Informations

L'administration de nucléoside-triphosphate à l'ARN ou à l'ADN polymérase est-elle active ou passive ?

L'administration de nucléoside-triphosphate à l'ARN ou à l'ADN polymérase est-elle active ou passive ?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Les nucléosides triphosphates (NTP) sont-ils activement délivrés à l'ARN polymérase (de la même manière que les dNTP à l'ADN polymérase) par le biais d'un processus chaperonné actif, ou sont-ils si abondants dans le noyau qu'ils reposent simplement sur la diffusion stochastique ?

Existe-t-il des documents pertinents sur ce processus?


La quantité de dNTP est si importante et sensible que le niveau de dNTP doit être optimal et non inférieur ou supérieur. Des quantités plus faibles conduisent à une insuffisance et des quantités plus élevées conduisent à des taux de mutation accrus. De plus, cette quantité optimale de dNTP devrait durer quelques minutes pour fournir les dNTP nécessaires à la réplication. La livraison de dNTP est due à la signalisation moléculaire et à la diffusion stochastique.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2847218/

« Les cellules eucaryotes contiennent un équilibre délicat de quantités infimes des quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP), suffisants seulement pour quelques minutes de réplication de l'ADN. Une carence et un excès d'un seul dNTP peuvent entraîner une augmentation des taux de mutation. »


http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2010.01719.x/pdf

"L'optimisation des concentrations intracellulaires de dNTP est essentielle pour la fidélité de la synthèse de l'ADN pendant la réplication et la réparation de l'ADN, car des niveaux trop élevés ou trop faibles peuvent facilement entraîner une augmentation des taux de mutagenèse"


http://www.nature.com/ncb/journal/v14/n7/full/ncb2540.html

« La production de désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) est essentielle à la synthèse de l'ADN pendant la réplication et la réparation, et des niveaux anormaux ou déséquilibrés de dNTP augmentent la fréquence des mutations. Pagano et ses collègues démontrent maintenant que la SCF-cycline F ubiquitine ligase contrôle la production de dNTP pendant le cycle cellulaire et après stress génotoxique"


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22234185

« les altérations des pools de dNTP sont associées à une mutagenèse, une instabilité génomique et une tumorigenèse accrues »



De nombreux processus dans la cellule, également des processus impliquant des composés qui ont une abondance inférieure à celle des NTP, reposent sur la diffusion stochastique. Même la polymérase n'est pas activement transportée vers l'acide nucléique, elle diffuse juste jusqu'à ce qu'elle trouve un lieu de liaison approprié.

De plus, l'énergétique du transport actif n'aurait pas de sens. L'un des NTP est l'ATP, l'un des principaux vecteurs d'énergie de la cellule. Cela aurait peu de sens pour la cellule de transporter activement l'ATP vers la polymérase sur l'acide nucléique, car le transport actif a besoin d'énergie, donc probablement de l'ATP ou quelque chose de similaire lui-même. Cela devrait ensuite se diffuser au transporteur pour le maintenir en mouvement. Il serait moins cher pour la cellule d'utiliser directement cet ATP, car vous comptez sur la diffusion dans les deux cas.

Cela ne tient même pas compte du fait qu'une protéine ne peut pas se déplacer activement à travers la cellule, même en dépensant de l'énergie. Les systèmes qui font quelque chose comme ça sont beaucoup plus complexes, comme la myosine (se déplaçant le long des filaments d'actine).


Étendre la diversité structurelle et fonctionnelle de l'ARN : les analogues d'uridine triphosphates comme candidats pour in vitro sélection d'acides nucléiques

Deux analogues d'uridine triphosphates attachant une fonctionnalité supplémentaire, l'un un groupe amino primaire et le second un groupe mercapto, ont été préparés et testés pour leur compatibilité avec in vitro Procédures de sélection d'ARN. 5-(3-aminopropyl)uridine triphosphate (UNH2) comme substitut de l'uridine était un substrat plus efficace pour l'ARN polymérase T7 que le 5-(2-mercaptoéthyl)uridine triphosphate (USH). Cependant, les deux ont fonctionné dans des tests de transcription de matrices de 100 nt pour générer des transcrits d'ARN en quantités suffisantes pour initier des procédures de sélection d'ARN. Transcription de pools d'ARN avec l'ARN polymérase T7 et UNH2 ou USH se sont produits avec des efficacités de 43 et 29%, respectivement, des valeurs obtenues pour la transcription UTP native. De plus, l'ARN transcrit contenant environ 25 & x 00025 UNH2 les résidus présentaient de meilleures propriétés de substrat pour la transcriptase inverse SuperScript™ II RNase H que les transcrits d'ARN contenant

25% de l'analogique USH. Avec l'un ou l'autre des analogues, à la fois la transcription et la transcription inverse se sont déroulées avec une grande fidélité pour l'insertion du résidu d'analogue.


Réplication de l'ADN avec une polymérase de relecture

Les polymérases de relecture ont plusieurs points de contrôle pour empêcher l'incorporation incorrecte de nucléotides pendant le processus d'extension d'ADN.

Le premier point de contrôle est le résultat de la préférence de liaison significative de l'enzyme pour le bon ou le mauvais nucléoside triphosphate pendant la polymérisation. Si une base incorrecte se lie au site actif, l'incorporation est ralentie, ce qui augmente les chances de dissociation du nucléotide incorrect et de liaison d'un nucléotide correct.

Alternativement, si un nucléotide incorrect est incorporé, la polymérase de relecture détecte la perturbation causée par les bases mal appariées et déplace l'extrémité trois premiers du brin en croissance vers le domaine du site actif de l'exonucléase de relecture de la polymérase, où l'activité exonucléase trois premiers à cinq premiers supprime le base mal appariée. Une fois la base mal appariée retirée, la polymérase déplace le brin de nouveau dans le domaine de la polymérase et continue d'ajouter des bases et d'étendre l'ADN.

La fidélité est essentielle pour de nombreuses applications, y compris le clonage et le séquençage de nouvelle génération, et NEB a développé un large portefeuille de polymérases haute fidélité à utiliser en PCR.


LA DISCIPLINE DE LA GÉNÉTIQUE

La génétique a été identifiée comme une matière que les étudiants ont du mal à appréhender [6]. En particulier, les étudiants sont aux prises avec de nombreux aspects des composantes mathématiques de la génétique et ne possèdent pas les compétences logiques requises pour résoudre efficacement les problèmes [ 7 ]. Des recherches antérieures ont suggéré que les difficultés rencontrées par les étudiants avec la génétique peuvent être causées par un certain nombre de facteurs. Ceux-ci incluent un manque de compétence en mathématiques, en statistiques et en principes d'introduction à la génétique [ 7 ]. De plus, les étudiants semblent incapables de synthétiser de nouvelles connaissances avec leurs connaissances antérieures pour construire des cadres conceptuels significatifs [ 8 ]. De plus, il a été postulé par Longden [ 6 ] que les perceptions et les attitudes des étudiants envers les cours de génétique peuvent avoir un impact négatif sur l'expérience d'apprentissage. Tous ces facteurs peuvent être exacerbés par une mauvaise conception des programmes [ 9 ].

En termes de taxonomie du domaine cognitif que Bloom et ses collègues [ 10 ] ont produite, les étudiants de première année sont généralement capables de répondre aux questions d'évaluation au niveau des connaissances, le plus bas niveau de la hiérarchie de la taxonomie. Cependant, ces étudiants sont généralement incapables de répondre aux questions relatives aux niveaux supérieurs de la taxonomie. Comme les étudiants en génétique sont censés maîtriser les compétences pour répondre aux questions du plus haut niveau de la taxonomie de Bloom [ 10 ], il leur est nécessaire de commencer par l'acquisition de ces compétences dès leur entrée dans la discipline de la génétique.

Le nombre d'étudiants dans les travaux dirigés en biologie étant faible, cela permet des idées d'enseignement et d'apprentissage innovantes. Nous présentons ici un tutoriel pour la réplication et la transcription de l'ADN qui facilite l'apprentissage des élèves et stimule la pensée critique.


Résumé

Les thérapies à base d'acides nucléiques qui régulent l'expression des gènes ont été développées vers une utilisation clinique à un rythme soutenu depuis plusieurs décennies, mais ces dernières années, le domaine s'est accéléré. À ce jour, il existe 11 produits commercialisés à base d'oligonucléotides antisens, d'aptamères et de petits ARN interférents, et de nombreux autres sont en préparation pour le monde universitaire et l'industrie. Un déclencheur technologique majeur pour ce développement a été les progrès de la chimie des oligonucléotides pour améliorer les propriétés des médicaments et réduire le coût des marchandises, mais le principal obstacle à l'application à un plus large éventail de troubles est l'administration aux tissus cibles. L'adoption de technologies d'administration, telles que les conjugués ou les nanoparticules, a changé la donne pour de nombreuses indications thérapeutiques, mais beaucoup d'autres attendent toujours leur moment eurêka. Ici, nous couvrons la variété des méthodes développées pour fournir des thérapies à base d'acides nucléiques à travers les barrières biologiques et les systèmes modèles utilisés pour les tester. Nous discutons des considérations de sécurité importantes et des exigences réglementaires pour les chimies d'oligonucléotides synthétiques et les obstacles pour traduire les percées de laboratoire à la clinique. Les progrès récents dans la fourniture de thérapies à base d'acides nucléiques et dans le développement de systèmes modèles, ainsi que les considérations de sécurité et les exigences réglementaires pour les chimies d'oligonucléotides synthétiques sont discutés dans cette revue sur les thérapies à base d'oligonucléotides.

Glossaire

Introduction

Les oligonucléotides synthétiques (ON) sont de petits morceaux simple ou double brin d'acides nucléiques modifiés qui ont été exploités comme modalités thérapeutiques de différentes manières (tableau 1). La caractéristique unique des ON est qu'elles se lient à leur cible via un appariement de bases Watson-Crick, permettant une intervention au niveau génétique en ciblant l'ARN d'une manière spécifique (Zamecnik & Stephenson, 1978). Les ON englobent de nombreux types de thérapies à base d'acides nucléiques, y compris les oligonucléotides antisens (ASO), les petits ARN interférents (siARN), les anti-miARN (antagomirs), les miARN (agomirs), les aptamères et les ON contenant des CpG non méthylés. Selon leur mécanisme d'action, le traitement avec des acides nucléiques thérapeutiques peut entraîner une diminution, une augmentation ou une restauration de l'expression des protéines. Actuellement, 11 médicaments à base d'ON dans de nombreux domaines pathologiques ont reçu l'approbation réglementaire de la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, de l'Agence européenne des médicaments (EMA) et/ou du ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être. Cependant, le développement thérapeutique ultérieur est remis en cause par des propriétés défavorables d'absorption, de distribution, de métabolisme, d'excrétion et de toxicité (ADMET) pour la plupart des applications cliniques (Godfrey et al, 2017). Cette revue se concentre principalement sur le développement d'ON simple brin et couvre (i) les nombreuses méthodes développées à ce jour pour délivrer des ON à travers les barrières biologiques, (ii) les systèmes modèles utilisés pour tester les ON et (iii) les obstacles existants pour la traduction en laboratoire percées à la clinique. Le contenu représente les efforts conjoints des membres du réseau européen de coopération scientifique et technologique (COST) Livraison de RNA Therapeutics (DARTER, COST Action 17103, www.antisenserna.eu), qui vise à permettre aux médicaments à base d'acides nucléiques ciblant l'ARN d'atteindre leur plein potentiel.

Modalité Mécanisme Exemples)
RNase H Clivage médié par la RNase H du transcrit cible Gappers
Blocage stérique Interférence avec les éléments de liaison à l'ARN post-transcriptionnels, par exemple. modulation de l'épissage et blocage des miARN endogènes ASO et antagomirs de 2e et 3e génération
Liaison protéique Lier les protéines cibles d'une manière spécifique à la structure Aptamer
L'immunité innée Inhibe l'expression des protéines via la dégradation de l'ARNm spécifique à la cible ONs non méthylés contenant du CpG
ARNi Inhibition de l'expression des gènes via la dégradation de l'ARNm spécifique à la cible siARN, microARN

La chimie dicte les propriétés médicamenteuses des oligonucléotides

Les acides nucléiques thérapeutiques sont modifiés chimiquement de plusieurs manières pour leur conférer des propriétés telles qu'une résistance accrue aux nucléases et une meilleure affinité de liaison à la cible (Jarver et al, 2014) (figure 1). Chaque modification confère à l'ON des propriétés différentes, et certaines peuvent être combinées, mais d'autres modifications ne sont pas compatibles ou peuvent modifier l'ON d'une manière qui complique leur synthèse ou interfère avec les mécanismes par lesquels elles exercent leur effet. Les chimies de première génération comprennent les modifications du squelette phosphate largement utilisées, par exemple. phosphorothioate (PS), qui confère une résistance aux endonucléases et améliore la biodisponibilité en réduisant la clairance rénale en raison d'une affinité accrue pour les protéines sériques (Eckstein, 2014). Cependant, cette modification réduit également l'affinité pour l'ARN cible. Les chimies de deuxième génération incluent des modifications du ribose au niveau 2′-O position de l'ARN et position 2′ de l'ADN, dont le 2ʹ-O-méthyle (2ʹ-OMoi), 2ʹ-OLes modifications -méthoxy-éthyle (2'-MOE) et 2'-fluoro (2'-F) sont les types les plus couramment utilisés. Ces modifications augmentent l'affinité de liaison à l'ARN et améliorent encore la résistance aux nucléases. Une chimie d'affinité de liaison encore plus grande est constituée par les analogues d'ADN contraints par la conformation, l'acide nucléique verrouillé (LNA) et le tricyclo-ADN (tcDNA). LNA contient un pont méthyle entre le 2′-O et 4′ position de l'anneau ribose (Koshkin et al, 1998 Obika et al, 1998). Le squelette a considérablement changé pour l'ADNtc via l'introduction d'un pont éthylène avec un cycle cyclopropane entre les positions du carbone 3' et 5' du ribose (Renneberg & Leumann, 2002). Le pont impose une conformation verrouillée sur l'anneau ribose, ce qui est idéal pour se lier à l'ARN. Toutes les chimies de première et de deuxième génération sont compatibles avec la synthèse d'acide nucléique et peuvent facilement être mélangées avec de l'ADN et de l'ARN dans les chimères ON. Les chimies de troisième génération incluent des changements dans la nucléobase, par exemple. oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO) (Summerton & Weller, 1997 ) et acide nucléique peptidique (PNA) (Nielsen et al, 1991 Hanvey et al, 1992). Pour les PMO, le squelette d'acide nucléique a été remplacé par un cycle morpholino à 6 chaînons et des liaisons phosphorodiamidate, tout en conservant les bases nucléiques standard. Les nucléobases des PNA sont liées par des liaisons amides, qui sont synthétisées de la même manière que les peptides. Le PMO et le PNA sont tous deux non chargés, très résistants aux nucléases et présentent une affinité variable pour l'ARN cible (Smulevitch et al, 1996 Summerton et Weller, 1997). Le choix des modifications chimiques est largement dicté par la modalité et le tissu cible.

