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5.10C : Oxydation des composés soufrés réduits - Biologie

5.10C : Oxydation des composés soufrés réduits - Biologie



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L'oxydation du soufre implique l'oxydation de composés soufrés réduits, de soufre inorganique et de thiosulfate pour former de l'acide sulfurique.

Objectifs d'apprentissage

  • Décrire le processus d'oxydation du soufre

Points clés

  • L'oxydation du sulfure se produit par étapes, le soufre inorganique étant stocké à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
  • Ce processus en deux étapes se produit parce que le sulfure est un meilleur donneur d'électrons que le soufre inorganique ou le thiosulfate ; cela permet à un plus grand nombre de protons d'être transloqués à travers la membrane.
  • Les organismes oxydant le soufre génèrent un pouvoir réducteur pour la fixation du dioxyde de carbone via le cycle de Calvin en utilisant un flux d'électrons inversé, un processus exigeant de l'énergie qui pousse les électrons contre leur gradient thermodynamique pour produire du NADH.

Mots clés

  • cycle de calvin: Une série de réactions biochimiques qui ont lieu dans le stroma des chloroplastes des organismes photosynthétiques.
  • thiosulfate: Tout sel ou ester de l'acide thiosulfurique.
  • chimiolithoautotrophe: Caractéristique d'un micro-organisme qui tire de l'énergie de l'oxydation de composés inorganiques et du carbone de la fixation du dioxyde de carbone.

Le soufre est un élément essentiel à toute vie et il est largement utilisé dans les processus biochimiques. Dans les réactions métaboliques, les composés soufrés servent à la fois de carburants et de matériaux respiratoires (alternatifs à l'oxygène) pour les organismes simples. Le soufre est une partie importante de nombreuses enzymes et molécules antioxydantes telles que le glutathion et la thiorédoxine.

Oxydation du soufre

L'oxydation du soufre implique l'oxydation de composés soufrés réduits tels que le sulfure (H2S), soufre inorganique (S0), et le thiosulfate (S2O2−3) pour former de l'acide sulfurique (H2DONC4). Un exemple de bactérie oxydant le soufre est Paracoccus.

Généralement, l'oxydation du sulfure se produit par étapes, le soufre inorganique étant stocké à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule jusqu'à ce qu'il soit nécessaire. Le processus en deux étapes se produit parce que le sulfure est un meilleur donneur d'électrons que le soufre inorganique ou le thiosulfate ; cela permet à un plus grand nombre de protons d'être transloqués à travers la membrane. Les organismes oxydant le soufre génèrent un pouvoir réducteur pour la fixation du dioxyde de carbone via le cycle de Calvin en utilisant un flux d'électrons inversé, un processus exigeant de l'énergie qui pousse les électrons contre leur gradient thermodynamique pour produire du NADH. Biochimiquement, les composés soufrés réduits sont convertis en sulfite (SO2−3) et, par la suite, du sulfate (SO2−4) par l'enzyme sulfite oxydase. Certains organismes, cependant, accomplissent la même oxydation en utilisant une inversion du système APS réductase utilisé par les bactéries sulfato-réductrices (voir ci-dessus). Dans tous les cas, l'énergie libérée est transférée à la chaîne de transport d'électrons pour la production d'ATP et de NADH. En plus de l'oxydation aérobie du soufre, certains organismes (par exemple Thiobacillus denitrificans) utilisent du nitrate (NO−3) en tant qu'accepteur terminal d'électrons et donc croître de manière anaérobie.

Beggiatoa

Un exemple classique de bactérie oxydant le soufre est Beggiatoa, un microbe initialement décrit par Sergei Winogradsky, l'un des fondateurs de la microbiologie environnementale. Beggiatoa peut être trouvé dans des environnements marins ou d'eau douce. Ils peuvent généralement être trouvés dans des habitats qui ont des niveaux élevés de sulfure d'hydrogène. Ces environnements comprennent les suintements froids, les sources de soufre, les eaux usées contaminées, les couches de boue des lacs et les sources hydrothermales proches. Beggiatoa peut également être trouvé dans la rhizosphère des plantes marécageuses. Au cours de ses recherches dans le laboratoire de botanique d'Anton de Bary en 1887, le botaniste russe Winogradsky a découvert que Beggiatoa oxydait le sulfure d'hydrogène (H2S) comme source d'énergie, formant des gouttelettes de soufre intracellulaires. Winogradsky a qualifié cette forme de métabolisme d'inorgoxydation (oxydation de composés inorganiques). La découverte a représenté la première découverte de la lithotrophie.

Beggiatoa peut se développer de manière chimioorgano-hétérotrophe en oxydant des composés organiques en dioxyde de carbone en présence d'oxygène, bien que des concentrations élevées d'oxygène puissent être un facteur limitant. Les composés organiques sont également la source de carbone pour la biosynthèse. Certaines espèces peuvent oxyder le sulfure d'hydrogène en soufre élémentaire comme source d'énergie supplémentaire (facultativement litho-hétérotrophe). Ce soufre est stocké intracellulairement. Certaines espèces ont la capacité de croissance chimiolithoautotrophe, en utilisant l'oxydation des sulfures pour l'énergie et le dioxyde de carbone comme source de carbone pour la biosynthèse. Dans ce processus métabolique, le nitrate stocké en interne est l'accepteur d'électrons et réduit en ammoniac.

Oxydation des sulfures : 2H2S + O2 → 2S + 2H2O

Les espèces marines autotrophes de Beggiatoa sont capables d'oxyder le soufre intracellulaire en sulfate. La réduction du soufre élémentaire se produit fréquemment lorsque l'oxygène manque. Le soufre est réduit en sulfure au prix du carbone stocké ou par l'ajout d'hydrogène gazeux. Cela peut être une stratégie de survie pour combler les périodes sans oxygène


Oxydation des composés soufrés inorganiques par des bactéries obligatoirement organotrophes

De nouvelles données obtenues par l'auteur et d'autres chercheurs sur deux groupes différents de bactéries obligatoirement hétérotrophes capables d'oxyder le soufre inorganique sont passées en revue. Parmi les hétérotrophes marins et (halo)alcaliphiles cultivables oxydant les composés soufrés (thiosulfate et, beaucoup moins activement, soufre élémentaire et sulfure) incomplètement en tétrathionate, des représentants des gammaprotéobactéries, en particulier de la Halomonas groupe, dominer. Certaines espèces dénitrifiantes de ce groupe sont capables d'effectuer une oxydation anaérobie du thiosulfate et du sulfure en utilisant des oxydes d'azote comme accepteurs d'électrons. Malgré la faible production d'énergie de la réaction d'oxydation du thiosulfate en tétrathionate, il peut être utilisé pour la synthèse d'ATP par certains hétérotrophes producteurs de tétrathionate, cependant, ce potentiel n'est pas toujours réalisé au cours de leur croissance. Un autre groupe de bactéries hétérotrophes marines et (halo)alcaliphiles capables d'une oxydation complète des composés soufrés en sulfate comprend principalement des représentants des alphaprotéobactéries qui sont les plus étroitement apparentées aux bactéries violettes non soufrées. Ils peuvent oxyder le sulfure (polysulfure), le thiosulfate et le soufre élémentaire via le sulfite en sulfate mais ne produisent ni n'oxydent le tétrathionate. Toutes les bactéries hétérotrophes formatrices de sulfate étudiées appartiennent aux lithohétérotrophes, étant capables de gagner de l'énergie supplémentaire grâce à l'oxydation des composés soufrés au cours de la croissance hétérotrophe sur des substrats organiques. Certains cas douteux d'oxydation hétérotrophe du soufre décrits dans la littérature sont également discutés.


