces plasményl PC et PE.

4.4. Régulation transcriptionnelle du métabolisme des lipides

Des ensembles de données transcriptomiques complets du modèle de différenciation des cellules T humaines ont été publiés (14). Pour évaluer le rôle de la régulation transcriptionnelle dans les altérations au niveau lipidique, nous avons corrélé les mesures transcriptomiques avec les résultats de l'analyse lipidomique. L'accent a été mis sur les gènes codant pour des enzymes ayant des rôles documentés dans le métabolisme des lipides, répertoriés à l'aide d'annotations de la base de données KEGG (tableau 3) (15), complétés par des ajouts basés sur la littérature récente. Les grandes classifications fonctionnelles de ces gènes étaient les synthases d'acides gras, les désaturases, les élongases, les acyl-CoA synthétases ou les phospholipides acyltransférases, et les régulateurs en amont connus de ceux-ci.

Bien que l'activité enzymatique ne soit pas contrôlée uniquement au moyen d'un changement au niveau de l'ARNm, dans le cas de la synthétase des acides gras, des élongases et des désaturases, la régulation aurait lieu principalement au niveau du transcrit (16). Conformément à cela, les résultats ont indiqué qu'au sein de chaque catégorie fonctionnelle, plusieurs enzymes étaient soumises à la fois à une induction et à une répression transcriptionnelles. Par exemple, l'expression de l'acétyl-CoA carbolyxase a (ACACA), une enzyme clé dans la synthèse du palmitate, a été clairement induite, bien que le niveau d'acide gras synthase (FASN) soit resté relativement inchangé. Un changement de pli particulièrement important a été observé pour le gène SCD, codant pour la stéaryl-coenzyme A désaturase, une enzyme responsable de la conversion de l'acide palmitique en acide palmitoléique et de l'acide stéarique en acide oléique (Figure 5) La SCD est co-régulée avec l'acide gras les désaturases FADS1 et FADS2, ainsi que l'élongase ELOVL6, qui étaient toutes modérément augmentées avec l'activation des lymphocytes T. FADS1 et FADS2 fonctionnent comme des désaturases delta-5 et delta-6, respectivement. ELOVL6 catalyse à son tour l'allongement des acides gras à 16 carbones en 18 carbones et est spécifique du substrat d'acide palmitique saturé, entraînant la génération d'acide stéarique, qui peut être ultérieurement désaturé par SCD. Les régulateurs en amont de ce module génique incluent la voie PPAR a /RXR a, également régulée à la hausse dans les cellules T dans la même échelle de temps (17). Fait intéressant, en plus d'ELOVL6, l'expression d'ELOVL1, qui est également spécifique des acides gras saturés, semble être induite, bien qu'elle ne soit pas directement co-régulée par la voie PPAR a.

L'incorporation d'acides gras synthétisés de manière endogène et alimentaires aux phospholipides se fait soit par synthèse de novo via la voie Kennedy (18, 19) soit par remodelage via le cycle de Lands (20).La réaction limitante de la voie Kennedy est catalysée par la phosphocholine cytidylyltransférase (CT), dont l'activité est régulée au moins en partie par la phosphorylation(21). Néanmoins, une induction claire du gène PCYT2, codant pour la phosphoéthanolamine cytidylyltransférase a été détectée. Dans le cycle de Lands, les chaînes d'acides gras glycérophospholipides sont remodelées par les activités successives de la phospholipase A 2 s (PLA 2 ) et des enzymes de la famille des lysophospholipides acyltransférases (LPLAT), ces dernières présentant des préférences claires concernant à la fois le groupe de tête accepteur des phospholipides et le substrat structure de chaîne latérale. Parmi les sondes LPLAT dans les données de microarray, celles pour LPCAT1 et LPCAT4 ont indiqué une régulation à la hausse subtile vers les derniers points dans le temps. LPCAT1 a d'abord été caractérisée comme une acyltransférase responsable de la génération de surfactant dipalmitoyl PC par les cellules alvéolaires, possédant une spécificité pour l'acyl-CoA 16:0, tandis que LPCAT4 a récemment été décrite comme une acyltransférase spécifique 18:1 (22-24). Dans l'ensemble, les données de transcriptomique soutiennent l'observation que le lipidome des cellules T est activement et spécifiquement régulé dans les cellules stimulées par le TCR pendant le développement de sous-ensembles d'effecteurs fonctionnellement matures.