Figure 1. Chimies des oligonucléotides

Chimies d'acides nucléiques couramment utilisées. Le squelette phosphorothioate (PS) souvent utilisé remplace le phosphodiester naturel (PO). Modifications du ribose au 2ʹ-O la position de l'ARN et la position 2ʹ de l'ADN comprennent la position 2ʹ-O-méthyle (2ʹ-OMoi), 2ʹ-O-méthoxy-éthyle (2'-MOE) et 2'-fluoro (2'-F) sont les plus couramment utilisés. Les analogues d'ADN contraints par la conformation, l'acide nucléique verrouillé (LNA), le 2′-O-éthyle (cEt) et le tricyclo-ADN (tcDNA) contraints, offrent une plus grande affinité de liaison. LNA et cEt sont contraints par un méthyle ponté à partir des positions 2'-0 et 4' du ribose. L'ADNtc introduit un pont éthylène avec un cycle cyclopropane entre les positions carbonées 3' et 5' du ribose. Les chimies alternatives incluent des changements dans la nucléobase, par exemple. oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO) et acide nucléique peptidique (PNA).

Les ASO simple brin complémentaires à l'ARN cible ont d'abord été utilisés à des fins thérapeutiques en exploitant le clivage par la RNase H d'hybrides ADN/ARN (Stein & Hausen, 1969 Wu et al, 2004 ) (figure 2). Les ASO inductibles par la RNase H sont conçus comme des gapmers, où les nucléotides d'ADN centraux sont flanqués de nucléotides modifiés résistants à la RNase H (Wahlestedt et al, 2000). Les séquences modifiées améliorent l'affinité de la cible tandis que la séquence d'ADN centrale forme l'hybride ADN/ARN pour la reconnaissance et le clivage de la RNase H (Monia et al, 1993). Les chimies ASO de deuxième et troisième générations entièrement modifiées agissent par des mécanismes indépendants de la RNase H (Fig 2) (Jarver et al, 2014). Les ASO bloquants stériques peuvent inhiber ou activer la traduction par la liaison aux éléments régulateurs, e.g. cadres de lecture ouverts en amont (Liang et al, 2016b Liang et al, 2017). Une modalité thérapeutique courante est la modulation de l'épissage pré-ARNm (Arechavala-Gomeza et al, 2014), qui est utilisé pour induire ou supprimer l'inclusion d'exons. Chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), le saut d'exon induit par l'ASO du pré-ARNm de la dystrophine mutée restaure le cadre de lecture et permet la production de la protéine dystrophine partiellement fonctionnelle plutôt que non fonctionnelle (Mitrpant et al, 2009). En revanche, pour les patients atteints d'amyotrophie spinale (SMA), les ASO augmentent le niveau d'inclusion de l'exon 7 dans le motoneurone de survie 2 (SMN2) ARNm, conduisant à des niveaux accrus de protéine SMN (Singh et al, 2006). De même, les ASO peuvent également induire le saut de pseudoexons (Collin et al, 2012 ) ou empêcher les facteurs d'épissage de l'ARN de reconnaître les sites d'épissage cryptiques (Rivera-Barahona et al, 2015). Les ASO peuvent également bloquer stériquement l'union des facteurs de liaison à l'ARN pour répéter les régions d'expansion des ARNm pathogènes (Fig 2). Dans la dystrophie myotonique 1, les répétitions microsatellites expansées séquestrent les facteurs de liaison à l'ARN au sein des foyers d'ARN d'expansion nucléaire (Miller et al, 2000). Les ASO ciblant l'ARNm d'expansion répétée CUG libèrent les facteurs de liaison à l'ARN séquestrés et inversent le phénotype (Klein et al, 2019). Thérapies basées sur l'interférence ARN (ARNi), c'est à dire. siARN double brin et microARN simple brin (miARN), exploitent la voie ARNi endogène dans le cytosol (Fire et al, 1998) pour faire taire ou moduler l'expression de protéines spécifiques (Fig 2). Les modifications chimiques couramment utilisées pour les siRNA, y compris les modifications 2ʹ-OMe et 2ʹ-F, diminuent la reconnaissance de la RNase et sont bien tolérées dans tout le duplex siRNA (Watts et al, 2008). De plus, ces modifications sont largement utilisées pour diminuer la stimulation immunitaire (juge et al, 2006). Les ASO peuvent influencer la fonction des miARN, soit en séquestrant un miARN (antagomir) soit en générant un miARN (agomir). Notamment, un seul miARN régule généralement l'expression de plusieurs gènes dans une voie donnée, par conséquent, les antagomirs et les agomirs ont le potentiel de médier respectivement l'augmentation ou la diminution de l'expression de plusieurs gènes (Friedman et al, 2009). Enfin, deux types d'ON qui ne fonctionnent pas via l'appariement de bases Watson-Crick sont les aptamères et les ON contenant du CpG non méthylé. Les aptamères sont des ON monocaténaires (20 à 100 nucléotides) sélectionnés dans des bibliothèques randomisées en fonction de leur forte avidité de liaison à des cibles spécifiques (Ellington & Szostak, 1990 Tuerk & Gold, 1990). Ils adoptent des structures tridimensionnelles qui se lient aux sites cibles des protéines par le biais d'interactions électrostatiques attractives et de structures en forme de poche (Ellington & Szostak, 1990), et ils présentent des affinités de liaison à leurs cibles de récepteur qui sont comparables à celles des anticorps monoclonaux (Jayasena, 1999 ).Les ON non méthylées contenant des CpG comprennent un motif cytosine-guanine couplé à un squelette phosphodiester (PO) ou PS. Les motifs CpG non méthylés sont couramment trouvés dans l'ADN bactérien et activent le système immunitaire via le récepteur de type Toll 9 (TLR9). Les ON non méthylées contenant des CpG ont été testées cliniquement comme adjuvants de vaccins et pour l'immunothérapie anticancéreuse (Krieg & Davis, 2001 Krieg, 2006 , 2007 ).

Figure 2. Mécanismes et lieu d'action des oligonucléotides

Mécanismes d'action représentatifs et localisation intracellulaire pour (1) la dégradation du gapmer et de l'ARNm, (2) l'aptamère, (3) le blocage stérique nucléaire pour la commutation d'épissage, (4) le blocage de l'assemblage des facteurs de liaison à l'ARN, (5) l'activation du TLR immunité, (6) miARN et antagomir, bloc stérique, régulation positive de la traduction, (7) agomir, inhibition de la traduction et (8) siARN, RISC, ARNi silencieux ONs.

Systèmes d'administration d'oligonucléotides

Les sites d'action des ON se trouvent dans l'espace intracellulaire. Par conséquent, ils doivent surmonter plusieurs barrières biologiques pour atteindre leurs cibles pharmacologiques. in vivo. Les ON modifiées par PS se lient de manière réversible aux protéines plasmatiques, par exemple. l'albumine, ce qui augmente leur demi-vie plasmatique et facilite leur distribution et leur accumulation dans le foie, les reins, la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse (Geary, 2009). Le ciblage des tissus au-delà de ces organes a connu un succès clinique pour l'administration locale à l'œil, au cerveau et à la moelle épinière via l'administration intravitréenne (IVT) et intrathécale (IT), respectivement (Hache et al, 2016 Cidécien et al, 2019 ) (figure 3). Les deux voies contournent la clairance rénale et maintiennent une exposition élevée à l'ON au microenvironnement cellulaire pour une absorption efficace. De plus, des avancées significatives pour l'administration pulmonaire de thérapies à l'ARN ont été largement examinées ailleurs (Chow et al, 2020 Shaffer, 2020). Cependant, l'administration systémique d'ON a eu moins de succès en raison d'une mauvaise absorption tissulaire. L'absorption cellulaire des ON se produit principalement via différents types d'endocytose. Les ON sont ensuite trafiqués dans le système endolysosomal, d'où ils doivent s'échapper pour éviter la dégradation dans l'environnement lysosomal (Crooke et al, 2017). Seule une très faible fraction de dose d'ON s'échappe des endosomes et devient disponible au site d'action (Gilleron et al, 2013). Les ON simple brin, tels que les PS ASO, qui sont relativement petits, non chargés et/ou hydrophobes, peuvent pénétrer de manière productive dans les cellules et échapper aux endosomes dans le cytoplasme et le noyau sans avoir besoin d'un agent de délivrance (Liang et al, 2016a ) dans un processus appelé gymnosis (Stein et al, 2010 ), mais des doses d'ON relativement élevées sont nécessaires pour que ce processus ait lieu. Cependant, la plupart des thérapies à base d'ARN, par exemple. les siARN double brin sont trop gros et chargés pour pénétrer dans les cellules sans assistance et nécessitent un agent de délivrance. L'accélération du taux d'absorption cellulaire, du trafic intracellulaire et de l'échappement endosomal a été une force motrice derrière les progrès de nombreuses modifications chimiques et agents d'administration (Juliano et al, Biscans 2018 et al, 2020). Une grande variété d'approches de livraison améliorent le transport et la biodisponibilité des ON (Fig 4) (Roberts et al, 2020). Celles-ci incluent (i) la conjugaison directe aux porteurs et (ii) l'incorporation dans des porteurs nanoparticulaires, toutes deux dans le but d'améliorer les propriétés ADMET.

Figure 3. Livraison d'oligonucléotides au cerveau et à l'œil

(A) Les ON sont empêchés de diffusion passive dans le système nerveux central (SNC) par la BHE vasculaire. (B) Les ON sans réactif d'administration nécessitent une administration directe dans le cerveau ou la moelle épinière. La voie d'administration du SNC la plus fréquemment utilisée chez l'homme est l'administration intrathécale (IT), où les ON sont administrées dans l'espace sous-arachnoïdien de la moelle épinière pour passer la pie-mère et pénétrer dans le parenchyme. Il en résulte une concentration élevée immédiate d'ON dans le liquide céphalo-rachidien, ce qui signifie qu'une dose plus faible peut être utilisée, ce qui réduit les effets secondaires. De plus, la BHE empêche le transport des ON dans la circulation périphérique, ce qui entraîne des concentrations élevées de ON de longue durée. (C) L'œil est un organe du SNC contenu et privilégié sur le plan immunitaire qui permet l'administration locale. Les ON sont efficaces et bien tolérées lorsqu'elles sont administrées directement par injection intravitréenne. L'accouchement sous-rétinien est également possible, mais la zone traitée sera réduite. (D) Certaines macromolécules peuvent traverser les barrières vasculaires via une endocytose médiée par des récepteurs après administration systémique (Pardridge, 2007). La voie de transport de la transferrine a été exploitée dans plusieurs études chez les rongeurs pour transporter les ON dans le parenchyme cérébral (Lee et al, 2002 Kozlu et al, 2014). Il a été démontré que les ONs délivrés de manière systémique conjugués de manière covalente à des CPP riches en arginine traversent la BHE chez la souris (Du et al, 2011 ) et ont été utilisés pour l'administration ON dans des modèles murins de SMA (Hammond et al, 2016). Plusieurs études ont montré la livraison à médiation exosomale de petits ARN à travers les barrières vasculaires dans le SNC (Alvarez-Erviti et al, 2011 Yang et al, 2017). (E) Les médicaments administrés par voie intranasale peuvent être transportés dans le cerveau le long du flux migratoire olfactif, trijumeau et rostral (Curtis et al, 2007 ).