Résumé

La faisabilité de la réutilisation de la cendre de bois comme catalyseur peu coûteux dans un procédé d'ozonation catalytique a été démontrée. Il a été démontré que l'ozonation catalytique oxyde H2S, méthanethiol (MT), sulfure de diméthyle (DMS) et disulfure de diméthyle (DMDS) à basse température (23-25 ​​°C). Le procédé a oxydé 25 à 50 % d'un flux MT d'entrée à 70 ppmv sans formation de DMDS (contrairement aux cendres et à l'oxygène de l'air), a oxydé 90 à 95 % d'un flux de 85 ppmv de DMS et a oxydé 50 % d'un flux de 100 ppmv Flux de DMDS utilisant 2 g de cendre de bois à une vitesse spatiale de 720 h - 1 utilisant des concentrations d'ozone allant de 100 à 300 ppmv. De même, 60-70% de conversion d'un 70 ppmv H2Le flux S a été obtenu avec 2 g de cendres en 1,1 s sans désactivation catalytique (∼44 h). Le taux d'oxydation global de H2Le S, le DMS et le DMDS augmentaient avec l'augmentation de la concentration d'ozone contrairement au taux d'oxydation de la MT, qui était indépendant de la concentration d'ozone. Le diméthylsulfoxyde et le diméthylsulfone ont été identifiés comme les principaux produits finaux de l'oxydation du DMS, et le SO2 était le produit final de H2Oxydation S et MT.

Téléphone de l'auteur correspondant : (706)583-0155 Fax : (706)542-8806 e-mail : [email protected]


L'oxydation réduite du soufre inorganique favorise la croissance autotrophe et mixotrophe de la souche J10 de Magnetospirillum et de Magnetospirillum gryphiswaldense

N2 - Les bactéries magnétotactiques sont présentes dans la zone de transition oxique-anoxique où existent des gradients opposés d'oxygène et de soufre réduit et de fer. La croissance de la souche J10 de Magnetospirillum lithoautotrophe non magnétotactique et de son proche parent Magnetospirillum gryphiswaldense magnétotactique a été caractérisée en culture continue microaérobie. Les deux souches ont pu se développer dans des conditions mixotrophes (acétate + sulfure) et autotrophes (sulfure ou thiosulfate). Les cellules en croissance autotrophe ont complètement converti le sulfure ou le thiosulfate en sulfate et ont produit 7,5 g de poids sec par mol de substrat à un taux de croissance maximal observé de 0,09 h (-1) pour la souche J10 et de 0,07 h (-1) pour M. gryphiswaldense. L'activité respiratoire de l'acétate a été réprimée dans les cultures autotrophes et également dans les cultures mixotrophes, ce qui suggère que l'acétate a été utilisé comme source de C dans ces dernières. Nous avons estimé les proportions de substrat utilisées pour les processus d'assimilation et évalué les rendements en biomasse par mol de substrat dissipé. Le rendement pour la croissance lithohétérotrophe en utilisant l'acétate comme source de C était approximativement le double du rendement de croissance autotrophe et très similaire au rendement hétérotrophe, montrant l'importance des composés soufrés réduits pour la croissance. Dans le projet de séquence du génome de M. gryphiswaldense, des homologues de gènes codant pour un système enzymatique d'oxydation partielle du soufre (Sox) et une sulfite réductase dissimilatrice inverse (Dsr) ont été identifiés, qui pourraient être impliqués dans l'oxydation du sulfure et du thiosulfate. Magnetospirillum gryphiswaldense est la première espèce magnétotactique d'eau douce pour laquelle une croissance autotrophe est montrée

AB - Les bactéries magnétotactiques sont présentes dans la zone de transition oxique-anoxique où existent des gradients opposés d'oxygène et de soufre réduit et de fer. La croissance de la souche J10 de Magnetospirillum lithoautotrophe non magnétotactique et de son proche parent magnétotactique Magnetospirillum gryphiswaldense a été caractérisée en culture continue microaérobie. Les deux souches ont pu se développer dans des conditions mixotrophes (acétate + sulfure) et autotrophes (sulfure ou thiosulfate). Les cellules en croissance autotrophe ont complètement converti le sulfure ou le thiosulfate en sulfate et ont produit 7,5 g de poids sec par mol de substrat à un taux de croissance maximal observé de 0,09 h (-1) pour la souche J10 et de 0,07 h (-1) pour M. gryphiswaldense. L'activité respiratoire de l'acétate a été réprimée dans les cultures autotrophes et également dans les cultures mixotrophes, ce qui suggère que l'acétate a été utilisé comme source de C dans ces dernières. Nous avons estimé les proportions de substrat utilisées pour les processus d'assimilation et évalué les rendements en biomasse par mol de substrat dissipé. Le rendement pour la croissance lithohétérotrophe en utilisant l'acétate comme source de C était approximativement le double du rendement de croissance autotrophe et très similaire au rendement hétérotrophe, montrant l'importance des composés soufrés réduits pour la croissance. Dans le projet de séquence du génome de M. gryphiswaldense, des homologues de gènes codant pour un système enzymatique d'oxydation partielle du soufre (Sox) et une sulfite réductase dissimilatrice inverse (Dsr) ont été identifiés, qui pourraient être impliqués dans l'oxydation du sulfure et du thiosulfate. Magnetospirillum gryphiswaldense est la première espèce magnétotactique d'eau douce pour laquelle une croissance autotrophe est montrée


Oxydation du fer

Le fer ferrique est un accepteur d'électrons terminal anaérobie, avec l'enzyme finale une réductase de fer ferrique.

Objectifs d'apprentissage

Décrire le but de l'oxydation du fer et les trois types de microbes oxydant le fer ferreux (acidophiles, microaérophiles et bactéries photosynthétiques anaérobies)

Points clés à retenir

Points clés

  • Le fer ferreux est une forme soluble de fer qui est stable à des pH extrêmement bas ou dans des conditions anaérobies. Dans des conditions aérobies à pH modéré, le fer ferreux s'oxyde spontanément en forme ferrique (Fe3+) et est hydrolysé abiotiquement en hydroxyde ferrique insoluble (Fe(OH)3).
  • Trois types distincts de microbes oxydant le fer ferreux : les acidophiles, les microaérophiles qui oxydent le fer ferreux à un pH neutre cirum, les bactéries photosynthétiques anaérobies qui utilisent le fer ferreux pour produire du NADH pour la fixation autotrophe du dioxyde de carbone.
  • Bien que le fer ferrique soit l'accepteur d'électrons inorganique le plus répandu, un certain nombre d'organismes peuvent utiliser d'autres ions inorganiques dans la respiration anaérobie.