Alors que les lymphocytes T CD4 + et leur activation et différenciation ont été étudiés de manière relativement approfondie au niveau de la transcriptomique, de la protéomique et, plus récemment, par des approches épigénétiques, les études précédentes au niveau des lipides ont été limitées à des expériences ciblant des espèces moléculaires spécifiques et des propriétés de sous-groupes locaux. systèmes cellulaires, tels que l'environnement des récepteurs des cellules T. Jusqu'à présent, le développement de cellules T effectrices activées n'a pas été étudié de manière approfondie au niveau des lipides moléculaires. Dans la présente étude, nous avons utilisé une stratégie lipidomique basée sur l'UPLC-MS dans l'analyse des lymphocytes T CD4 + du sang du cordon ombilical humain à la fois à l'état naïf non stimulé et au cours d'une période de 72 heures après l'activation médiée par les récepteurs des lymphocytes T. , et la différenciation Th2 induite par l'IL-4. Les cellules CD4+ du sang de cordon représentent l'une des populations de cellules T auxiliaires humaines les plus rares à obtenir, fournissant un système modèle attrayant pour étudier l'activation et la polarisation précoces des cellules T humaines.

À partir des cellules précurseurs T helper (Thp) non stimulées, nous avons répertorié les concentrations de 41 lipides cellulaires, représentant les glycérophospholipides, les sphingomyélines et les triglycérides les plus courants. À notre connaissance, cela représente la caractérisation lipidomique la plus approfondie des cellules T primaires humaines à ce jour, même si la détection d'espèces à plus faible abondance a été interdite par la disponibilité limitée de matériel cellulaire primaire. De plus, certaines classes importantes de lipides telles que les phosphatidylinositols (PI), les phosphatidylsérines (PS) et le cholestérol n'ont pas été incluses dans les données en raison de limitations méthodologiques. Aucun de ces analytes n'est directement compatible avec l'ionisation électrospray positive et leur analyse par MS nécessite soit une dérivatisation, soit des stratégies d'ionisation alternatives (ESI+)(10). D'autres catégories notables en dehors du champ de notre étude comprenaient les glycolipides et la cardiolipine.

L'analyse lipidomique a été répétée en quatre exemplaires à l'aide d'échantillons de cellules primaires regroupés de plusieurs individus pour prendre en compte la variabilité biologique due au régime alimentaire et à d'autres facteurs environnementaux. L'étendue de la variation relative était la plus élevée dans le cas des triglycérides, tandis que les concentrations d'espèces PC abondantes suivaient un schéma plus cohérent. Les triglycérides assurent le stockage des acides gras par l'organisme sous forme de gouttelettes lipidiques intracellulaires, et sont donc sans doute le principal sujet des variations alimentaires. Le lipidome d'une lignée de cellules T Jurkat apparentée a été récemment étudié par Zech et al. (25). La comparaison systématique de ces ensembles de données n'a indiqué aucune différence fondamentale en termes de distribution de l'abondance des phospholipides.

La majorité des phospholipides cellulaires sont localisés dans les membranes cellulaires, principalement dans la membrane plasmique, où leur distribution est asymétrique - feuillet externe composé principalement de sphingolipides, glycosphingolipides et phosphatidylcholine tandis que le feuillet interne est formé de glycérophospholipides tels que la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine (26-31 ). Cette organisation est activement maintenue par les enzymes phospholipides flippase (32). De plus, les lipides de la membrane plasmique sont distribués latéralement dans des microdomaines enrichis en cholestérol et en glycosphingolipides ou « radeaux lipidiques », fournissant un environnement lipidique distinct pour les complexes protéiques transmembranaires (33, 34). Dans les cellules T, ces microdomaines lipidiques jouent un rôle important dans l'activation médiée par les récepteurs des cellules T, réunissant les récepteurs LAT, LCK et stimulateurs tout en isolant des molécules inhibitrices telles que CD45(5). Conceptuellement, cette organisation de microdomaines a été proposée pour faciliter la signalisation de type commutateur, où le taux d'activation reste relativement constant même lorsque la stimulation antigénique varie dans un certain seuil (34). Bien qu'il ait été démontré que les mécanismes de regroupement des récepteurs de lymphocytes T impliquent une régulation par des interactions protéiques, des analyses lipidomiques directes de particules de VIH dérivées de lymphocytes T ainsi que des fractions de rafts de TCR immuno-isolées ont vérifié que la fraction membranaire du TCR est physiquement distincte de la membrane plasmique et est relativement enrichi en SM, cholestérol et PC saturés (35, 36). De plus, en utilisant la microscopie à fluorescence à déplétion par émission stimulée (STED), l'organisation latérale des sphingolipides et du cholestérol a récemment été observée avec succès également dans des cellules vivantes(37).