Figure 4. Technologies de livraison pour les oligonucléotides

Technologies de livraison utilisées pour améliorer les propriétés ADMET des ON, y compris les conjugués chimiques (à gauche) et les transporteurs nanoparticulaires (à droite). Les polymères, les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) et les lipides représentent des exemples de molécules utilisées pour la conjugaison covalente aux ON pour le ciblage passif, tandis que la conjugaison covalente des ON aux anticorps, aux ligands récepteurs et aux aptamères est appliquée pour le ciblage actif. Les conjugués médicamenteux présentent une stœchiométrie définie. La conjugaison CPP n'est compatible qu'avec les ON non chargés, par exemple. Les PMO et les PNA, tandis que les lipides et le GalNAc sont compatibles avec tous les types d'ON. Les supports nanoparticulaires peuvent être utilisés pour encapsuler des ON chargés négativement et peuvent être basés sur des lipides, par exemple. nanoparticules lipidiques (LNP) et exosomes, polymères, par exemple. dendrimères, poly(lactide-co-acide glycolique) (PLGA) et polyphosphazènes, et peptides, ou sur des systèmes hybrides composés de plusieurs types de composés différents. La complexité de ces systèmes pose de nouveaux défis dans le développement en ce qui concerne le coût, la fabricabilité, la sécurité, l'assurance qualité et le contrôle qualité.

Conjugués chimiques

La conjugaison chimique de molécules à des ON thérapeutiques est une stratégie intéressante pour améliorer les propriétés d'ADMET. En tant que conjugués chimiques, les ON sont exposés au sérum et, par conséquent, une modification chimique complète des ON est nécessaire pour les protéger de la dégradation. Les polymères, les peptides, les lipides, les ligands des récepteurs et les aptamères représentent des exemples de molécules utilisées pour la conjugaison (Fig 4).

Polymères

La conjugaison covalente du polyéthylène glycol (PEG) améliore les propriétés ADMET des médicaments. La PEGylation a été appliquée principalement pour les protéines thérapeutiques, mais plus récemment aussi pour les ONs, par exemple. le conjugué aptamère-PEG commercialisé pegaptanib dirigé contre le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) (Ng et al, 2006). Le PEG est un polymère hautement flexible, non chargé et hydrophile avec des groupes terminaux disponibles pour la fonctionnalisation. Le PEG protège la cargaison de médicament conjugué via la formation d'une enveloppe d'hydratation, qui empêche stériquement d'autres biomacromolécules de se lier au médicament. De plus, la PEGylation prolonge le temps de circulation en réduisant l'excrétion rénale et en augmentant la stabilité ON. Les propriétés ADMET des ON PEGylées dépendent des propriétés physico-chimiques de la fraction PEG, y compris le poids moléculaire, le type de modification du groupe terminal et l'architecture du PEG (linéaire ou ramifié). Par exemple, le pegaptanib contient un PEG en forme de Y de 40 kDa, ce qui entraîne une diminution de quatre fois l'affinité de liaison de l'aptamère par rapport à l'aptamère parent, tandis que l'efficacité antiangiogénique est augmentée, ce qui est attribué à un temps de résidence tissulaire prolongé en raison d'une demi-vie accrue ( Ng et al, 2006 ).

Peptides

Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont de courts peptides cationiques et/ou amphipathiques, généralement moins de 30 acides aminés, capables de déplacer différents types de cargaisons à travers les barrières biologiques et les membranes cellulaires (Foged & Nielsen, 2008 Pooga & Langel, 2015 Lehto et al, 2016). Les CPP peuvent être utilisés comme conjugués directs ou pour encapsuler des oligonucléotides dans des nanoparticules, ce qui est discuté plus en détail dans la section suivante. Une fois à l'intérieur des cellules, les CPP peuvent également améliorer l'échappement endosomal (Cleal et al, 2013). Cependant, la charge cationique restreint souvent leur conjugaison covalente aux chimies ON neutres en charge (PNA et PMO) en raison des interactions électrostatiques entre les ON anioniques et les CPP cationiques qui entraînent une agrégation. Pour les maladies systémiques, les CPP-ON contournent les récepteurs spécifiques des cellules, permettant une activité pharmacologique dans plusieurs tissus, et ils ont été développés pour être absorbés dans des tissus particulièrement imperméables, par exemple. muscle squelettique, cœur et SNC (Hammond et al, Paris 2016 et al, 2019 ), ainsi que le ciblage des infections virales et bactériennes (Burrer et al, 2007 Geller et al, 2013 Geller et al, 2018). Au moment de cette revue, un essai clinique de phase I pour l'innocuité et la tolérabilité d'un conjugué CPP-ASO riche en arginine pour la DMD (SRP-5051) est terminé et une phase II est en cours de recrutement pour déterminer la dose optimale.

Lipides

La conjugaison de composés hydrophobes tels que le cholestérol aux ON peut améliorer l'administration in vitro en favorisant la libération endosomale (Wang et al, 2019 ) et entraîne une demi-vie plasmatique plus longue et une accumulation dans le foie lors de l'administration systémique (Osborn et al, 2019). De telles modifications peuvent améliorer l'administration, principalement au foie, mais aussi aux tissus périphériques tels que les muscles (Prakash et al, 2019 ), via un ciblage passif en augmentant l'affinité de liaison des ON aux protéines plasmatiques et/ou via un ciblage actif en détournant les voies de transport des lipides endogènes (Osborn et al, 2019 ).

Ligands récepteurs

Le ciblage actif tissu-spécifique peut être réalisé par la conjugaison d'ON à des ligands de récepteur qui facilitent la liaison spécifique aux récepteurs sur les cellules cibles et assurent la médiation de l'administration tissu-spécifique. Une grande variété de ligands récepteurs a été étudiée, y compris les glucides, les peptides/protéines, les aptamères, les anticorps/fragments d'anticorps et les petites molécules), et plusieurs systèmes récepteur-ligand réalisables ont été identifiés.

Le ligand de ciblage tissulaire le plus efficace est peut-être la N-acétyl galactosamine trimérique (GalNAc) (Lee et al, 1984). GalNAc se lie au récepteur des asialoglycoprotéines (AGPR), qui est abondamment exprimé dans le foie (Schwartz et al, 1980). Ce ligand de liaison à haute affinité a été directement conjugué aux ON et aux siARN et fournit une administration hautement spécifique et efficace aux hépatocytes (Matsuda et al, 2015 Janas et al, Debacker 2018 et al, 2020). Un autre exemple frappant est le système de récepteur (GLPR1) du glucagon-like peptide-1 (GLP1) pour le ciblage spécifique des cellules β pancréatiques (Muller et al, 2019). Des études récentes ont montré que les conjugués GLP1-ON sont spécifiquement absorbés par les cellules exprimant GLPR1 dans le pancréas, y compris les îlots pancréatiques isolés, et induisent une forte accumulation et activité dans les cellules pancréatiques β d'une manière dépendante du ligand lors de l'administration systémique chez la souris (Ammala et al, 2018 ).

Anticorps

Un développement récent prometteur dans les conjugués chimiques est celui des conjugués anticorps-ARN (ARC). Les ARC comprennent généralement des anticorps monoclonaux, ou des fragments d'anticorps, avec des ON fonctionnels, et ils ont été utilisés pour l'imagerie et la détection de protéines. Cependant, les anticorps peuvent également être utilisés comme agent d'administration pour les ON thérapeutiques. Un fragment d'anticorps spécifique du récepteur de la transferrine, qui est impliqué dans le transport intracellulaire de la transferrine chargée de fer, a été utilisé pour cibler les siRNA vers les tissus musculaires squelettiques et cardiaques (Sugo et al, 2016). Les entreprises font progresser cette technologie pour des maladies telles que la dystrophie myotonique et la maladie musculaire de Duchenne.

Aptamères

Il a été démontré que les aptamères médient l'administration d'ON thérapeutiques sous forme de conjugués aptamère-ON ou dans des formulations de nanoparticules (Catuogno et al, 2016 Soldevilla et al, 2018). Les premières chimères aptamère-siARN ciblaient les cellules cancéreuses exprimant l'antigène membranaire spécifique de la prostate pour délivrer des siARN induisant l'apoptose (McNamara et al, 2006). Le développement ultérieur des aptamères-ON a impliqué des modifications chimiques pour protéger les ON de la dégradation des nucléases et augmenter leur demi-vie plasmatique. Les Aptamer-ON se sont depuis montrés efficaces in vivo livraison de miARN, d'antagomirs, d'ASO et de miARN-antagomirs bimodulaires dans des modèles précliniques de cancer (Catuogno et al, 2015 Esposito et al, 2016 Soldevilla et al, 2018 ).

Systèmes de livraison basés sur les transporteurs

Les propriétés pharmacologiques des systèmes de livraison basés sur des transporteurs sont largement indépendantes des propriétés physico-chimiques de la cargaison ON et dépendent plutôt des propriétés du système de livraison. Par conséquent, les propriétés souhaitées peuvent y être intégrées via la conception de la formulation, résultant en des systèmes d'administration de médicaments avancés multifonctionnels. Ces systèmes de livraison peuvent servir (souvent simultanément) à de nombreux objectifs différents, notamment (i) protéger la cargaison ON d'une dégradation prématurée, (ii) augmenter la durée de l'effet et (iii) améliorer le ciblage. Ce ciblage amélioré peut se produire via un ciblage passif ou actif. Le ciblage passif exploite les caractéristiques microanatomiques des tissus, par exemple, les tissus avec une perméabilité et une rétention améliorées, ou des tissus avec un épithélium discontinu/fenêtré. Pour le ciblage actif, les systèmes d'administration sont décorés avec des ligands de ciblage actifs. Les systèmes d'administration à base de transporteurs particulaires facilitent également l'administration intracellulaire en améliorant l'absorption cellulaire, le trafic intracellulaire et l'échappement endosomique. De cette manière, la dose atteignant les tissus non cibles et/ou les cibles toxicologiques peut être réduite, tandis que la dose atteignant la cible pharmacologique peut être augmentée. Le résultat net est un index thérapeutique médicamenteux amélioré. La complexité de ces systèmes conduit à de nouveaux défis dans le développement, par exemple en ce qui concerne le coût, la fabricabilité, la sécurité, l'assurance qualité et le contrôle qualité.

Reflétant l'immense intérêt pour l'administration d'ON thérapeutiques, une pléthore de types de nanosupports ont été étudiés à des fins d'administration, tels que les nanoparticules d'or (Ding et al, 2014 Morgane et al, 2019 ), silice mésoporeuse (Steinbacher & Landry, 2014 Cha et al, 2017 ) et d'autres nanosupports inorganiques (Malmsten, 2013 ). Pourtant, l'accent actuel semble être mis sur les systèmes d'administration à base de lipides, de polymères et de peptides et leurs hybrides, qui sont décrits plus en détail ci-dessous (Fig 4).

Systèmes d'administration à base de lipides

L'approbation récente du patisiran (tableau 3) (Suhr et al, 2015 ), ainsi que les améliorations de la fabricabilité apportées par l'introduction de la microfluidique, ont renforcé l'intérêt pour les systèmes d'administration à base de lipides auprès de la communauté scientifique et de l'industrie pharmaceutique. Le terme nanoparticules lipidiques (LNP) est utilisé de manière générique ci-dessous pour décrire les systèmes d'administration à base de lipides chargés en ON, car la complexité structurelle de la plupart des nanotransporteurs à base de lipides complique leur classification ultérieure en, par exemple, des liposomes et des nanoparticules lipidiques solides.

Les lipides cationiques piègent les ON via des interactions électrostatiques attractives (Felgner et al, 1987 ), et commercial très efficace in vitro les réactifs de transfection sont à base de lipides cationiques. Cependant, comme la toxicité systémique des lipides cationiques est souvent dose-limitante pour in vivo application, des lipides ionisables chargés positivement à faible pH, par exemple. lors de la fabrication du LNP, et typiquement neutres au pH physiologique, sont favorisés (Semple et al, 2001). Aujourd'hui, un grand nombre de lipides ionisables ont été développés couvrant un large éventail de structures différentes. Il s'agit, entre autres, des lipides (Akinc et al, 2008 Dong et al, 2014 ) et le lipide ionisable DLin-MC3-DMA (Jayaraman et al, 2012 ), qui est considéré comme l'étalon-or des lipides cationiques ionisables. En général, ils présentent des groupes de tête contenant des amines tertiaires, qui sont protonées dans des conditions acides et non chargées à pH neutre. Les queues lipidiques hydrophobes stabilisent la structure LNP pendant la formation et la formulation via des interactions hydrophobes.

Le patisiran cliniquement approuvé contient du DLin-MC3-DMA, des lipides auxiliaires (Kulkarni et al, 2019 ) et des siARN encapsulant des lipides PEG dirigés contre l'ARNm de la transthyrétine (TTR) (Adams et al, 2018). Le lipide PEG stabilise les LNP pendant la fabrication et le stockage, et il augmente la demi-vie de circulation. Cependant, les lipides PEG inhibent la transfection cellulaire, ils sont donc conçus pour diffuser rapidement à partir des LNP après administration IV (Chen et al, 2016). Les LNP ciblent passivement le foie (Shi et al, 2011 ), et la taille des LNP permet la livraison à travers l'endothélium fenêtré dans le foie aux hépatocytes sous-jacents (Chen et al, 2016). En outre, il a été démontré que le ciblage actif des hépatocytes se produit via l'adsorption de surface de l'apolipoprotéine E, qui cible les LNP vers le récepteur des lipoprotéines de basse densité internalisant exprimé sur les hépatocytes (Akinc et al, 2010 Chen et al, 2016). Après absorption cellulaire, l'échappement endosomal de l'ARNsi dans le cytosol peut être facilité par des interactions entre le lipide cationique ionisable re-protoné dans l'environnement endosomal acide et les lipides endogènes anioniques dans la membrane endosomale (Habrant et al, 2016 ).