Mots clés

  • autotrophe: Tout organisme qui peut synthétiser sa nourriture à partir de substances inorganiques, en utilisant la chaleur ou la lumière comme source d'énergie.
  • hétérotrophe: Un organisme qui a besoin d'un apport externe d'énergie sous forme de nourriture car il ne peut pas synthétiser la sienne.

Le fer ferrique (Fe 3+ ) est un accepteur terminal d'électrons anaérobie répandu à la fois pour les organismes autotrophes et hétérotrophes. Le flux d'électrons dans ces organismes est similaire à celui du transport d'électrons, se terminant par l'oxygène ou le nitrate, sauf que dans les organismes ferriques réducteurs, l'enzyme finale de ce système est une réductase ferrique. Les organismes modèles comprennent Shewanella putrefaciens et Geobacter metallireducens. Étant donné que certaines bactéries réductrices du fer ferrique (par exemple G. metallireducens) peuvent utiliser des hydrocarbures toxiques tels que le toluène comme source de carbone, il existe un intérêt important à utiliser ces organismes comme agents de bioremédiation dans les aquifères contaminés riches en fer ferrique.

Bactéries de fer: Les effets courants d'un excès de fer dans l'eau sont une couleur brun rougeâtre et un linge taché. Les bactéries ferreuses font naturellement partie de l'environnement dans la plupart des régions du monde. Ces micro-organismes combinent du fer ou du manganèse dissous avec de l'oxygène et l'utilisent pour former des dépôts de couleur rouille. Au cours du processus, les bactéries produisent une boue brune qui s'accumule sur les grilles de puits, les tuyaux et les appareils de plomberie. Les bactéries connues pour se nourrir de fer sont Thiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans.

Le fer ferreux est une forme soluble de fer qui est stable à des pH extrêmement bas ou dans des conditions anaérobies. Dans des conditions aérobies à pH modéré, le fer ferreux s'oxyde spontanément en forme ferrique (Fe 3+ ) et est hydrolysé abiotiquement en hydroxyde ferrique insoluble (Fe(OH)3). Il existe trois types distincts de microbes oxydant le fer ferreux. Les premiers sont des acidophiles, comme les bactéries Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans, ainsi que l'archéon Ferroplasma. Ces microbes oxydent le fer dans des environnements qui ont un pH très bas et sont importants dans le drainage minier acide. Le deuxième type de microbes oxyde le fer ferreux à pH cirum neutre. Ces micro-organismes (par exemple Gallionella ferruginea ou Leptothrix ochracea) vivent aux interfaces oxiques-anoxiques et sont des microaérophiles. Le troisième type de microbes oxydant le fer est constitué par les bactéries photosynthétiques anaérobies telles que Rhodopseudomonas, qui utilisent le fer ferreux pour produire du NADH pour la fixation autotrophe du dioxyde de carbone. Biochimiquement, l'oxydation aérobie du fer est un processus très pauvre en énergie qui nécessite donc l'oxydation de grandes quantités de fer par l'enzyme rusticyanine pour faciliter la formation de la force motrice du proton. Comme l'oxydation du soufre, le flux d'électrons inverse doit être utilisé pour former le NADH utilisé pour la fixation du dioxyde de carbone via le cycle de Calvin.

Bien que le fer ferrique soit l'accepteur d'électrons inorganique le plus répandu, un certain nombre d'organismes (y compris les bactéries réductrices de fer mentionnées ci-dessus) peuvent utiliser d'autres ions inorganiques dans la respiration anaérobie. Bien que ces processus soient souvent moins importants sur le plan écologique, ils présentent un intérêt considérable pour la biorestauration, en particulier lorsque des métaux lourds ou des radionucléides sont utilisés comme accepteurs d'électrons. Les exemples comprennent:

  • Réduction des ions manganiques (Mn 4+ ) en ions manganeux]] (Mn 2+ )
  • Sélénate (SeO2 −4 ) réduction en sélénite (SeO2 −3 ) et réduction du sélénite en sélénium inorganique (Se0)
  • Arsenate (AsO3 −4 ) réduction en arsénite (AsO3 −3 )
  • Ion uranyle (UO2 +2 ) réduction en dioxyde d'uranium (UO2)

5.10C : Oxydation des composés soufrés réduits - Biologie

La respiration aérobie - la réduction de l'oxygène moléculaire (O 2 ) couplée à l'oxydation de composés réduits tels que le carbone organique, le fer ferreux, les composés soufrés réduits ou l'hydrogène moléculaire tout en conservant l'énergie pour conduire les processus cellulaires - est le métabolisme le plus répandu et le plus bioénergétiquement favorable. sur Terre aujourd'hui. La respiration aérobie est essentielle pour le développement d'une vie multicellulaire complexe, donc la présence d'O 2 abondant est une mesure importante pour l'habitabilité planétaire. L'O 2 sur Terre est fourni par la photosynthèse oxygénée, mais il est de plus en plus largement compris que les processus abiotiques peuvent fournir des quantités significatives d'O 2 sur d'autres mondes. L'atmosphère moderne et les enregistrements rocheux de Mars suggèrent une histoire d'O 2 relativement élevée en raison de processus photochimiques, chevauchant potentiellement la gamme de concentrations d'O 2 utilisée par la biologie. Europa peut avoir accumulé des concentrations élevées d'O 2 dans son océan souterrain en raison de la radiolyse de la glace d'eau à sa surface. Des efforts de modélisation récents suggèrent que la coexistence de l'eau et de l'O 2 pourrait être courante sur les exoplanètes, avec une confirmation des mesures des atmosphères des exoplanètes qui pourrait bientôt arriver. Dans tous ces cas, l'O 2 s'accumule par des processus abiotiques, indépendants de la photosynthèse oxydant l'eau. Nous émettons l'hypothèse que l'O 2 abiogène peut améliorer l'habitabilité de certains environnements planétaires, permettant une respiration aérobie hautement énergétique et potentiellement même le développement d'une vie multicellulaire complexe qui en dépend, sans qu'il soit nécessaire de développer d'abord la photosynthèse oxygénée. Cette hypothèse est vérifiable avec d'autres efforts d'exploration et de détection de vie sur des mondes riches en O 2 tels que Mars et Europe, et une comparaison avec des mondes pauvres en O 2 comme Encelade. Cette hypothèse suggère en outre une nouvelle dimension à l'habitabilité planétaire : "Follow the Oxygen", dans laquelle les environnements offrant des possibilités de métabolismes riches en énergie tels que la respiration aérobie sont préférentiellement ciblés pour l'investigation et la détection de la vie.


La protéine TusA

TusA (cd00291) est une protéine 8-kDa hautement conservée et largement distribuée qui peut être trouvée sous forme de protéine unique ou fusionnée à d'autres protéines telles que les cystéine désulfurases ou les rhodaneses 4, 24, 25. TusA a été largement étudié à la fois structurellement et fonctionnellement 25, 26. Toutes les protéines TusA contiennent un motif de séquence Cys-Pro-X-Pro commun dans la région N-terminale avec la cystéine de liaison au soufre sulfane comme élément central 4, 11, 25. Dans E. coli, le motif contient un résidu glutamate en position « X », qui est remplacé par un résidu hydrophobe (leucine le plus souvent, parfois isoleucine ou méthionine) ou glycine dans les protéines des oxydants de soufre 4 . Des preuves émergent que l'acide aminé non conservé dans le motif est un élément décisif pour l'interaction de TusA avec ses différents partenaires protéiques possibles 4, 24. TusA seul est incapable de mobiliser le soufre du thiosulfate ou des persulfures organiques de bas poids moléculaire comme le persulfure de glutathion (GSSH réf. 4).