Bien que la distribution subcellulaire des lipides était au-delà de la portée de cette étude, nous avons pu mesurer des changements notables dans les niveaux de plusieurs glycérophospholipides suite à l'activation des lymphocytes T. En général, la concentration relative des glycérophospholipides polyinsaturés plus longs diminuait vers la fin de la série chronologique mesurée, tandis que les espèces lipidiques plus courtes et plus saturées présentaient une nette augmentation correspondante à 48 et 72 heures. Cette échelle de temps est en corrélation avec les premiers cycles de division cellulaire après activation, suggérant que les propriétés membranaires des cellules filles nouvellement générées diffèrent des progéniteurs non stimulés. Au niveau des concentrations relatives des espèces lipidiques individuelles, ces changements étaient les plus significatifs en cas de régulation à la hausse des PC (30:0), (32:1) et (32:2), et des PE (38:3) et ( 34:2), et diminution relative des CP (38:4) et (O-38:5), et des PE (O-38:7) et (O-38:4). Comme la biosynthèse des acides gras chez les mammifères produit principalement des espèces avec 14 à 18 carbones et un faible degré de saturation (38), on pourrait suggérer que les changements observés dans la concentration en lipides reflètent une régulation positive de la biosynthèse des acides gras endogènes et une diminution relative des acides gras alimentaires dans les cellules membranes. Fait intéressant, dans les macrophages, il a été démontré que la synthèse de PC est une condition préalable à la sécrétion de cytokines (39).

Des rapports récents ont démontré que l'expression des lipides associés au radeau, tels que le ganglioside GM1, le lactosylcéramide, le glucosylcéramide, le céramide, la sphingomyéline et le cholestérol, est régulée à la hausse en réponse à l'activation par le TCR et le CD28 (40-43). Au moins dans les cas de GM1 et de cholestérol, la régulation positive dépend d'une synthèse de novo accrue (41, 43). Au vu de ces observations, la question se pose de savoir si les changements lipidomiques observés dans les données actuelles reflètent également une régulation à la hausse des composants du radeau. Plus précisément, il a été rapporté que les espèces de PC saturées avec 1 ou 0 double liaison et 34 ou moins de carbones d'acyle gras sont enrichies dans les radeaux de TCR, tandis que les espèces plus longues et moins saturées sont appauvries par rapport au lipidome total (36). Cependant, parmi les espèces de PC les plus significativement enrichies (34:1), (32:0) et (30:0), seule (30:0) était clairement régulée à la hausse dans nos données. De plus, les données de radeau de Zech et al. ne montre aucun enrichissement en espèces PE saturées dans les fractions TCR. Dans l'ensemble, il n'était pas évident que l'association avec les radeaux de TCR expliquerait tous les changements observés induits par le TCR dans le lipidome des cellules T primaires.

Les demandes métaboliques fortement accrues des cellules T activées sont mises en évidence par un changement du catabolisme du glucose de la phosphorylation oxydative à la glycolyse. Cette transition réversible vers ce que l'on appelle le métabolisme de Warburg a été proposée comme un moyen pour une cellule de maximiser l'accumulation de nouvelle biomasse dans des conditions de concentration de glucose non limitative (44), et est corrélée à la régulation à la hausse de l'absorption de nutriments dans les cellules activées. Ce mécanisme est associé au taux de prolifération très élevé des cellules T activées, et est généralement utilisé également par les cellules cancéreuses. Des preuves récentes ont montré que dans le cancer du sein, l'effet Warburg s'accompagne d'une régulation à la hausse de la synthèse de novo des acides gras et d'une altération subséquente des propriétés de la membrane plasmique (45). Entre autres, la concentration de PC (14:0/16:0) était constamment augmentée dans les cellules tumorales et était associée à la progression tumorale, ressemblant à l'augmentation relative observée de PC (30:0) dans les cellules T activées.