Systèmes de distribution à base de polymères

Bien que moins avancés cliniquement, les systèmes à base de polymères sont également des supports intéressants pour l'administration d'ON, en grande partie en raison de la flexibilité chimique des polymères, en particulier des polymères synthétiques (Fig 4) (Freitag & Wagner, 2020). Les fonctionnalités de séquence de monomère et de groupe latéral/d'extrémité peuvent être modifiées. De plus, les nanosupports polymères présentent une intégrité structurelle et une stabilité élevées pendant le stockage.

Un polymère à haute biocompatibilité qui a été largement étudié et utilisé est le copolymère poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) (Rezvantalab et al, 2018). Pour les médicaments à petites molécules, une encapsulation hautement efficace dans des nanoparticules polymères peut être réalisée, par exemple. par synthèse à base de mini-émulsion, suivie de in situ polymérisation (Fuser et al, 2019). Cependant, en raison de leur charge négative, les ON anioniques ne peuvent pas être encapsulés en utilisant cette approche.Au lieu de cela, l'encapsulation peut être réalisée grâce à des interactions électrostatiques attrayantes entre les ON anioniques et les polymères polycationiques. Les dendrimères sont des polymères hyperramifiés, bien adaptés à cette fin car ils peuvent complexer de nombreuses molécules ON. Plusieurs polymères cationiques ont été utilisés, notamment la poly(amidoamine), la poly(propylèneimine) et la poly(L-lysine) [revue par (Mignani et al, 2019 )].

Parmi les polymères synthétiques, les polyphosphazènes se distinguent par leur haute biocompatibilité et leur flexibilité chimique, et ils ont été utilisés avec succès pour délivrer des ON thérapeutiques (Peng et al, 2016 Hsu et al, 2020). Les polyphosphazènes peuvent être adaptés pour présenter une réactivité aux stimuli (bio)chimiques externes (Teasdale, 2019), par exemple. pH local. Cela permet une libération ciblée de la cargaison sur le site d'action souhaité. En complément de l'utilisation de polymères synthétiques, il existe un intérêt de longue date pour l'utilisation de biopolymères naturels pour l'encapsulation ON. L'exemple le plus notable est l'utilisation du polycation chitosan, souvent en complexe avec un autre polymère anionique, par exemple. PLGA (Taetz et al, 2009 ) ou alginate (Lee & Mooney, 2012 ).

Récemment, il y a eu un intérêt significatif pour les nanoparticules hybrides lipide-polymère (Thanki et al, 2017). Ces hybrides combinent les propriétés souhaitables des deux types de nanoparticules, c'est-à-dire la stabilité sérique du système matriciel à base de PLGA avec la biocompatibilité et la capacité de charge élevée des ON dans les systèmes de délivrance basés sur les lipides cationiques.

Systèmes de distribution à base de peptides

Les CPP représentent un autre groupe de composés qui ont également été utilisés avec succès comme système d'administration de médicaments à base de porteurs (Lehto et al, 2016). Dans ce contexte, la formation de nanoparticules CPP/ON est entraînée par des interactions électrostatiques et hydrophobes entre les CPP cationiques et les ON anioniques. Par rapport aux CPP-ON directement conjugués, les vecteurs à base de peptides sont plus amphipathiques et portent généralement des modifications chimiques supplémentaires qui les rendent compatibles avec l'encapsulation des ON. Généralement, de telles modifications comprennent l'incorporation de diverses modifications hydrophobes, telles que des dérivés d'acides gras, aux séquences CPP, qui augmentent la stabilité de la formulation et améliorent leur absorption cellulaire et leur échappement endosomique. Divers types de CPP ont démontré un potentiel considérable pour l'administration d'ON dans un format à base de nanoparticules, y compris les dérivés peptidiques MPG et PepFect [examinés dans (Boisguerin et al, 2015 Lehto et al, 2016 )].

Systèmes de délivrance de complexation d'anticorps

Les anticorps sont une autre forme prometteuse de système d'administration de porteurs utilisés à la fois comme conjugués directs ou comme porteurs non conjugués. En tant que supports non conjugués, des anticorps ou des fragments d'anticorps ont été fusionnés avec un peptide d'avidine ou de protamine. Profitant du système naturel de complexation avidine-biotine, les molécules de fusion anticorps-avidine se lient aux ON biotinylés (Penichet et al, 1999). Le peptide protamine est un peptide de liaison à l'ARN chargé positivement, qui se lie à l'ARNsi et le condense en un complexe anticorps-ARNi (Song et al, 2005). Ce système a été utilisé pour lier des ARNsi cytotoxiques avec des anticorps ciblés sur les cellules cancéreuses Her2-positives (Yao et al, 2012). Comme tous les systèmes de complexation, ces deux systèmes ont l'avantage d'avoir un support d'anticorps spécifique à la cible établi, qui peut facilement être complexé avec n'importe quel ARNsi.

Systèmes modèles pour le développement d'oligonucléotides

Le développement réussi de médicaments à base d'ON dépend d'une connaissance détaillée des propriétés pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PD). Les analyses PK/PD décrivent la relation entre la PK (concentration de médicament dans l'organisme) et la PD (réponse biologique de l'organisme aux médicaments) d'une manière dépendante du temps (Negus & Banks, 2018). La modélisation et les simulations PK/PD sont utilisées pour caractériser rapidement l'efficacité et l'innocuité des médicaments, et les modèles de simulation PK/PD contenant in vitro et in vivo les études précliniques permettent d'anticiper les risques potentiels chez l'homme (Li et al, 2016). L'utilisation de systèmes de modèles prédictifs pour les analyses PK/PD permet d'économiser du temps, des coûts et de minimiser le besoin de in vivo études, facilitant la traduction du banc au chevet.

Méthodologies de test in vitro des oligonucléotides

In vitro des modèles peuvent être mis en œuvre pour tester l'activité pharmacologique, l'efficacité de la transfection, l'hépatotoxicité et la demi-vie intracellulaire. Cependant, il est généralement difficile de corréler in vitro résultats aux tests précliniques et cliniques in vivo résultats (tableau 2). De nouvelles technologies, telles que la reprogrammation de cellules dérivées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (Takahashi & Yamanaka, 2006 Takahashi et al, 2007 ) et les techniques d'édition du génome pour créer des lignées cellulaires isogéniques, ont révolutionné le domaine (Ran et al, 2013). Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D), y compris les organoïdes, sont utilisées pour améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques des maladies, ainsi que les études d'efficacité ON. Un exemple de traduction réussie d'un modèle 3D à un essai clinique est le sepofarsen pour le traitement de la maladie rétinienne héréditaire de Leber amaurose congénitale (LCA) (Collin et al, 2012 de Hollander et al, 2006). La combinaison d'organoïdes rétiniens dérivés de patients avec des études de toxicité chez des primates non humains (PNH) était suffisante pour lancer un essai clinique de phase I/II (NCT03140969, NCT03913143) (Cideciyan et al, 2019). L'œil est un organe cible exceptionnel, compte tenu de son statut isolé et privilégié du système immunitaire, qui permet de traduire les résultats des organoïdes en culture vers l'œil humain. Cependant, pour d'autres maladies (multi-)organiques, l'établissement de modèles cellulaires prédictifs pour imiter les fonctions d'organes entiers reste un défi.

In vivo In vitro Organoïdes 3D Organes sur puces
Tissu d'origine humaine Non Oui Oui Oui
Médecine personnalisée Non Oui Oui Oui
Microenvironnement réaliste Oui Non Oui Oui
Fonction au niveau de l'orgue Oui Limité Potentiellement/Limité Potentiellement
Lectures en temps réel Non Limité Limité Oui
Tests à haut débit Non Oui Limité Peut-être
Pharmacodynamique / -cinétique Oui Non Non/Limité Potentiellement

Une alternative intéressante aux techniques de culture tissulaire 2D et 3D est la technologie basée sur la microfluidique. orgue sur puce (van der Meer & van den Berg, 2012 ), qui consiste en des modèles dérivés d'iPSC de micro-ingénierie qui combinent les avantages des in vitro et in vivo des modèles. La technologie décompose les organes en composants les plus essentiels, y compris les barrières biologiques, pour l'administration de médicaments, l'efficacité, la toxicité et les études PK/PD. Les organes sur puce reproduisent l'interaction entre les cultures de plusieurs types de tissus à l'aide de canaux et de chambres microfluidiques (Huh et al, 2010 Kim et al, 2012 Westein et al, 2013). Cette interaction peut être surveillée en temps réel pour étudier la PK/PD d'un médicament spécifique ainsi que les interactions médicament-médicament (Lee et al, 2017 Shinha et al, 2020). Par exemple, l'évaluation PK/PD de la terfénadine (un type d'antihistaminique) a été réalisée en utilisant un modèle cellulaire combinant des cellules cardiaques et hépatiques dans deux chambres interconnectées. Ce modèle, combiné à des réseaux de microélectrodes, a également contribué à prédire la cardiotoxicité potentielle du médicament (McAleer et al, 2019). Il est intéressant de noter que les récentes études de perméabilité aux médicaments dans les modèles de barrière hémato-encéphalique (BHE) sur puce se sont révélées plus prédictives que les modèles existants. in vitro modèles (van der Helm et al, 2016). D'autres modèles cellulaires en cours de développement incluent la rétine sur puce (Achberger et al, Référencement 2019 et al, 2019 ) et poumon sur puce (Huh et al, 2010) modèles. Imiter la fonction d'organes entiers dans une boîte en combinant plusieurs types de cellules dans un seul appareil peut avoir un potentiel précieux pour le criblage et le développement de médicaments, ainsi que pour les études PK/PD et de toxicité. À l'avenir, les modèles d'organes sur puce pourraient, dans une certaine mesure, remplacer les modèles animaux expérimentaux.

Investigation des propriétés PK/PD in vivo

In vivo les modèles ont été largement utilisés pour les études de détermination de la dose. Les propriétés pharmacocinétiques sont largement comparables entre plusieurs espèces, notamment la souris, le rat, le PNH et l'homme (Yu et al, 2009 Geary et al, 2015). Par conséquent, les relations PK/PD entre espèces sont très précieuses pour la prédiction du dosage chez l'homme. Les modèles animaux ont été essentiels pour déterminer in vivo l'efficacité des ON, l'administration de tissus spécifiques et l'optimisation de la voie d'administration pour les maladies systémiques et neurologiques (Schoch & Miller, 2017 Buijsen et al, 2019). Préclinique in vivo des tests sur un modèle de souris transgénique pour la SMA ont prédit le bénéfice accru du traitement des stades pré-symptomatiques de la maladie, qui a ensuite été validé en clinique.

Cependant, une connaissance détaillée du modèle de la maladie est vitale pour l'interprétation des données : Une étude dans le mdx modèle de souris pour DMD de la PK/PD de 2ʹ-OLes Me ON pour la DMD ont révélé des niveaux d'ON plus élevés dans les fibres musculaires déficientes en dystrophine que dans les fibres saines, ainsi qu'une efficacité améliorée de saut d'exon (Heemskerk et al, 2010). Cependant, l'efficacité de l'ON était plus faible dans les essais cliniques chez les patients DMD, potentiellement en raison d'une meilleure capacité de régénération chez la souris. De plus, les modèles animaux peuvent ne pas toujours être réciproques de la condition humaine en raison du contexte génomique différent des mutations, même lors de l'utilisation de modèles animaux humanisés. Ceci est évident pour l'épissage pré-ARNm, qui est régulé différemment entre les tissus, les organes et les espèces (Rivera-Barahona et al, 2015). Entre les tissus, il a été observé que des variantes d'ADN affectent l'épissage pré-ARNm, ce qui complique l'interprétation de in vitro études. Un exemple est le changement profondément intronique sous-jacent à l'ACL : alors que les cellules lymphoblastoïdes et fibroblastes dérivées de patients suggèrent un effet hypomorphe (Garanto et al, 2016), des iPSC reprogrammées dérivées de patients différenciées vers un destin rétinien ont révélé que le pourcentage d'ARNm épissé de manière aberrante était fortement augmenté dans les cellules photoréceptrices, expliquant le phénotype rétinien observé chez les patients LCA (Parfitt et al, 2016). Des études de suivi ont révélé qu'un pseudoexon présent chez l'homme était différemment reconnu dans les lignées cellulaires dérivées d'autres espèces (Garanto et al, 2015). Ainsi, il faut être prudent lors de la sélection d'un système modèle pour évaluer les effets d'une certaine variante génétique, ainsi que pour le développement de thérapies de modulation d'épissage.