Pour E. coli, il est bien établi que TusA fonctionne comme un médiateur du soufre pour la synthèse de la 2-thiouridine de la base modifiée 5-méthyl-aminométhyl-2-thiouridine [(mnm) 5 s 2 U] dans l'ARNt 27 . Au cours des dernières années, plusieurs rôles supplémentaires ont été attribués à TusA. UNE tusA-déficient E. coli souche s'est avérée former des cellules filamenteuses en raison d'une altération sévère de la formation d'anneaux FtsZ 28, 29. En outre, TusA en conjonction avec TusBCD et TusE semble jouer un rôle dans le maintien de l'état redox intracellulaire 30, et il a été suggéré que TusA est impliqué dans le transfert de soufre pour la synthèse de molybdopterine et également dans la régulation équilibrée de la disponibilité d'IscS à diverses biomolécules dans E. coli 24 . Pris ensemble, tous ces résultats indiquent un rôle pléiotrope pour TusA dans E. coli qui implique une interaction spécifique avec plusieurs partenaires protéiques différents 24 .

Les analyses bioinformatiques et le profilage transcriptomique ont fourni les premiers indices que le rôle de TusA dans les bactéries autres que E. coli ne se limite pas aux procédés de biosynthèse. Dans plusieurs oxydants de soufre, y compris Acidithiobacillus ferrooxidans, Metallosphaera sedula, et la bactérie du soufre pourpre Allochromatium vinosum, niveaux relatifs d'ARNm pour tusA étaient significativement plus élevés dans des conditions d'oxydation du soufre qu'en l'absence de composés soufrés réduits 22, 31-33 . Un A. vinosum souche déficiente de la rhd-tusA-dsrE2 gènes a été altérée dans sa capacité à dégrader le soufre de valence zéro formé lors de l'oxydation du sulfure et du thiosulfate 4 . Le rôle éminemment important de TusA est en outre mis en évidence par la découverte que TusA est parmi les protéines les plus abondantes dans A. vinosum cellules cultivées photolithoautotrophe sur des composés soufrés réduits (Fig. 2 réf. 34). Dans ces cellules, les enzymes impliquées dans la fixation du dioxyde de carbone (RubisCo, phosphoribulokinase), la photosynthèse (complexes de récolte de lumière) et la conservation de l'énergie (sous-unités de l'ATP synthase) sont très abondantes. De plus, les enzymes du métabolisme oxydatif du soufre comme le flavocytochrome c la sulfure déshydrogénase (FccAB), DsrA et DsrC et les composants du système Sox dominent parmi les protéines les mieux classées. Il est intéressant de noter que même SoxYZ et DsrC, les protéines donneuses de substrat soufré dans les systèmes Sox et Dsr, respectivement, sont surpassées en nombre par TusA (Fig. 2).

Les 150 protéines les plus abondantes dans A. vinosum cultivé avec du soufre comme donneur d'électrons. Les protéines sont classées en fonction du rapport de leurs correspondances de spectre peptidique et du nombre d'acides aminés évitant ainsi une sous-estimation des petites et une surestimation des grandes protéines. Les protéines appartenant à cinq groupes fonctionnels ont été distinguées : conservation de l'énergie (bleu) métabolisme C (vert) expression génique, réplication et chaperons (gris) photosynthèse (rouge) et métabolisme du soufre (jaune). Données extraites de la réf. 34.


Discussion

Cette étude fournit la première preuve moléculaire que divers gènes du métabolisme énergétique du soufre sont présents et activement transcrits dans le S. velum population de symbiotes sous in situ conditions. Le métatranscriptome contenait des transcrits de bactéries codant pour les gènes de plusieurs voies primaires d'oxydation du soufre, y compris le complexe de dissimilation inverse sulfite réductase (Dsr) pour l'oxydation du soufre en sulfite, la voie adénosine-5 ′ -phosphate (APS) réductase pour l'oxydation du sulfite, et la voie d'oxydation du soufre (Sox) médiant l'oxydation du thiosulfate. Au total, les gènes d'oxydation du soufre identifiés ici (m = 28 Figure 4) représentait 6,6% des lectures codant pour les protéines bactériennes dans l'ensemble de données (1 séquence sur 15). Plusieurs gènes codant pour des enzymes pour l'oxydation des sulfures et des thiosulfates, y compris le dsr les gènes et SAT (ATP sulfurylase) figuraient parmi les gènes de référence les plus abondants (c'est-à-dire les numéros d'accession uniques) détectés dans l'étude (figure 3). Beaucoup d'entre eux étaient plus étroitement liés à des homologues de gammaprotéobactéries oxydant le soufre (figures 1&# x020133), en particulier A. vinosum et Endoriftia perséphone, le symbiote du ver tubicole Riftia pachyptila, en accord avec le placement phylogénétique du Solémia symbiote au sein de ce groupe (Eisen et al., 1992 Distel, 1998). Étonnamment, un seul gène de référence, le précédemment caractérisé cbbL gène codant pour la grande sous-unité du CO2 enzyme de fixation RubisCO (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase&# x02013oxygénase) de la S. velum symbiote, représentait plus de 4 % de toutes les lectures codant pour les protéines (figure 3). La forte abondance de transcrits pour les enzymes de l'oxydation des composés soufrés et de la fixation du carbone suggère que la thioautotrophie dominait le métabolisme de la communauté symbiotique au moment de la collecte au début de l'hiver.

Les gènes de la voie inverse Dsr étaient parmi les plus fortement exprimés dans le métatranscriptome symbiote (Figures 3 et 4). Chez les bactéries sulfato-réductrices et les archées, la sulfite réductase dissimilatrice (DsrAB) médie la réduction des sulfites en sulfure (Klein et al., 2001 Wagner et al., 2005). Des homologues de DsrAB ont été isolés à partir d'une grande variété de taxons oxydant le soufre (Loy et al., 2009), dans lesquels on pense que les enzymes fonctionnent dans le sens oxydatif en conjonction avec un ensemble diversifié de protéines accessoires, y compris le complexe transmembranaire DsrMKJOP , les molécules navettes de soufre DsrEFH et DsrC, et la flavoprotéine cytoplasmique DsrL (Dahl et al., 2005 Ghosh et Dam, 2009), qui ont toutes été détectées dans le Solémia transcriptome du symbiote (Figure 4). Il a été suggéré que le sulfure pour l'oxydation par le complexe DsrAB est libéré via la réduction d'une molécule porteuse de polysoufre, comme catalysé par l'activité NADH : (accepteur) oxydoréductase de DsrL (Dahl et al., 2005), qui a été montré à être critique pour l'oxydation du soufre dans A. vinosum (Lubbe et al., 2006). Chez cette espèce, la molécule porteuse peut être un perthiol organique impliqué dans le transport du soufre élémentaire stocké (globules de soufre) du périplasme vers le cytoplasme (Frigaard et Dahl, 2009). Globules de soufre stockés dans A. vinosum sont produites lors de la croissance sur sulfure par des enzymes dont FccAB et Sqr ou via l'activité de la voie Sox lors de la croissance sur thiosulfate (Frigaard et Dahl, 2009 Ghosh et Dam, 2009). Fait intéressant, le dépôt de globules de stockage de soufre, bien que commun dans d'autres symbiotes thioautotrophes (par exemple, Endoriftia perséphone), n'a pas été observé dans Solémia, suggérant un renouvellement potentiellement rapide des composés soufrés élémentaires par un système Dsr actif. Alors que les rôles exacts des enzymes Dsr restent à confirmer dans le Solémia symbiote, nos données indiquent un rôle de premier plan pour l'oxydation du soufre en sulfite dans cette symbiose.