La régulation transcriptomique des cellules T activées dans un système expérimental identique a déjà été étudiée (14). Bien que les voies de régulation du métabolisme des lipides soient complexes et encore incomplètement connues, l'intégration des ensembles de données d'ARNm et de lipides a fourni plusieurs mécanismes régulateurs potentiels agissant en réponse à l'activation des lymphocytes T. Plus frappant encore, l'expression du gène de la stéaroyl CoA-désaturase (SCD) était fortement régulée à la hausse dans les cellules activées. Le SCD catalyse la désaturation n-9 des acides gras 16:0 et 18:0 et constitue un nœud régulateur du métabolisme des acides gras, mis en évidence par le fait que les souris knock-out SCD ont une synthèse lipidique gravement altérée (46). Fait intéressant, dans la différenciation des macrophages induite par le M-CSF, la SCD augmente les acides gras monoinsaturés et conduit à une quantité réduite d'acides gras polyinsaturés(47). SCD est réglementé par SREBP-1/2, LXRα, RXRα et PPARα(48, 49). Parmi ceux-ci, RXRα et PPARα se sont avérés modérément régulés à la hausse en réponse à l'activation du TCR dans les cellules T CD4 + humaines, fournissant une voie de régulation possible. En plus de la SCD, les désaturases FADS1 et FADS2 ont été induites en réponse à l'activation des lymphocytes T, ainsi que l'élongase ELOVL6. Il a été démontré que ELOVL6, ELOVL3 et SCD font partie d'un réseau de régulation qui contrôle l'homéostasie lipidique (16, 49). Ces propriétés régulatrices émergentes pourraient également sous-tendre les changements de concentration spécifiques observés dans les cellules T activées. En plus des enzymes des voies de synthèse des acides gras, certains changements dans la régulation du métabolisme des glycérophospholipides ont été détectés. À savoir, la régulation à la hausse de Pcyt2 et des lysophospholipides acétyltransférases spécifiques suggèrent que la composition lipidique des cellules T pourrait être spécifiquement régulée à plusieurs niveaux.

Dans les présentes données, la cinétique des lipides dans les cellules stimulées en présence ou en l'absence d'IL-4 était presque identique, suggérant que l'activation du TCR délivre un signal sensiblement plus fort en termes de changement métabolique. Ceci est conforme à nos précédentes enquêtes au niveau du transcriptome et du protéome, dans lesquelles des changements profonds ont été mesurés en réponse à l'activation des cellules T tandis que la différenciation des sous-ensembles de cellules T induite par les cytokines impliquait une réponse plus définie (14, 50, 51). Cependant, Miguel et al. ont récemment démontré une hétérogénéité dans l'organisation de la membrane plasmique des cellules CD4 + T primaires humaines avec des implications ultérieures sur les seuils cellulaires d'activation et d'apoptose, suggérant que les cellules polarisées Th2 conservent un niveau d'ordre membranaire plus élevé que la population Th1, évaluée à l'aide d'une membrane fluorescente sondes (13). Notre approche globale n'a malheureusement pas permis une validation quantitative de ces résultats. Notamment, le rôle de mTOR en tant que régulateur central du métabolisme des cellules T est de plus en plus apprécié. Intégrateur de multiples signaux environnementaux, mTOR régule la croissance cellulaire à la fois spatialement et temporellement (52, 53). Des preuves récentes ont indiqué que l'intégration des signaux environnementaux par mTOR est en outre impliquée dans la différenciation des sous-ensembles de cellules T auxiliaires (54). Dans un contexte plus large, il a été démontré que la perturbation de la biosynthèse des nucléotides fausse l'équilibre Th1/Th2, fournissant une preuve supplémentaire de voies métaboliques distinctes dans les sous-ensembles de cellules T auxiliaires (55). L'étendue et le rôle précis de la régulation métabolomique au cours de la différenciation des sous-ensembles de lymphocytes T nécessitent donc encore une enquête plus approfondie.