Évaluation de l'innocuité des thérapies à base d'oligonucléotides

Bien que de nouvelles chimies et technologies d'administration puissent conduire à une efficacité plus élevée, il est important de dépister les effets secondaires potentiels dans les premières phases du développement préclinique pour éviter un échec ultérieur. Les aspects toxicologiques des ON thérapeutiques ont été largement résumés précédemment (Andersson & den Besten, 2019). Le groupe de travail sur la sécurité des oligonucléotides (OSWG) a également publié des directives détaillées pour évaluer les divers aspects de la sécurité de l'ON. Notre compréhension de la toxicité induite par l'ON augmente à mesure que davantage de données précliniques et cliniques deviennent disponibles. Bien que le concept de toxicité de classe semble nuancé à la lumière des connaissances croissantes sur diverses chimies, les effets secondaires liés à l'ON relèvent toujours de deux catégories principales : (i) les effets dépendants de l'hybridation, y compris les effets sur et hors cible, et ( ii) effets indépendants de l'hybridation, principalement causés par les propriétés de liaison aux protéines (figure 5).

Figure 5. Toxicités médiées par l'ASO

Représentation schématique des toxicités médiées par ON les plus courantes, qui sont principalement classées comme effets dépendants de l'hybridation (hybridation Watson-Crick) ou indépendants de l'hybridation (accumulation tissulaire, mécanismes pro-inflammatoires et/ou effets de liaison aux protéines). Certains d'entre eux sont strictement spécifiques à la classe (indépendants de la séquence), tandis que d'autres peuvent être influencés par la séquence (spécifiques à la séquence).

Effets dépendants de l'hybridation

La sécurité sur cible, également appelée pharmacologie exagérée, concerne les toxicités possibles induites par une activité excessive ou prolongée de l'ON dans les organes cibles ou non cibles. Ces effets sont considérés comme rares et sont généralement découverts dans des études précliniques. Cependant, en raison de l'action spécifique à la séquence des médicaments à base d'ON, les séquences cibles peuvent ne pas être conservées d'une espèce à l'autre. Par conséquent, les séquences humaines pourraient ne pas montrer d'efficacité chez les rongeurs ou les PSN, par conséquent, des substituts spécifiques à l'espèce sont nécessaires pour l'évaluation des risques ciblée (Levin et Henry, 2008).

Les effets hors cible correspondent aux toxicités potentielles associées à l'hybridation de l'ON à des cibles d'ARN non souhaitées (complémentarité complète ou partielle). Ils ont augmenté avec le développement des chimies de haute affinité, par exemple. LNA, tcDNA et éthyle contraint (cEt), qui permettent l'utilisation de séquences beaucoup plus courtes. Les effets hors cible sont particulièrement préoccupants pour les gapmer ONs et siRNA, qui visent à réguler à la baisse leurs cibles, car ils pourraient réguler à la baisse l'expression de ceux qui ne le sont pas (Fedorov et al, 2006 Burel et al, 2016). Plusieurs études ont caractérisé les mécanismes associés aux effets hors cible et décrit des moyens élégants de réduire les risques et d'améliorer la conception de gapmers et d'ARNsi spécifiques (Hagedorn et al, 2017 Janas et al, 2018). En revanche, les ASO à commutation d'épissage doivent lier des éléments régulateurs d'épissage spécifiques pour être efficaces, et ils sont donc moins susceptibles d'induire des effets hors cible. Avec le développement d'ON plus stables et de systèmes d'administration efficaces, les administrations systémiques pourraient être distribuées dans les tissus cibles mais aussi non cibles. Par conséquent, les effets hors cible doivent être soigneusement évalués pendant le développement préclinique. Les lignes directrices publiées par l'OSWG pour évaluer les effets hors cible recommandent (i) in silico évaluation, (ii) interprétation de in silico hits utilisant des données auxiliaires (par exemple. expression dépendante du temps et de l'espace-temps de l'ARN hors cible) et (iii) in vivo évaluation des médicaments ON (Lindow et al, 2012 ).

Effets indépendants de l'hybridation

La plupart des toxicités médiées par ON ne sont pas causées par l'appariement des bases Watson-Crick à l'ARN, mais sont plutôt le résultat d'interactions ON-protéine et dépendent donc de la chimie et/ou du système de délivrance. Les ON monocaténaires modifiées par PS présentent des affinités de liaison aux protéines particulièrement élevées, et la majorité des effets indépendants de l'hybridation ont ainsi été rapportés pour cette classe d'ON, par opposition aux siRNA contenant moins de résidus PS modifiés.

Inhibition de la coagulation sanguine

L'inhibition de la voie intrinsèque de la coagulation sanguine est un effet secondaire bien documenté de la chimie du PS (Henry et al, 1997b Échevarria et al, 2019). Il est considéré comme un effet de classe, modulé par les interactions de l'ON avec les protéines plasmatiques de manière indépendante de la séquence. La modification PS prolonge sélectivement le temps de thromboplastine partielle à de faibles concentrations plasmatiques en inhibant le complexe ténase. Cependant, à des concentrations plasmatiques élevées, les voies intrinsèques et extrinsèques sont affectées, suggérant des effets inhibiteurs supplémentaires (Sheehan & Lan, 1998). L'allongement des temps de coagulation est corrélé à la concentration plasmatique maximale (Cmax) des ON circulantes, et il n'a pas été associé à des signes cliniques pertinents, car il peut être contrôlé par une réduction de la dose ou par l'allongement des temps de perfusion. Néanmoins, il devrait être inclus dans les études de dépistage, qui peuvent être réalisées à la fois in vivo et in vitro dans le sérum de souris, de PNH et humain, respectivement, puisque les résultats peuvent être extrapolés à travers les espèces (Andersson & den Besten, 2019 ).

Activation du complément

Il a été rapporté que l'administration systémique d'ON modifiées par PS active la voie alternative du complément en conséquence de la liaison aux protéines plasmatiques (Henry et al, 2002). Bien que cet effet indépendant de l'hybridation soit principalement lié à la chimie ON (effet de classe), une activation inattendue du complément a été observée avec une certaine spécificité de séquence, comme dans le cas de l'ADNtc (Aupy et al, 2020). L'activation de la voie alternative du complément a été étudiée de manière approfondie dans les modèles NHP, qui sont particulièrement sensibles (Henry et al, 2016). L'effet dépend de la concentration plasmatique et peut être contrôlé en augmentant le temps de perfusion IV pour réduire la Cmax.max. Il a été démontré que les ON modifiées par PS interagissent directement avec le facteur H plasmatique, qui est un régulateur négatif de la cascade du complément qui réduit les niveaux libres d'inhibiteur, permettant une amplification incontrôlée de la cascade et la libération de produits fractionnés tels que Bb et les anaphylotoxines C3a et C5a (Henri et al, 1997a). Le complément peut être activé de la même manière à chaque dose. Par conséquent, l'administration chronique d'ON toxiques peut entraîner une déplétion en C3, entraînant éventuellement une altération de la fonction du complément, une inflammation secondaire et une vascularite (Engelhardt et al, 2015 Shen et al, 2016 Andersson & den Besten, 2019 ). Bien que les humains semblent moins sensibles à l'activation du complément, il est recommandé d'évaluer systématiquement l'activation du complément dans les études d'innocuité précliniques de nouveaux candidats-médicaments ON dans les PSN.

L'activation du complément peut être évaluée in vitro dans les PNH ou le sérum humain, ou le sang total, pour mesurer les produits fractionnés de la voie alternative du complément (Bb, C3a et C5a). Néanmoins, il faut être prudent dans l'interprétation des résultats, car il est difficile d'extrapoler et de prédire les relations dose-réponse (Andersson & den Besten, 2019 ).

Immunostimulation

L'immunostimulation induite par l'ON est un effet secondaire complexe qui dépend de plusieurs aspects, dont la chimie et la séquence nucléotidique (Krieg, 1998 Agrawal & Kandimalla, 2004). Les ON peuvent activer le système immunitaire inné en se liant à des récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) tels que les récepteurs Toll-like (TLR). L'activation du système immunitaire inné par les ON contenant des CpG est comparable à celle observée pour l'ADN bactérien et les ON contenant des CpG sont utilisées pour les thérapies contre le cancer et les maladies auto-immunes ainsi que comme adjuvants vaccinaux (Krieg & Davis, 2001 Krieg, 2006 Kline & Krieg, 2008). Cependant, l'activité immunostimulante des ON conçues à des fins antisens constitue un effet secondaire potentiel. À cet égard, des ON modifiées avec des modifications 2ʹ-ribose, des résidus 5-méthyl cytosine ou sans motifs CpG, ont été conçues pour éviter l'activation de TLR9. Des études supplémentaires ont démontré que les ONs sans CpG et modifiées par PS peuvent également provoquer des réponses pro-inflammatoires, bien que le mécanisme moléculaire soit encore débattu (Vollmer et al, 2004 Senn et al, 2005 Younis et al, 2006). Il est à noter que les effets immunostimulants n'ont jamais été rapportés pour les ON à squelette neutre, par exemple. PMO (Zhang et al, 2015). Les rongeurs sont particulièrement sensibles à la stimulation immunitaire. Les souris traitées avec de fortes doses de PS-ON présentent des niveaux accrus de cytokines circulantes (IL-1b, IL-6, interféron, facteur de nécrose tumorale-α) et de chimiokines, ainsi qu'une prolifération de lymphocytes B (Monteith et al, 1997). Bien que généralement moins critiques, certaines réponses inflammatoires significatives, par exemple. vascularite, liée à l'activation du complément médiée par les PS-ON, ont été décrites dans des études sur les PSN (Levin & Henry, 2008 Engelhardt et al, 2015 Frazier, 2015 EMA, 2016 ). Les différences de réponse immunitaire entre les espèces ont été attribuées à la séquence différentielle, à l'expression et à la fonction des PRR codés dans la lignée germinale (Barchet et al, 2008 ).

Dans les essais cliniques, des effets indésirables inflammatoires peuvent se manifester par des symptômes pseudo-grippaux et des réactions au site d'injection après administration sous-cutanée (SC) (Rudin et al, 2001 Thomas et al, 2013 Voix et al, 2014). La compréhension des mécanismes sous-jacents de l'induction thérapeutique médiée par ON d'effets indésirables pro-inflammatoires a facilité la conception de séquences plus sûres et plus puissantes qui sont efficaces à des doses plus faibles. Néanmoins, certaines séquences présentent encore une toxicité inattendue et un dépistage spécifique des effets indésirables immunostimulants est recommandé. En plus de in vivo études chez les rongeurs et les PSN, une évaluation pro-inflammatoire est généralement effectuée in vitro utilisant des cellules mononucléées du sang périphérique humain ou du sang total (Apter et al, 1990 Lankveld et al, 2010 ).

Les formulations à base de nanoparticules administrées par voie IV peuvent également induire des réactions liées à la perfusion (IRR), par exemple. hypersensibilité, évidente sous forme de symptômes pseudo-grippaux et même d'anaphylaxie cardiaque (Szebeni, 2018). Par conséquent, avant la perfusion IV de patisiran, les patients doivent recevoir une prémédication avec des antihistaminiques IV (antihistaminiques H1/H2), des corticostéroïdes IV et de l'acétaminophène ou du paracétamol par voie orale pour supprimer les RIR. Des IRR légers à modérés ont été observés dans un essai de phase III sur le patisiran chez environ 20 % des patients, qui étaient tous prémédiqués, dont l'incidence a diminué au fil du temps (Adams et al, 2018). En revanche, une prémédication n'est pas nécessaire avant l'administration d'ON et de conjugués GalNAc-siRNA.

Thrombocytopénie

La thrombocytopénie associée à l'ON est un événement occasionnel qui a été observé chez les rongeurs et les PSN, ainsi que dans trois essais cliniques récents avec des PS-ON non apparentés [volanesorsen (FDA, 2018), inotersen (Benson et al, 2018 Mathew & Wang, 2019 ) et drisapersen (EMA, 2016 Goemans et al, 2016 )]. Les mécanismes sous-jacents exacts de la thrombocytopénie sont encore débattus et plusieurs mécanismes à médiation immunitaire et non immunitaire ont été proposés. L'activation directe des plaquettes par les PS-ON via la liaison aux récepteurs plaquettaires a été démontrée (Flierl et al, 2015 Couture et al, 2017). De plus, un mécanisme de type thrombocytopénie induit par l'héparine via l'induction d'anticorps IgG anti-facteur plaquettaire 4 a également été proposé, basé sur la liaison d'acides nucléiques au facteur plaquettaire 4 (Jaax et al, 2013 ), bien que des résultats contradictoires aient été rapportés. Une étude récente suggère que la séquestration des plaquettes dans le foie et la rate se produit par l'activation des monocytes, mais pas des plaquettes, et s'accompagne d'une augmentation des taux sériques d'IgM (Narayanan et al, 2018). Dans la plupart des cas, la thrombocytopénie après traitement par ON est légère à modérée et réversible. Le nombre de plaquettes ne descend pas en dessous de la limite normale pendant le traitement et se normalise après l'arrêt du traitement. Cependant, une baisse inquiétante et sévère (< 50 000 plaquettes/µl) a été observée dans les études sur les PSN après des doses répétées (Henry et al, 2017). À ce jour, aucune thrombocytopénie sévère n'a été signalée pour les médicaments à ARNsi, ni dans les études précliniques ni dans les essais cliniques, mais il a été démontré que l'encapsulation de l'ARNsi dans les LNP provoque une thrombocytopénie chez le rat, vraisemblablement induite par les molécules lipidiques cationiques elles-mêmes (Chi et al, 2017 ).