Conformément à cette constatation, les transcrits codant la voie APS pour l'oxydation des sulfites étaient abondants dans l'ensemble de données. Utilisation de la voie APS par Solémia symbiotes a été établi auparavant par des tests enzymatiques montrant l'activité de l'APS réductase (AprAB) et de l'ATP sulfurylase (SAT Chen et al., 1987). Ensemble, ces enzymes catalysent l'oxydation dépendante de l'AMP du sulfite en APS et la conversion subséquente générant de l'ATP de l'APS en sulfate (figure 4). Ici, les transcrits codant pour AprAB et SAT représentaient 1,5 % de toutes les lectures de bactéries codant pour les protéines. De plus, des transcrits codant pour l'ancre transmembranaire AprM ont été détectés en faible abondance. Dans d'autres taxons de bactéries, le transport d'électrons de l'APS réductase cytoplasmique vers le pool membranaire quinol/quinone est médié par des interactions avec l'un ou l'autre AprM, ce qui est plus courant dans les oxydants de soufre gammaprotéobactériens (par exemple, A. vinosum), ou le complexe redox lié à la membrane QmoABC associé fonctionnellement, commun chez les bactéries vertes sulfureuses de l'ordre des Chlorobiales (Meyer et Kuever, 2007). Ici, la détection de avrM mais non qmoABC les relevés de notes correspondent à l'emplacement des Solémia symbiote parmi les gammaprotéobactéries. Ensemble, ces données suggèrent un complexe d'oxydation sulfite fonctionnel dans cette symbiose.

La détection de transcrits correspondant aux gènes de la voie Sox a également confirmé un rôle actif de l'oxydation du thiosulfate dans S. velum symbiotes. La voie Sox (oxydation du soufre) médie l'oxydation du thiosulfate en sulfate dans une variété de bactéries oxydant le soufre à la fois non photosynthétiques et photosynthétiques (Frigaard et Dahl, 2009 Ghosh et Dam, 2009 Sakurai et al., 2010). La voie a été largement étudiée chez Alphaproteobacterium Paracoccus pantotrophus, dans laquelle 15 gènes soxRSVWXYZABCDEFGH constituent le sox opéron (Friedrich et al., 2001, 2005 Rother et al., 2001). Parmi ceux-ci, sept gènes (soxABCDXYZ) codent pour les protéines sox périplasmiques de base, SoxB, SoxXA, SoxYZ et SoxCD, SoxYZ agissant comme la molécule porteuse principale à chaque étape de la voie (Friedrich et al., 2001 Figure 4). Analyse de la S. velum Le métatranscriptome de symbiont a révélé des transcrits correspondant à deux gènes sox périphériques (soxHW) à faible abondance et cinq des sept gènes sox de base (soxABXYZ) à des abondances plus élevées (Figure 4). Les transcriptions codant pour la soufre déshydrogénase SoxCD n'ont pas été détectées dans notre analyse, ce qui est cohérent avec l'absence de ces gènes dans les génomes d'une variété de bactéries sulfureuses vertes et violettes, y compris A. vinosum et les endosymbiotes des palourdes et des vers tubicoles (Frigaard et Dahl, 2009 Harada et al., 2009). Alternativement, il est possible que soxC et soxD sont présents dans le génome du symbiote, mais n'ont pas été transcrits (au-dessus du niveau de détection) au moment de la collecte. Dans les organismes dépourvus soxCD, l'atome de soufre de l'intermédiaire sulfane (SoxYZ-S-SH, Figure 4) est transféré vers d'autres substrats accepteurs (RSmH − et − HSm − dans la figure 4) et éventuellement dans des globules de stockage de soufre, ou entre dans d'autres voies d'oxydation du soufre (Sauve et al., 2007 Frigaard et Dahl, 2009). Le dépôt de globules de soufre élémentaire n'a pas encore été démontré pour S. velum. Cependant, le potentiel de stockage des globules sous différentes concentrations de thiosulfate ou de sulfure n'a pas encore été exploré de manière exhaustive.

Implications

Nos données de métatranscriptome indiquent l'utilisation de diverses voies pour l'oxydation des sulfures et des thiosulfates par S. velum symbiotes dans des conditions environnementales, conformément aux expériences antérieures montrant que les deux substrats stimulent la fixation du carbone symbiote (Cavanaugh, 1983 Scott et Cavanaugh, 2007). L'utilisation de plusieurs voies d'oxydation du soufre n'est pas inhabituelle chez les bactéries thioautotrophes et est probablement liée à la disponibilité du substrat (Ghosh et Dam, 2009). Pour les endosymbiotes des palourdes d'eau profonde, qui partagent un complément de gènes d'oxydation du soufre similaire à celui de S. velum symbiotes (Kuwahara et al., 2007 Newton et al., 2007), il a été avancé que la capacité d'oxyder à la fois le thiosulfate (système Sox) et le sulfure (Dsr, Sqr/Fcc) est liée à l'abondance relative de ces composés dans le microhabitat de la palourde (fissures basaltiques et fissures dans les zones d'évent diffus Harada et al., 2009). En revanche, l'endosymbionte du ver tubicole Riftia pachyptila manque putativement de la voie Sox (Markert et al., 2007 Robidart et al., 2008), ce qui peut refléter une adaptation à une plus grande dépendance au sulfure dans les zones entourant les fumeurs noirs où cette symbiose se produit (Nelson et Fisher, 1995 Harada et al ., 2009).

Pour S. velum, l'abondance relative des espèces de soufre réduit disponibles pour l'oxydation des symbiotes n'a pas été directement caractérisée. Le bivalve hôte vit dans les boues côtières, se positionnant à la convergence d'un terrier en forme de Y (Levinton, 1977) où il peut accéder à l'eau anoxique du bas dans les sédiments. Cette eau est probablement enrichie en sulfure mais peut également contenir du thiosulfate, peut-être résultant de l'oxydation chimique du sulfure pendant la ventilation des terriers (Howarth et al., 1983 Elsgaard et Jorgensen, 1992). Alternativement, le thiosulfate peut également être disponible via l'oxydation du sulfure par les mitochondries de l'hôte, comme cela a été démontré dans le congénère du Pacifique. S. reidi (Obrien et Vetter, 1990). Bien que le sulfure et le thiosulfate puissent alimenter l'autotrophie des symbiotes, le sulfure a un effet beaucoup plus fort (sept fois) sur les taux de fixation du carbone dans S. velum symbiotes (Scott et Cavanaugh, 2007), suggérant que la symbiose est adaptée pour utiliser le sulfure le plus efficacement possible.