Dans l'ensemble, les présentes données illustrent une plasticité remarquable dans la composition lipidique des lymphocytes T humains en réponse à l'activation par stimulation des voies du récepteur des lymphocytes T et du CD28. Les données transcriptomiques suggèrent que cette plasticité est régulée au niveau de l'ARN par l'activation des voies de biosynthèse des acides gras, entraînant une incorporation accrue d'acides gras produits de novo dans la membrane plasmique. Alors qu'une diminution de la saturation en phospholipides est généralement corrélée à une diminution de la fluidité membranaire (56), il reste à déterminer si les changements observés dans cette étude ont des conséquences fonctionnelles spécifiques sur la fonction membranaire. Il est important de noter que des données récentes sur les adipocytes humains indiquent que les propriétés biophysiques de la membrane peuvent être activement maintenues malgré le remodelage des composants lipidiques membranaires(57). En ce qui concerne des systèmes cellulaires spécifiques tels que les lymphocytes T, des informations importantes sur la régulation spatiale des lipides pourraient être obtenues par une analyse parallèle de compartiments sous-cellulaires distincts. Chaque organite confinée par une bicouche membranaire lipidique, telle que le réticulum endoplasmique (RE), l'appareil de Golgi et les mitochondries, exprime une composition lipidique caractéristique, activement régulée par la synthèse localisée et le transport des lipides. Par conséquent, l'expansion ou la réduction sélective d'un compartiment cellulaire spécifique pourrait être à la base de certains des changements lipidomiques observés dans cette étude. Selon des rapports récents, les quantités de mitochondries et de RE sont régulées par la macroautophagie pendant le développement des cellules T, ce qui entraîne une réduction significative du contenu mitochondrial et des RE dans les cellules T périphériques matures (58, 59). Dans les cellules activées par le TCR, la macroautophagie est encore induite, mais cible principalement les composants cytosoliques solubles et est en corrélation avec une augmentation modérée du nombre et de la taille des mitochondries (60). De plus, il a été démontré que les cellules humaines contiennent des pools distincts de phosphatidylcholine cytoplasmique et nucléaire, dont cette dernière est principalement saturée et a potentiellement un rôle structurel en association avec la chromatine(61). De telles approches lipidomiques ciblées, cependant, nécessiteront encore le développement de méthodes de fractionnement cellulaire appropriées (62). Les résultats de la présente étude devraient fournir un cadre utile pour de telles enquêtes.

Riitta Lahesmaa et Matej Oresic ont contribué à parts égales à ce manuscrit. Nous tenons à remercier tous les donneurs de sang volontaires, le personnel du département d'obstétrique et de gynécologie de l'hôpital universitaire de Turku, service de maternité (district hospitalier du sud-ouest de la Finlande) pour la collecte des échantillons. Le travail a été soutenu par l'Académie de Finlande (Centre d'excellence en recherche sur l'immunologie et la physiologie des systèmes moléculaires, 2012-2017, décision n° 250114, et les subventions 207490 SYSBIO, 116639, 115939, 140019), les subventions du septième cadre de la Commission européenne (CE -FP7-SYBILLA-201106, EC-FP7-NANOMMUNE-214281 et EC-FP7-DIABIMMUNE-202063), FRDJ, The Sigrid Juselius Foundation, Turku University Hospital Grant et Turku University Foundation. Marjo Hakkarainen est reconnue pour son assistance technique compétente. Le Dr Robert Moulder est reconnu pour avoir révisé la langue du manuscrit.

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Mots clés : métabolisme lipidique, métabolomique, activation des récepteurs des cellules T, différenciation des cellules T auxiliaires


Voir la vidéo: Cours 10: Régulation de lexpression chez les eucaryotes (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Willmarr

    Tout autour d'un et donc infiniment

  2. Calibor

    Super classe !!!

  3. JoJoramar

    Curieusement, mais ce n'est pas clair

  4. Teka

    Je peux recommander d'aller sur le site, où il existe de nombreux articles sur le sujet qui vous intéressent.

  5. Eldred

    Oui ne peut pas être!

  6. Keaira

    Au lieu de critiquer, conseillez une solution au problème.



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