Organes à forte exposition

Après administration IV et indépendamment de la chimie, les concentrations les plus élevées d'ON se trouvent dans le foie et les reins, qui sont considérés comme des organes à forte exposition (Fig 5). Les toxicités observées dans ces organes ne sont pas nécessairement associées à l'accumulation d'ONs en soi mais peut aussi être due à des effets spécifiques à la séquence. Les ON accumulés sont souvent apparents sous forme de granules basophiles (ON dans les compartiments lysosomal) dans les coupes de tissus. Cependant, ces effets sont considérés comme non indésirables en raison de leur caractère réversible à l'arrêt du traitement. En revanche, des toxicités aiguës caractérisées par de vastes zones de nécrose, une élévation prononcée des taux d'enzymes hépatiques, une morbidité et une mortalité ont été rapportées pour certains gapmers de haute affinité après une ou quelques doses chez la souris (Hagedorn et al, 2013 Burdick et al, 2014). Les mécanismes sous-jacents à ces toxicités aiguës spécifiques à une séquence peuvent être l'accumulation de produits d'ARNm clivé par la RNase H et/ou des interactions protéiques (Burel et al, 2016 Couture et al, 2016 Shen et al, 2019). Alors que le dépistage de ces toxicités aiguës reposait auparavant sur in vivo études évaluant les taux d'enzymes hépatiques après administration IV chez les rongeurs, un nombre croissant de in silico (Hagedorn et al, 2013 Burdick et al, 2014) et in vitro modèles (Couture et al, 2016 Dieckmann et al, 2018 ) ont été établis.

Les lésions rénales sont généralement limitées aux tubules proximaux et n'apparaissent que chez les animaux traités avec des doses d'ON beaucoup plus élevées que les doses cliniquement pertinentes. Aucun dysfonctionnement rénal cliniquement significatif n'a été rapporté dans une grande étude rétrospective d'essais de gapmer 2ʹ-MOE (Crooke et al, 2018). La toxicité rénale était principalement considérée comme une toxicité liée à l'accumulation et principalement sans séquence spécifique jusqu'à ce que des lésions tubulaires plus aiguës soient signalées avec des ON de haute affinité, par exemple. LNA (Engelhardt et al, 2015). Au-delà des biomarqueurs classiques des lésions rénales, par exemple. augmentation de l'excrétion de la β2-microglobuline et de la molécule de lésion rénale-1, un test prédictif basé sur le facteur de croissance épidermique a récemment été développé pour exclure ce type de candidats néphrotoxiques (Moisan et al, 2017 ).

Produits thérapeutiques à base d'oligonucléotides approuvés

Les progrès de la technologie ON thérapeutique au cours des dernières décennies offrent une opportunité unique d'aborder des cibles médicamenteuses auparavant inaccessibles (Bennett et al, 2017). Depuis l'approbation du fomivirsen en 1998 par la FDA pour le traitement de la rétinite à cytomégalovirus (CMV) (Marwick, 1998), 11 médicaments à base d'ON ont reçu une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés chez l'homme, et deux autres médicaments à base d'ON ont reçu un avis favorable de commercialisation par l'EMA (tableau 3). Ici, nous discutons des thérapies ON approuvées en fonction de leurs modalités fonctionnelles.

Le fomivirsen (Vitravene) est un ON basé sur l'ADN PS 21-mer développé pour le traitement des patients atteints de rétinite à CMV, en particulier ceux atteints du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) (Étude Vitravene G, 2002). Cet ASO de première génération cible l'ARNm du gène majeur immédiat du CMV humain pour la dégradation de la RNAse H (Geary et al, 2002). Fomivirsen est délivré localement par l'administration IVT et ne nécessite donc pas d'agent de livraison. Alors qu'une séquence gapmer de deuxième génération basée sur la 2ʹ-MOE (ISS 13312) était en cours de développement clinique (Henry et al, 2001 ), Novartis a arrêté le développement et retiré la commercialisation (Wathion, 2002 ). Le nombre de cas de rétinite à CMV avait considérablement diminué en raison du développement d'un traitement antirétroviral hautement actif. Néanmoins, le fomivirsen a été un succès et a établi que les thérapies ON étaient viables pour le développement clinique.

5′-Cs^-As^-G^-A^-A^-A^-GF -A^-GF -U^-GF -U^-CF -U^-CF -A^-U^-C ^-U^-U^-A^-3′

3′-Us^-Gs^-G^-UF -C^-UF -U^-UF -C^-UF -C^-AF -C^-AF -G^-AF -G^-UF -A ^-GF -Comme F -Comme F -U^-5′

5′-As^-Cs^-C^-U^-G^-A^-A^-AF -G^-UF -A^-G^-G^-A^-CF -CF -U^- UF -U^-A^-Us^-As F -U^-3′

5′-As^-CF s-As^-AF -AF -AF -G^-CF -A^-AF -A^-A^-C^-AF -G^-GF -U^-CF -U ^-A^-Gs^-As^-A^-3′

  • s, liaison phosphorothioate *, 2′-MOE d, 2′-désoxy m, 5-méthyl F , 2′-F ^, 2′-OMe en italique, PMO † Approbation de Viltolarsen par le ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être, 25 mars 2020 ‡ Milasen approuvé par la FDA pour les essais cliniques uniquement, ¥, le lumasiran et l'inclisiran ont reçu un avis favorable pour la commercialisation par le CHMP.

Les ASO de deuxième génération RNase-dépendants ciblant le foie ont été approuvés pour la polyneuropathie de l'amylose héréditaire à médiation par la transthyrétine (ATTR) (inotersen) ainsi que le syndrome de chylomicronémie familiale (FCS), l'hypertriglycéridémie et la lipodystrophie partielle familiale (volanesorsen) et l'hypercholestérolémie familiale ( mipomersen). La maladie rare hATTR est liée à des mutations faux-sens dans le TTR gène, ce qui entraîne un mauvais repliement de la protéine TTR. La protéine TTR est sécrétée dans le sang et le liquide céphalo-rachidien, et l'accumulation de dépôts amyloïdes (à la fois de type sauvage et mutant) dans les tissus provoque une polyneuropathie, un dysfonctionnement de plusieurs organes et une cardiomyopathie. Inotersen cible l'expression hépatique de l'ARNm de TTR de type sauvage et mutant. Les patients traités par inotersen présentent une réduction des taux sériques de protéine TTR et une meilleure qualité de vie (Benson et al, 2018). Le volanesorsen, bien qu'en attente de l'approbation de la FDA au moment de la rédaction de cette revue, a obtenu l'approbation de l'EMA en mai 2019. En ciblant le 3ʹ UTR de l'ARNm de l'apolipoprotéine C3, le volanesorsen réduit les niveaux de triglycérides et d'apolipoprotéine C3, qui représentent deux facteurs de risque connus pour maladies cardiovasculaires, tout en augmentant les taux de cholestérol à lipoprotéines de basse et haute densité et d'apolipoprotéine B chez les patients atteints de FCS et d'hypertriglycéridémie (Graham et al, 2013 EMA, 2019 ). Mipomersen cible également l'apolipoprotéine B-100 pour réduire le cholestérol à lipoprotéines de basse densité circulant, qui constitue un autre facteur de risque majeur de maladie cardiovasculaire (Wong et Goldberg, 2014). Contrairement à l'inotersen et au volanesorsen, le mipomersen a reçu l'approbation de la FDA, mais l'autorisation de l'EMA a été refusée en raison de problèmes de sécurité liés à la toxicité hépatique et aux événements cardiovasculaires graves (EMA, 2012). Il a depuis été abandonné par la FDA et n'est disponible que via une stratégie d'évaluation et d'atténuation des risques restreinte. Les trois thérapies ON sont dosées par administration SC sans agent d'administration en raison de l'absorption naturelle des ON par le foie. En 2004, l'aptamère pegaptanib (Macugen) a été approuvé par la FDA pour la prévention de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (Ng et al, 2006). Le pegaptanib est un conjugué covalent d'un aptamère simple brin hautement modifié et de deux unités PEG de 20 kDa. Il se lie avec une spécificité et une affinité élevées à l'isoforme extracellulaire du VEGF 165 et bloque son activité néo-angiogénique (Ruckman et al, 1998). Les patients traités par pegaptanib ont présenté une perte de vision réduite par rapport aux témoins placebo (Gragoudas et al, 2004). Commun aux maladies dégénératives, un traitement précoce permet d'améliorer les résultats thérapeutiques (Gonzales CR & Group VISiONCT, 2005 ).

Plusieurs médicaments à base d'ON modifiant l'épissure sont approuvés pour traiter les troubles pédiatriques DMD et SMA, en se concentrant sur la modification de l'épissure et ciblent les tissus au-delà du foie. Le premier médicament approuvé, c'est à dire. eteplirsen (Exondys51), est un ASO de commutation d'épissure basé sur PMO qui interagit spécifiquement avec DMD exon 51, et est utilisé chez les patients DMD présentant des délétions de dystrophine susceptibles de sauter l'exon 51 (

14 % des patients) (Cirak et al, 2011). L'expression de la dystrophine est principalement limitée aux muscles squelettiques et cardiaques, et l'eteplirsen devrait être le plus efficace dans le muscle squelettique. Cependant, propice à tous les PMO, une accumulation élevée dans les reins et une excrétion urinaire rapide sont également attendues (Heemskerk et al, 2009). L'approbation de l'eteplirsen par la FDA s'est accompagnée d'une controverse en raison de la conception de l'essai et des difficultés à quantifier l'augmentation de l'expression de la dystrophine, ce qui laisse planer le doute sur l'efficacité de l'eteplirsen (Aartsma-Rus & Arechavala-Gomeza, 2018). En conséquence, il n'a pas été approuvé par l'EMA. Renforcés par des conceptions d'essais cliniques améliorées, deux ASO supplémentaires basés sur le PMO ont récemment été approuvés pour les patients DMD susceptibles de sauter l'exon 53 de la dystrophine, c'est à dire. golodirsen et viltolarsen, par la FDA, et à la fois par la FDA et le ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être, respectivement (Dhillon, 2020 Heo, 2020).

Le seul traitement à base d'ON approuvé pour une maladie neurologique est le nusinersen, utilisé pour le traitement de la SMA (Aartsma-Rus, 2017 Finkel et al, Mercuri 2017 et al, 2018). Nuusinersen cible l'exon 7 à épissage alternatif de SMN2 pré-ARNm, augmentant l'inclusion d'exons et produisant une protéine SMN fonctionnelle. Il est administré directement dans le liquide céphalo-rachidien entourant la moelle épinière par injection informatique (Hache et al, 2016). L'administration informatique dirige l'absorption dans le SNC, permettant de faibles doses et le contournement du métabolisme hépatique et de l'excrétion rénale. Les patients, en particulier les jeunes patients pré-symptomatiques, rapportent une survie prolongée et des étapes motrices atteintes au cours de l'histoire naturelle attendue de la maladie. La controverse liée au nusinersen ne porte pas sur l'efficacité mais plutôt sur le coût excessivement élevé, qui a retardé l'approbation et empêché la commercialisation dans les pays dotés de services de santé nationaux (Starner & Gleason, 2019).

Le succès du nusinersen a conduit à l'utilisation des ON comme médicaments personnalisés, illustrés par le développement du milasen, qui cible une mutation spécifique à un seul patient atteint d'une forme de maladie de Batten (Kim et al, 2019). Dans ce cas, l'insertion d'un rétrotransposon SVA (SINE-VNTR-Alu) a modifié l'épissage du domaine majeur de la superfamille facilitateur contenant 8 (MFSD8) exon 6 dans un site accepteur d'épissage cryptique. Les cliniciens ont suivi les études précliniques et les plans d'essai des études nusinersen pour accélérer l'approbation de l'étude clinique par la FDA : le dosage du milasen a été initié 14 mois après le diagnostic clinique et seulement 4,5 mois après l'identification d'un ASO thérapeutique. Le taux de détérioration du patient signifiait que le dosage devait être initié dès que possible, le patient a donc été administré parallèlement aux études de toxicologie chez l'animal. Bien que l'efficacité thérapeutique chez un seul patient ne puisse être définie, le milasen a réduit la fréquence et la durée des crises et a potentiellement diminué le déclin neurodégénératif.

Deux ON thérapeutiques basées sur l'ARNi, c'est à dire. patisiran et givosiran, ont été approuvés par la FDA en 2018 et 2019, respectivement. Patisiran représente une étape importante, car il s'agit du premier médicament commercialisé à base de siRNA, lancé seulement 20 ans après la découverte du mécanisme RNAi (Fire et al, 1998). Comme l'inotersen, le patisiran inhibe l'expression hépatocytaire de la TTR chez les patients atteints d'ATTRh (Adams et al, 2018). Patisiran se compose de siRNA dirigés contre l'ARNm de TTR formulés sous forme de LNP, qui sont administrés par voie systémique par perfusion IV. La dernière percée est le givosiran, qui représente le premier conjugué GalNAc-siRNA approuvé. Givosiran inhibe la synthèse hépatique de la delta aminolévulinate synthase 1 (ALAS1) chez les patients atteints de porphyrie hépatique aiguë (AHP), qui est une maladie héréditaire rare de la biosynthèse de l'hème (Sardh et al, 2019). L'administration sous-cutanée mensuelle de givosiran entraîne une distribution spécifique des hépatocytes et une régulation négative de ALAS1 ARNm dans le foie.