Nos données de transcriptome, montrant l'abondance relative des transcrits dans les voies Dsr et Sqr/Fcc (Figure 4), indiquent potentiellement un rôle dominant pour le métabolisme des sulfures dans le S. velum symbiose. Cependant, l'abondance des transcrits peut ne pas être étroitement liée à l'abondance des protéines ou à l'activité enzymatique (Taniguchi et al., 2010) et doit être interprétée comme un indicateur de l'activité métabolique sans étayer les données biochimiques. In other endosymbioses, namely those involving deep-sea hydrothermal vent clams, diverse sulfur pathways (Sox, Dsr, APS) have been shown to be constitutively expressed under variable environmental conditions (e.g., oxygen concentration (Harada et al., 2009). However, compared to gene expression in the relatively stable environment of the deep sea, expression of S. velum symbiont genes, and the relative reliance on diverse reduced sulfur sources, may be more stochastic given the potential for diel and seasonal variation in the coastal environment.

Metatranscriptomics can now provide a comprehensive molecular framework for interpreting physiochemical measurements of metabolism in uncultured symbionts. Such analyses can be easily integrated into studies exploring the links between sulfur availability, environmental conditions, and symbiont gene expression. Our study confirms that genes of sulfur energy metabolism are a dominant component of the transcriptionally active symbiont gene pool in S. velum. Future experiments will help determine the extent to which genes of thioautotrophy co-vary with other metabolic pathways in the transcriptome (Dmytrenko et al., in preparation) and with the biochemical transformations of sulfur mediated by this model symbiosis.


Informations sur l'auteur

These authors contributed equally: Kristopher Kieft, Zhichao Zhou.

Affiliations

Department of Bacteriology, University of Wisconsin–Madison, Madison, WI, USA

Kristopher Kieft, Zhichao Zhou & Karthik Anantharaman

Biology Department, Carleton College, Northfield, MN, USA

Department of Microbiology, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA

Department of Biological Sciences, Life Science Facility, Clemson University, Clemson, SC, USA

Department of Microbiology & Immunology, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Graduate Program in Bioinformatics, University of British Columbia, Genome Sciences Centre, Vancouver, BC, Canada

Genome Science and Technology Program, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Life Sciences Institute, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

ECOSCOPE Training Program, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Department of Animal Science, University of California Davis, Davis, CA, USA

Department of Microbiology, The Ohio State University, Columbus, OH, USA

Groupe de recherche interuniversitaire en limnologie, Department of Biology, Concordia University, Montréal, QC, Canada

DOE Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA

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Contributions

K.K., Z.Z., S.R., and K.A. conçu l'étude. K.K. and S.R. identified the genomes. K.K., Z.Z., and K.A. conducted the analyses. K.K., Z.Z., and K.A. drafted the manuscript. All authors (K.K., Z.Z., R.E.A., A.B., B.J.C., S.J.H., M.H., M.B.S., D.A.W., S.R., and K.A.) reviewed the results, revised, and approved the manuscript.

Auteur correspondant


Résultats et discussion

The architecture of the SoxAX complex

The crystal structure of the SoxAX heterodimer with four molecules in the asymmetric unit of a P21 cell was solved at 2.5 Å resolution by Fe-multiple wavelength anomalous dispersion (MAD). The structure subsequently was refined at 1.75 Å resolution using data collected from a crystal of space group P21212 with a single molecular copy in the asymmetric unit (Table I). The heterodimer seen in the crystal corresponds to the oligomeric state observed in solution by analytical ultracentrifugation studies ( Appia-Ayme et al., 2001 ). SoxAX is an elongated molecule of approximate dimensions 34 × 36 × 75 Å 3 (Figure 3A and B). The SoxA subunit is organized into two domains each binding a c-type haem with histidine–cysteine axial coordination. These are designated haems 1 and 2, labelled in the order in which the corresponding CXXCH ligand motifs appear in the SoxA sequence. Post-translational modification of the cysteine ligand to haem 2 is apparent and is discussed further below. The single domain SoxX subunit binds a c-type haem with histidine–methionine axial ligands (haem 3) and forms the interface with the C-terminal domain of SoxA. The haem ligands observed in the structure are in agreement with those inferred from previous spectroscopic characterization of oxidized protein samples ( Cheesman et al., 2001 ). The geometrical arrangement of the haem groups is presented in Table II. The use of cysteinate as a haem iron ligand is unusual, with only cytochromes P450, the CO sensor protein CooA and cystathionine β-synthase previously having been reported to have such a ligand ( Ojha et al., 2000 ). Indeed, SoxA is the first c-type cytochrome with cysteine haem iron coordination and only the second structurally characterized haemoprotein containing a haem with a cysteine–histidine ligand set, cystathionine β-synthase being the other ( Meier et al., 2001 ).

Collecte de données MAD data collection space group P21une = 81.2 Åb = 102.9 Åc = 114.4 Åβ = 110.5° Oxidized, space group P21212 une = 66.4 Å b = 87.3 Å c = 71.7Å Reduced, space group P21212 une = 65.8 Å b = 87.2 Å c = 71.5 Å
λ1 = 1.729 Å λ2 = 1.741 Å λ3 = 1.000 Å λ = 0.933 Å λ = 0.98 Å
Resolution (Å) 2.5 2.5 2.55 1.75 1.5
Completeness (%) 95.0 (92.2) 94.8 (89.6) 98.2 (88.7) 93.4 (91.4) 99.3 (98.4)
Rsymbole a a Rsymbole = ΣΣ|jei − <je>|/jei, where <je> is the average of symmetry equivalent reflections and the summation extends over all observations for all unique reflections.
(%)
4.9 (9.1) 5.1 (10.4) 3.1 (5.0) 7.0 (16.8) 4.1 (28.4)
Ranom b b Ranom = Σ|<je+> − <je−>|/Σ|<je+> + <je−>|.
(%)
4.4 (7.1) 3.5 (8.7) 1.8 (5.4)
(<je>/<σje>) >3 (%) 92.9 (82.4) 90.6 (73.9) 96.6 (89.2) 78.7 (44.2) 78.6 (48.4)
Independent reflections 61 072 61 950 58 706 42 647 66 141
Total reflections 903 590 901 411 101 074 262 534 670 264
Overall temperature factor (Å 2 ) 34.7 36.7 36.7 17.8 13.2
SOLVE mean FOM c c Average figure of merit (FOM) calculated by SOLVE ( Terwilliger and Berendzen, 1999 ).
0.74
Refinement statistics P21 P21212 oxidized P21212 reduced
Wavelength (Å) 1.000 0.933 0.98
Resolution range (Å) 20–2.55 20–1.75 25–1.5
Refined structure d d The final structural model for the P21 crystal form contained four copies of the indicated residues of SoxA and SoxX in the asymmetric unit
SoxA 1–261, SoxX 1–138, + 691 water SoxA 1–261, SoxX 1–51, 55–137, + 353 water SoxA 1–261, SoxX 1–51, 55–137, + 667 water, + 2 ethylene glycol
Rcryst e e Rcryst = Σ‖F| − |Fc‖/Σ|F|.
21.0 (29.6) 17.7 (21.3) 19.9 (23.5)
Rlibre f f For Rlibre, the summations extends over a subset (5%) of reflections excluded from all stages of refinement.
26.4 (36.8) 21.4 (23.0) 23.0 (27.4)
C–N 0.005 0.009 0.005
N–C?? 0.009 0.014 0.008
C??-C 0.012 0.016 0.009
N–C??-C 0.88 1.08 1.36
C–N–C?? 1.30 1.77 2.16
Main chain atoms 18.5 16.5 14.4
Side chain atoms 19.1 21.9 17.3
  • Figures in parentheses refer to data in the highest resolution bin.
  • une Rsymbole = ΣΣ|jei − <je>|/jei, where <je> is the average of symmetry equivalent reflections and the summation extends over all observations for all unique reflections.
  • b Ranom = Σ|<je+> − <je−>|/Σ|<je+> + <je−>|.
  • c Average figure of merit (FOM) calculated by SOLVE ( Terwilliger and Berendzen, 1999 ).
  • d The final structural model for the P21 crystal form contained four copies of the indicated residues of SoxA and SoxX in the asymmetric unit
  • e Rcryst = Σ‖F| − |Fc‖/Σ|F|.
  • f For Rlibre, the summations extends over a subset (5%) of reflections excluded from all stages of refinement.
Haems 1–2 Haems 2–3
Distance (Fe–Fe) (Å) 31.4 (31.0) 19.0 (18.8)
Distance (closest approach) (Å) 23.9 (23.4) 10.7 (10.6)
Interplanar angle (°) 56.1 (55.1) 80.95 (78.3)
Haem 1 Haem 2 Haem 3
Ligand distances (Å)
Fe–S 2.45 (2.37) 2.41 (2.35) 2.34 (2.43)
Fe–N 2.08 (2.11) 2.08 (2.08) 2.05 (2.07)
Haem solvent accessibility (Å 2 ) 179.2 (179.7) 56.7 (53.3) 80.8 (82.9)
  • The figures in parentheses refer to the average calculated over the four independent molecules of the P21 cell.

The haem 2–haem 3 interplanar angle and distance of closest approach together with the haem solvent-accessible areas are consistent with haem 3 being the route for electron transfer away from the complex (Table II). The solvent-exposed edge of haem 3, the presumed locus for cytochrome c2 binding, lies on the opposite face of SoxX from haem 2. The edge–edge separation of haems 1 and 2, in contrast to that between haems 2 and 3, is sufficiently long to preclude efficient electron transfer in the absence of a chain of cofactors ( Page et al., 1999 ). An extended groove runs across the molecule at the subunit interface. This leads to a solvent-filled channel lined with basic residues, at the bottom of which the haem 2 iron atom and modified cysteine ligand lie exposed to solvent (Figure 3C). These observations, together with the post-translational modification to haem 2, led us to identify this haem as the catalytic active site.

The folds of the SoxA and SoxX subunits

The SoxX subunit has a c-type cytochrome fold as defined in the SCOP database ( Holm and Sander, 1993 ). Yeast mitochondrial cytochrome c (PDB entry 1ycc, 108 residues) was found to be most similar, with 82 structurally aligned residues and an r.m.s.d. of 2.3 Å. The SoxX subunit can thus be classified as a member of the mono-domain cytochrome c family ( Murzin et al., 1995 ). Inspection of the SoxA subunit reveals a pronounced internal pseudo-dyad encompassing residues 51–150 and 151–250 for domains that we term SoxAN and SoxAC, respectivement. Alignment of these domains gave an overall r.m.s.d. of 1.8 Å for 93 structurally conserved residues for which the percentage residue identity was 18%. The haem groups in each domain are also well conserved, having an r.m.s.d. of 1.2 Å in this alignment (excluding propionate groups). The folds of these domains are clearly highly homologous and, as was the case for SoxX, each of these A-subunit domains has a c-type cytochrome fold. Again taking the mitochondrial cytochrome c for comparison, the r.m.s.ds are 2.7 and 3.1 Å for the SoxAN and SoxAC domains (both 69 aligned residues), respectively. The structure, in conjunction with sequence alignment, suggests that SoxA, apart from the N-terminal 50 amino acids, has evolved from duplication of a cytochrome c gène.

The di-haem SoxA subunit

Like SoxA, proteins of the two-domain cytochrome c family possess a pseudo 2-fold symmetry axis relating the two haem domains ( Murzin et al., 1995 ). However, fold homology searches failed to align the SoxA subunit with members of this family ( Chen et al., 1994 Fülöp et al., 1995 Kadziola and Larsen, 1997 ). As such, SoxA represents the first example of a new family of two-domain cytochromes c in which the packing of the two domains differs radically from the previously characterized examples (Figure 3D). The novel domain arrangement seen in SoxA may arise because a combination of the C-terminal (residues 251–261) and N-terminal polypeptides (residues 1–50) of SoxA block the face of the C-terminal domain that forms the domain interface in the other two-domain cytochrome c protéines. The result is that in SoxA the two domains pack with their C-terminal α4 helices arranged about the local pseudo 2-fold axis relating the SoxAN and SoxAC domaines. A major consequence of this unusual packing is to give a distance of closest approach of the haems in SoxA (24 Å) that is much greater than that seen in the other two-domain cytochrome c proteins (<14 Å). The result is that effective electron transfer between the SoxA haems is precluded.

It is notable that the haem 1 consensus Cys-Xaa-Xaa-Cys-His haem-binding motif is absent from the SoxA proteins of Rhodopseudomonas palustris et de Chlorobium species (Figure 2A). In place of haem 1, an intradomain disulfide bridge is found between the remaining (second) cysteine of the haem-binding motif and the conserved cysteine residue that is a ligand to that haem in R.sulfidophilum SoxA ( Klarskov et al., 1998 ). However, the α-carbon atoms of these cysteines in the SoxAN domain are >10 Å apart, a distance greater than the maximum for a disulfide bridge ( Sowdhamini et al., 1989 ). The question then naturally arises as to whether, nevertheless, the AN domain of the R.palustris et Chlorobium sp. SoxA proteins can adopt the cytochrome c fold but substitute a disulfide bridge for the c haem to form a different superfamily. An important observation in this respect is that the haem-less SoxA domains preserve the cluster of hydrophobic residues at positions A61 (6), A65 (10), A134 (94) and A137 (97) (tuna cytochrome c residue numbering in parentheses see Figure 2A) in the N- and C-terminal helices of the fold. These four residues are not involved in haem binding and are conserved in otherwise highly divergent cytochromes c. This, together with the absence of an apparent functional role for these residues, has led to the suggestion that they are involved in a common folding nucleus of all subfamilies of c-type cytochromes ( Ptitsyn, 1998 ). It therefore appears reasonable to conclude that the haem-less SoxAN domain in these proteins may adopt a modified cytochrome c fold.