Récemment, deux nouveaux médicaments GalNAc-siRNA ciblant le foie ont reçu un avis favorable pour leur commercialisation en Europe, c'est à dire. lumasiran et inclisiran (Fitzgerald et al, 2017 McGregor et al, 2020). Le lumasiran cible l'hydroxyacide oxydase 1 (HAO1) ​​pour le traitement de l'hyperoxalurie primaire de type 1 (PH1), une maladie héréditaire rare caractérisée par une surproduction d'oxalate. Le ciblage de HAO1 réduit le substrat nécessaire à la production d'oxalate dans le foie (McGregor et al, 2020). Inclisiran cible la proprotéine convertase subtilisine-kexine de type 9 (PCSK9) pour réduire le cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL). PCSK9 est une sérine protéase, qui se lie aux récepteurs LDL pour induire leur dégradation lysosomale. Par conséquent, l'extinction de PCSK9 améliore la demi-vie des récepteurs LDL responsables de la clairance du cholestérol (Fitzgerald et al, 2017). L'inclisiran réduit de plus de 50 % les taux de cholestérol LDL chez les patients traités avec des effets secondaires minimes (Khvorova, 2017 Ray et al, 2020). L'approbation d'Inclisiran étendra les indications des ON pour inclure non seulement les maladies rares mais aussi les maladies courantes.

Commentaires de conclusion et perspectives d'avenir

En 1978, il a été démontré qu'une ON basée sur l'ADN 13-mer se liant à l'ARN du virus du sarcome de Rous pouvait inhiber l'expression des protéines en culture cellulaire (Zamecnik & Stephenson, 1978), mais ce n'est que 20 ans plus tard (1998) que le premier Le médicament thérapeutique à base d'ON, le fomiversen, a été approuvé. En 2016, seuls deux médicaments supplémentaires (pegaptanib et mipomersen) avaient été approuvés (tableau 3), mais depuis lors, le rythme de développement des médicaments à base d'ON s'est accéléré avec 11 médicaments à base d'ON actuellement approuvés (Aartsma-Rus & Corey, 2020). Pourtant, nombre de ces médicaments présentent une efficacité limitée (eteplirsen, golodirsen, viltolersen), et les médicaments les plus efficaces profitent de l'administration locale (nusinersen). Cependant, la conjugaison GalNAc et la technologie LNP représentent des percées dans l'administration qui ont complètement changé la perspective des thérapies ciblant les hépatocytes : d'un seul coup, ce tissu est désormais accessible pour un traitement avec des ON. Ces exemples de la façon dont les technologies d'administration peuvent être utilisées pour surmonter les obstacles à l'administration ont donné à l'ensemble du domaine un nouvel élan qui accélérera les découvertes pour le ciblage des tissus au-delà du foie.

La conception et la fabrication de systèmes de livraison efficaces ne sont pas le seul obstacle : la sécurité de ceux-ci et leur combinaison avec les ON sont également primordiales. Tester l'innocuité de l'ON n'a pas été facile, principalement parce que beaucoup de ces médicaments ont été développés pour traiter des maladies rares. Cela implique une abondance de modèles précliniques mais des données cliniques limitées. S'agissant d'une toute nouvelle classe de médicaments, les parties prenantes craignent de manquer une étape du développement. Une exception frappante à cela est les récentes études cliniques n-of-one : le développement de milasen (Kim et al, 2019 ) a été réalisé en un temps record, mais il a fallu un pari haut risque/haute récompense, en s'appuyant sur la sécurité de l'administration informatique d'une chimie déjà approuvée pour nusinersen.

Les résultats de l'essai clinique en cours (NCT04023552 testant l'APO(a)-LRx, un ASO conjugué à GalNAc3) pour la réduction de la lipoprotéine (a) dans les maladies cardiovasculaires pourraient constituer un bond en avant dans l'application clinique des ON thérapeutiques. Cet essai comprend 7 680 patients et le grand ensemble de données qui sera généré est dû au changement dans le paysage de ces médicaments. D'ici là, de nombreuses nouvelles technologies d'administration pourraient avoir été développées avec succès pour d'autres cibles, faisant de cette décennie l'ère de la thérapie ON.


Résumé

Les thérapies à base d'acides nucléiques qui régulent l'expression des gènes ont été développées vers une utilisation clinique à un rythme soutenu depuis plusieurs décennies, mais ces dernières années, le domaine s'est accéléré. À ce jour, il existe 11 produits commercialisés à base d'oligonucléotides antisens, d'aptamères et de petits ARN interférents, et de nombreux autres sont en préparation pour le monde universitaire et l'industrie. Un déclencheur technologique majeur pour ce développement a été les progrès de la chimie des oligonucléotides pour améliorer les propriétés des médicaments et réduire le coût des marchandises, mais le principal obstacle à l'application à un plus large éventail de troubles est l'administration aux tissus cibles. L'adoption de technologies d'administration, telles que les conjugués ou les nanoparticules, a changé la donne pour de nombreuses indications thérapeutiques, mais beaucoup d'autres attendent toujours leur moment eurêka. Ici, nous couvrons la variété des méthodes développées pour fournir des thérapies à base d'acides nucléiques à travers les barrières biologiques et les systèmes modèles utilisés pour les tester. Nous discutons des considérations de sécurité importantes et des exigences réglementaires pour les chimies d'oligonucléotides synthétiques et les obstacles pour traduire les percées de laboratoire à la clinique. Les progrès récents dans la fourniture de thérapies à base d'acides nucléiques et dans le développement de systèmes modèles, ainsi que les considérations de sécurité et les exigences réglementaires pour les chimies d'oligonucléotides synthétiques sont discutés dans cette revue sur les thérapies à base d'oligonucléotides.

Glossaire

Introduction

Les oligonucléotides synthétiques (ON) sont de petits morceaux simple ou double brin d'acides nucléiques modifiés qui ont été exploités comme modalités thérapeutiques de différentes manières (tableau 1). La caractéristique unique des ON est qu'elles se lient à leur cible via un appariement de bases Watson-Crick, permettant une intervention au niveau génétique en ciblant l'ARN d'une manière spécifique (Zamecnik & Stephenson, 1978). Les ON englobent de nombreux types de thérapies à base d'acides nucléiques, y compris les oligonucléotides antisens (ASO), les petits ARN interférents (siARN), les anti-miARN (antagomirs), les miARN (agomirs), les aptamères et les ON contenant des CpG non méthylés. Selon leur mécanisme d'action, le traitement avec des acides nucléiques thérapeutiques peut entraîner une diminution, une augmentation ou une restauration de l'expression des protéines. Actuellement, 11 médicaments à base d'ON dans de nombreux domaines pathologiques ont reçu l'approbation réglementaire de la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, de l'Agence européenne des médicaments (EMA) et/ou du ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être. Cependant, le développement thérapeutique ultérieur est remis en cause par des propriétés défavorables d'absorption, de distribution, de métabolisme, d'excrétion et de toxicité (ADMET) pour la plupart des applications cliniques (Godfrey et al, 2017). Cette revue se concentre principalement sur le développement d'ON simple brin et couvre (i) les nombreuses méthodes développées à ce jour pour délivrer des ON à travers les barrières biologiques, (ii) les systèmes modèles utilisés pour tester les ON et (iii) les obstacles existants pour la traduction en laboratoire percées à la clinique. Le contenu représente les efforts conjoints des membres du réseau européen de coopération scientifique et technologique (COST) Livraison de RNA Therapeutics (DARTER, COST Action 17103, www.antisenserna.eu), qui vise à permettre aux médicaments à base d'acides nucléiques ciblant l'ARN d'atteindre leur plein potentiel.

Modalité Mécanisme Exemples)
RNase H Clivage médié par la RNase H du transcrit cible Gappers
Blocage stérique Interférence avec les éléments de liaison à l'ARN post-transcriptionnels, par exemple. modulation de l'épissage et blocage des miARN endogènes ASO et antagomirs de 2e et 3e génération
Liaison protéique Lier les protéines cibles d'une manière spécifique à la structure Aptamer
L'immunité innée Inhibe l'expression des protéines via la dégradation de l'ARNm spécifique à la cible ONs non méthylés contenant du CpG
ARNi Inhibition de l'expression des gènes via la dégradation de l'ARNm spécifique à la cible siARN, microARN

La chimie dicte les propriétés médicamenteuses des oligonucléotides

Les acides nucléiques thérapeutiques sont modifiés chimiquement de plusieurs manières pour leur conférer des propriétés telles qu'une résistance accrue aux nucléases et une meilleure affinité de liaison à la cible (Jarver et al, 2014) (figure 1). Chaque modification confère à l'ON des propriétés différentes, et certaines peuvent être combinées, mais d'autres modifications ne sont pas compatibles ou peuvent modifier l'ON d'une manière qui complique leur synthèse ou interfère avec les mécanismes par lesquels elles exercent leur effet. Les chimies de première génération comprennent les modifications du squelette phosphate largement utilisées, par exemple. phosphorothioate (PS), qui confère une résistance aux endonucléases et améliore la biodisponibilité en réduisant la clairance rénale en raison d'une affinité accrue pour les protéines sériques (Eckstein, 2014). Cependant, cette modification réduit également l'affinité pour l'ARN cible. Les chimies de deuxième génération incluent des modifications du ribose au niveau 2′-O position de l'ARN et position 2′ de l'ADN, dont le 2ʹ-O-méthyle (2ʹ-OMoi), 2ʹ-OLes modifications -méthoxy-éthyle (2'-MOE) et 2'-fluoro (2'-F) sont les types les plus couramment utilisés. Ces modifications augmentent l'affinité de liaison à l'ARN et améliorent encore la résistance aux nucléases. Une chimie d'affinité de liaison encore plus grande est constituée par les analogues d'ADN contraints par la conformation, l'acide nucléique verrouillé (LNA) et le tricyclo-ADN (tcDNA). LNA contient un pont méthyle entre le 2′-O et 4′ position de l'anneau ribose (Koshkin et al, 1998 Obika et al, 1998). Le squelette a considérablement changé pour l'ADNtc via l'introduction d'un pont éthylène avec un cycle cyclopropane entre les positions du carbone 3' et 5' du ribose (Renneberg & Leumann, 2002). Le pont impose une conformation verrouillée sur l'anneau ribose, ce qui est idéal pour se lier à l'ARN. Toutes les chimies de première et de deuxième génération sont compatibles avec la synthèse d'acide nucléique et peuvent facilement être mélangées avec de l'ADN et de l'ARN dans les chimères ON. Les chimies de troisième génération incluent des changements dans la nucléobase, par exemple. oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO) (Summerton & Weller, 1997 ) et acide nucléique peptidique (PNA) (Nielsen et al, 1991 Hanvey et al, 1992). Pour les PMO, le squelette d'acide nucléique a été remplacé par un cycle morpholino à 6 chaînons et des liaisons phosphorodiamidate, tout en conservant les bases nucléiques standard. Les nucléobases des PNA sont liées par des liaisons amides, qui sont synthétisées de la même manière que les peptides. Le PMO et le PNA sont tous deux non chargés, très résistants aux nucléases et présentent une affinité variable pour l'ARN cible (Smulevitch et al, 1996 Summerton et Weller, 1997). Le choix des modifications chimiques est largement dicté par la modalité et le tissu cible.

Figure 1. Chimies des oligonucléotides

Chimies d'acides nucléiques couramment utilisées. Le squelette phosphorothioate (PS) souvent utilisé remplace le phosphodiester naturel (PO). Modifications du ribose au 2ʹ-O la position de l'ARN et la position 2ʹ de l'ADN comprennent la position 2ʹ-O-méthyle (2ʹ-OMoi), 2ʹ-O-méthoxy-éthyle (2'-MOE) et 2'-fluoro (2'-F) sont les plus couramment utilisés. Les analogues d'ADN contraints par la conformation, l'acide nucléique verrouillé (LNA), le 2′-O-éthyle (cEt) et le tricyclo-ADN (tcDNA) contraints, offrent une plus grande affinité de liaison. LNA et cEt sont contraints par un méthyle ponté à partir des positions 2'-0 et 4' du ribose. L'ADNtc introduit un pont éthylène avec un cycle cyclopropane entre les positions carbonées 3' et 5' du ribose. Les chimies alternatives incluent des changements dans la nucléobase, par exemple. oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO) et acide nucléique peptidique (PNA).