The nature of the subunit interface

The SoxAX complex is purified readily from the periplasm of R.sulfidophilum, suggesting a subunit interaction that is both specific and of relatively high affinity ( Appia-Ayme et al., 2001 ). At present, the complex of yeast cytochrome avant JC1 with cytochrome c ( Lange and Hunte, 2002 ) is the sole example of a crystal structure of a productive electron transfer complex involving two cytochrome c protéines. Furthermore, there are few examples of stable, structurally characterized homo-oligomeric proteins with the cytochrome c fold. Under these circumstances, the nature of the subunit interface in the SoxAX complex is of some interest. In an attempt to determine whether the SoxAC: SoxX packing is structurally unique, the PQS server ( Henrick and Thornton, 1998 ) was used to generate an independent set of stable cytochrome c dimer packings. Adding to these the domain packings observed in the two-domain cytochromes c, a total of 11 independent cytochrome c:cytochrome c domain packings were found. Comparison reveals that the SoxAC:SoxX domain packing bears a passing resemblance to that observed between monomers of the cytochrome c6 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii although the relative orientation of the haems is significantly different. It is appropriate to note that there is some evidence that the dimerization of the latter has functional significance ( Kerfeld et al., 1995 ). Notably, there is no similarity between the packing of cytochrome c domains at the SoxAC:SoxX interface and that observed in the yeast cytochrome avant JC1:cytochrome c complex ( Lange and Hunte, 2002 ). Thus, the packings of the c-type cytochrome domains both within SoxA and at the subunit interface are essentially unique. Cytochrome c domains are limited in their packing arrangements if the haem groups are to fall within suitable minimum edge–edge distances for electron transfer without the requirement for other cofactors. This requirement is clearly illustrated in the packing of domains within the SoxA subunit.

Analysis of the high resolution structure reveals a subunit interface that is well packed. This is evidenced by the shape complementarity statistic (Sc) ( Lawrence and Colman, 1993 ), which has a value of 0.74 and is consistent with previously compiled statistics on permanent heterodimeric complexes ( Jones and Thornton, 1996 ). Despite being well packed, the interface is also apparently fairly plastic. The largest r.m.s.d. between pairs of high and low resolution structures of the complex is ∼0.6 Å (based on all α-carbon atoms), and this difference can be accounted for in the most part by a rigid body screw domain displacement of SoxX relative to SoxAC of 4° and a translation of 0.2 Å. As is often the case, the root cause of this difference in the SoxAX structures may be attributable to crystal lattice packing contacts. However, whilst the haem edge–edge distances and interplanar angles are not affected greatly by the excursions of the SoxX subunit relative to SoxA (Table II), the observed plasticity at least suggests that conformational changes may occur on binding of SoxYZ. The increased mobility of SoxX is also reflected in the average atomic temperature factor for atoms in this subunit (25.5 Å 2 ) being greater than that for the SoxA subunit (15.1 Å 2 ).

The interface of the complex is predominantly hydrophobic in nature, in keeping with that observed in other stable electron transfer complexes ( Mathews and White, 1993 ). Approximately 2500 Å 2 is buried on complex formation (6.8% of the total accessible surface area), of which apolar and aromatic residues contribute 42%. This buried area is consistent with that observed in other heterodimeric complexes ( Jones and Thornton, 1996 ). The interface is composed of two distinct, non-overlapping contact regions which we label A and B. Four short polypeptide stretches in SoxA form the majority of the interaction surface with SoxX (Figure 2A). Those contributing to region A are 183–184 and 187–191, whilst 168–175 and 224–232 contribute to region B. In SoxX, a number of short polypeptides are involved in forming the interface: residues 37–44 and 55–60 (region A), and residues 89–93 (region B) (Figure 2B). These three polypeptides contribute ∼50% of the total buried surface area of the SoxX subunit in the complex. The remainder comes from residues 101–110 (region B) which form part of a loop extending from the core domain structure to form an intimate association with residues of SoxA. Notably, this interface loop (residues 99–118) constitutes a major insertion in SoxX relative to other members of the cytochrome c superfamily. Interestingly, this loop is also missing in the SoxX proteins from Chlorobium tepidum, Aquifex aeolicus et R.palustris (Figure 2B). In addition, the overall sequence homology of the other contact peptides in SoxX relative to the corresponding regions in the loop-less proteins appears to be low (Figure 2B) and this may have important consequences in terms of the stability of their complexes. It should be noted that the absence of a permanent SoxAX complex in these organisms may imply generation of a means of stabilizing one-electron-oxidized intermediates.

A single midpoint potential using NADH as reductant has been observed for R.sulfidophilum SoxAX with a value of +180 mV that has been assigned to two redox-linked haems ( Little, 2000 ). The packing of SoxAC to SoxX at the subunit interface provides a haem–haem distance of closest approach of 10.7 Å. This distance is marginally shorter than that seen in the di-haem cytochrome c peroxidase (14.5 Å) and the cytochrome c4 protein (11.2 Å) and involves transversing a region of the interface predicted to be solvent accessible. However, electron transfer should be rapid and essentially independent of the environment between the haems for a separation of 14 Å or less ( Page et al., 1999 ). We therefore assume that haems 2 and 3 constitute the redox-linked pair. The haem groups arranged closest by the SoxAC:SoxX packing are the C-pyrrole rings. Several lines of evidence have implicated the exposed edge of the haem pyrrole ring C in electron transfer in c-type cytochromes ( Pelletier and Kraut, 1992 ).

Post-translational modification to catalytic haem ligand

Fourier maps calculated using a fully refined structural model based on the predicted amino acid sequence of SoxA reveal regions of unexplained difference electron density adjacent to the cysteine axial haem ligand to haem 2 in the vicinity of its terminal sulfur atom. Le |FoFc| difference electron density peaks are at >5.2σ and 11.5σ from the mean electron density calculated over the volume of the molecule (where σ is the standard deviation of the distribution), indicating the presence of at least one additional atom (Figure 4A). The refined cysteine sulfur to ferric haem iron distance is 2.57 Å in this model. Given the likely geometry of the modified amino acid as indicated by the electron density, cysteine persulfide and cysteine sulfenic acid are the most probable derivatives. There is precedent for both modifications in other protein crystal structures ( Claiborne et al., 1999 Bordo et al., 2000 ). We attempted to refine both possibilities against our X-ray data with the result that both the cysteine persulfide sulfane sulfur to haem iron distance and the alternative cysteine sulfenic acid terminal oxygen to haem iron distance refined to 2.41 Å. However, whilst the cysteine persulfide form showed only minor residual difference electron density after the modification, the cysteine sulfenic acid residue showed a +7.0σ difference electron density peak in the vicinity of the sulfenic oxygen atom. This strongly suggests that cysteine persulfide is the post-translational modification observed for CysA222. Unfortunately, anomalous difference Fourier maps calculated using the iron K-edge wavelength data set (λ1 in Table I), which could positively identify a terminal sulfane sulfur atom on this residue, were inconclusive due to the proximity of the additional atom to the iron centre. So, in the absence of an unambiguous sulfur anomalous scattering signal, further supportive evidence was sought for this interpretation.