Les ASO simple brin complémentaires à l'ARN cible ont d'abord été utilisés à des fins thérapeutiques en exploitant le clivage par la RNase H d'hybrides ADN/ARN (Stein & Hausen, 1969 Wu et al, 2004 ) (figure 2). Les ASO inductibles par la RNase H sont conçus comme des gapmers, où les nucléotides d'ADN centraux sont flanqués de nucléotides modifiés résistants à la RNase H (Wahlestedt et al, 2000). Les séquences modifiées améliorent l'affinité de la cible tandis que la séquence d'ADN centrale forme l'hybride ADN/ARN pour la reconnaissance et le clivage de la RNase H (Monia et al, 1993). Les chimies ASO de deuxième et troisième générations entièrement modifiées agissent par des mécanismes indépendants de la RNase H (Fig 2) (Jarver et al, 2014). Les ASO bloquants stériques peuvent inhiber ou activer la traduction par la liaison aux éléments régulateurs, e.g. cadres de lecture ouverts en amont (Liang et al, 2016b Liang et al, 2017). Une modalité thérapeutique courante est la modulation de l'épissage pré-ARNm (Arechavala-Gomeza et al, 2014), qui est utilisé pour induire ou supprimer l'inclusion d'exons. Chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), le saut d'exon induit par l'ASO du pré-ARNm de la dystrophine mutée restaure le cadre de lecture et permet la production de la protéine dystrophine partiellement fonctionnelle plutôt que non fonctionnelle (Mitrpant et al, 2009). En revanche, pour les patients atteints d'amyotrophie spinale (SMA), les ASO augmentent le niveau d'inclusion de l'exon 7 dans le motoneurone de survie 2 (SMN2) ARNm, conduisant à des niveaux accrus de protéine SMN (Singh et al, 2006). De même, les ASO peuvent également induire le saut de pseudoexons (Collin et al, 2012 ) ou empêcher les facteurs d'épissage de l'ARN de reconnaître les sites d'épissage cryptiques (Rivera-Barahona et al, 2015). Les ASO peuvent également bloquer stériquement l'union des facteurs de liaison à l'ARN pour répéter les régions d'expansion des ARNm pathogènes (Fig 2). Dans la dystrophie myotonique 1, les répétitions microsatellites expansées séquestrent les facteurs de liaison à l'ARN au sein des foyers d'ARN d'expansion nucléaire (Miller et al, 2000). Les ASO ciblant l'ARNm d'expansion répétée CUG libèrent les facteurs de liaison à l'ARN séquestrés et inversent le phénotype (Klein et al, 2019). Thérapies basées sur l'interférence ARN (ARNi), c'est à dire. siARN double brin et microARN simple brin (miARN), exploitent la voie ARNi endogène dans le cytosol (Fire et al, 1998) pour faire taire ou moduler l'expression de protéines spécifiques (Fig 2). Les modifications chimiques couramment utilisées pour les siRNA, y compris les modifications 2ʹ-OMe et 2ʹ-F, diminuent la reconnaissance de la RNase et sont bien tolérées dans tout le duplex siRNA (Watts et al, 2008). De plus, ces modifications sont largement utilisées pour diminuer la stimulation immunitaire (juge et al, 2006). Les ASO peuvent influencer la fonction des miARN, soit en séquestrant un miARN (antagomir) soit en générant un miARN (agomir). Notamment, un seul miARN régule généralement l'expression de plusieurs gènes dans une voie donnée, par conséquent, les antagomirs et les agomirs ont le potentiel de médier respectivement l'augmentation ou la diminution de l'expression de plusieurs gènes (Friedman et al, 2009). Enfin, deux types d'ON qui ne fonctionnent pas via l'appariement de bases Watson-Crick sont les aptamères et les ON contenant du CpG non méthylé. Les aptamères sont des ON monocaténaires (20 à 100 nucléotides) sélectionnés dans des bibliothèques randomisées en fonction de leur forte avidité de liaison à des cibles spécifiques (Ellington & Szostak, 1990 Tuerk & Gold, 1990). Ils adoptent des structures tridimensionnelles qui se lient aux sites cibles des protéines par le biais d'interactions électrostatiques attractives et de structures en forme de poche (Ellington & Szostak, 1990), et ils présentent des affinités de liaison à leurs cibles de récepteur qui sont comparables à celles des anticorps monoclonaux (Jayasena, 1999 ). Les ON non méthylées contenant des CpG comprennent un motif cytosine-guanine couplé à un squelette phosphodiester (PO) ou PS. Les motifs CpG non méthylés sont couramment trouvés dans l'ADN bactérien et activent le système immunitaire via le récepteur de type Toll 9 (TLR9). Les ON non méthylées contenant des CpG ont été testées cliniquement comme adjuvants de vaccins et pour l'immunothérapie anticancéreuse (Krieg & Davis, 2001 Krieg, 2006 , 2007 ).

Figure 2. Mécanismes et lieu d'action des oligonucléotides

Mécanismes d'action représentatifs et localisation intracellulaire pour (1) la dégradation du gapmer et de l'ARNm, (2) l'aptamère, (3) le blocage stérique nucléaire pour la commutation d'épissage, (4) le blocage de l'assemblage des facteurs de liaison à l'ARN, (5) l'activation du TLR immunité, (6) miARN et antagomir, bloc stérique, régulation positive de la traduction, (7) agomir, inhibition de la traduction et (8) siARN, RISC, ARNi silencieux ONs.

Systèmes d'administration d'oligonucléotides

Les sites d'action des ON se trouvent dans l'espace intracellulaire. Par conséquent, ils doivent surmonter plusieurs barrières biologiques pour atteindre leurs cibles pharmacologiques. in vivo. Les ON modifiées par PS se lient de manière réversible aux protéines plasmatiques, par exemple. l'albumine, ce qui augmente leur demi-vie plasmatique et facilite leur distribution et leur accumulation dans le foie, les reins, la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse (Geary, 2009). Le ciblage des tissus au-delà de ces organes a connu un succès clinique pour l'administration locale à l'œil, au cerveau et à la moelle épinière via l'administration intravitréenne (IVT) et intrathécale (IT), respectivement (Hache et al, 2016 Cidécien et al, 2019 ) (figure 3). Les deux voies contournent la clairance rénale et maintiennent une exposition élevée à l'ON au microenvironnement cellulaire pour une absorption efficace. De plus, des avancées significatives pour l'administration pulmonaire de thérapies à l'ARN ont été largement examinées ailleurs (Chow et al, 2020 Shaffer, 2020). Cependant, l'administration systémique d'ON a eu moins de succès en raison d'une mauvaise absorption tissulaire. L'absorption cellulaire des ON se produit principalement via différents types d'endocytose. Les ON sont ensuite trafiqués dans le système endolysosomal, d'où ils doivent s'échapper pour éviter la dégradation dans l'environnement lysosomal (Crooke et al, 2017). Seule une très faible fraction de dose d'ON s'échappe des endosomes et devient disponible au site d'action (Gilleron et al, 2013). Les ON simple brin, tels que les PS ASO, qui sont relativement petits, non chargés et/ou hydrophobes, peuvent pénétrer de manière productive dans les cellules et échapper aux endosomes dans le cytoplasme et le noyau sans avoir besoin d'un agent de délivrance (Liang et al, 2016a ) dans un processus appelé gymnosis (Stein et al, 2010 ), mais des doses d'ON relativement élevées sont nécessaires pour que ce processus ait lieu. Cependant, la plupart des thérapies à base d'ARN, par exemple. les siARN double brin sont trop gros et chargés pour pénétrer dans les cellules sans assistance et nécessitent un agent de délivrance. L'accélération du taux d'absorption cellulaire, du trafic intracellulaire et de l'échappement endosomal a été une force motrice derrière les progrès de nombreuses modifications chimiques et agents d'administration (Juliano et al, Biscans 2018 et al, 2020). Une grande variété d'approches de livraison améliorent le transport et la biodisponibilité des ON (Fig 4) (Roberts et al, 2020). Celles-ci incluent (i) la conjugaison directe aux porteurs et (ii) l'incorporation dans des porteurs nanoparticulaires, toutes deux dans le but d'améliorer les propriétés ADMET.

Figure 3. Livraison d'oligonucléotides au cerveau et à l'œil

(A) Les ON sont empêchés de diffusion passive dans le système nerveux central (SNC) par la BHE vasculaire. (B) Les ON sans réactif d'administration nécessitent une administration directe dans le cerveau ou la moelle épinière. La voie d'administration du SNC la plus fréquemment utilisée chez l'homme est l'administration intrathécale (IT), où les ON sont administrées dans l'espace sous-arachnoïdien de la moelle épinière pour passer la pie-mère et pénétrer dans le parenchyme. Il en résulte une concentration élevée immédiate d'ON dans le liquide céphalo-rachidien, ce qui signifie qu'une dose plus faible peut être utilisée, ce qui réduit les effets secondaires. De plus, la BHE empêche le transport des ON dans la circulation périphérique, ce qui entraîne des concentrations élevées de ON de longue durée. (C) L'œil est un organe du SNC contenu et privilégié sur le plan immunitaire qui permet l'administration locale. Les ON sont efficaces et bien tolérées lorsqu'elles sont administrées directement par injection intravitréenne. L'accouchement sous-rétinien est également possible, mais la zone traitée sera réduite. (D) Certaines macromolécules peuvent traverser les barrières vasculaires via une endocytose médiée par des récepteurs après administration systémique (Pardridge, 2007). La voie de transport de la transferrine a été exploitée dans plusieurs études chez les rongeurs pour transporter les ON dans le parenchyme cérébral (Lee et al, 2002 Kozlu et al, 2014). Il a été démontré que les ONs délivrés de manière systémique conjugués de manière covalente à des CPP riches en arginine traversent la BHE chez la souris (Du et al, 2011 ) et ont été utilisés pour l'administration ON dans des modèles murins de SMA (Hammond et al, 2016). Plusieurs études ont montré la livraison à médiation exosomale de petits ARN à travers les barrières vasculaires dans le SNC (Alvarez-Erviti et al, 2011 Yang et al, 2017). (E) Les médicaments administrés par voie intranasale peuvent être transportés dans le cerveau le long du flux migratoire olfactif, trijumeau et rostral (Curtis et al, 2007 ).

Figure 4. Technologies de livraison pour les oligonucléotides

Technologies de livraison utilisées pour améliorer les propriétés ADMET des ON, y compris les conjugués chimiques (à gauche) et les transporteurs nanoparticulaires (à droite). Les polymères, les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) et les lipides représentent des exemples de molécules utilisées pour la conjugaison covalente aux ON pour le ciblage passif, tandis que la conjugaison covalente des ON aux anticorps, aux ligands récepteurs et aux aptamères est appliquée pour le ciblage actif. Les conjugués médicamenteux présentent une stœchiométrie définie. La conjugaison CPP n'est compatible qu'avec les ON non chargés, par exemple. Les PMO et les PNA, tandis que les lipides et le GalNAc sont compatibles avec tous les types d'ON. Les supports nanoparticulaires peuvent être utilisés pour encapsuler des ON chargés négativement et peuvent être basés sur des lipides, par exemple. nanoparticules lipidiques (LNP) et exosomes, polymères, par exemple. dendrimères, poly(lactide-co-acide glycolique) (PLGA) et polyphosphazènes, et peptides, ou sur des systèmes hybrides composés de plusieurs types de composés différents. La complexité de ces systèmes pose de nouveaux défis dans le développement en ce qui concerne le coût, la fabricabilité, la sécurité, l'assurance qualité et le contrôle qualité.

Conjugués chimiques

La conjugaison chimique de molécules à des ON thérapeutiques est une stratégie intéressante pour améliorer les propriétés d'ADMET. En tant que conjugués chimiques, les ON sont exposés au sérum et, par conséquent, une modification chimique complète des ON est nécessaire pour les protéger de la dégradation. Les polymères, les peptides, les lipides, les ligands des récepteurs et les aptamères représentent des exemples de molécules utilisées pour la conjugaison (Fig 4).

Polymères

La conjugaison covalente du polyéthylène glycol (PEG) améliore les propriétés ADMET des médicaments. La PEGylation a été appliquée principalement pour les protéines thérapeutiques, mais plus récemment aussi pour les ONs, par exemple. le conjugué aptamère-PEG commercialisé pegaptanib dirigé contre le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) (Ng et al, 2006). Le PEG est un polymère hautement flexible, non chargé et hydrophile avec des groupes terminaux disponibles pour la fonctionnalisation. Le PEG protège la cargaison de médicament conjugué via la formation d'une enveloppe d'hydratation, qui empêche stériquement d'autres biomacromolécules de se lier au médicament. De plus, la PEGylation prolonge le temps de circulation en réduisant l'excrétion rénale et en augmentant la stabilité ON. Les propriétés ADMET des ON PEGylées dépendent des propriétés physico-chimiques de la fraction PEG, y compris le poids moléculaire, le type de modification du groupe terminal et l'architecture du PEG (linéaire ou ramifié). Par exemple, le pegaptanib contient un PEG en forme de Y de 40 kDa, ce qui entraîne une diminution de quatre fois l'affinité de liaison de l'aptamère par rapport à l'aptamère parent, tandis que l'efficacité antiangiogénique est augmentée, ce qui est attribué à un temps de résidence tissulaire prolongé en raison d'une demi-vie accrue ( Ng et al, 2006 ).

Peptides

Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont de courts peptides cationiques et/ou amphipathiques, généralement moins de 30 acides aminés, capables de déplacer différents types de cargaisons à travers les barrières biologiques et les membranes cellulaires (Foged & Nielsen, 2008 Pooga & Langel, 2015 Lehto et al, 2016). Les CPP peuvent être utilisés comme conjugués directs ou pour encapsuler des oligonucléotides dans des nanoparticules, ce qui est discuté plus en détail dans la section suivante. Une fois à l'intérieur des cellules, les CPP peuvent également améliorer l'échappement endosomal (Cleal et al, 2013). Cependant, la charge cationique restreint souvent leur conjugaison covalente aux chimies ON neutres en charge (PNA et PMO) en raison des interactions électrostatiques entre les ON anioniques et les CPP cationiques qui entraînent une agrégation. Pour les maladies systémiques, les CPP-ON contournent les récepteurs spécifiques des cellules, permettant une activité pharmacologique dans plusieurs tissus, et ils ont été développés pour être absorbés dans des tissus particulièrement imperméables, par exemple. muscle squelettique, cœur et SNC (Hammond et al, Paris 2016 et al, 2019 ), ainsi que le ciblage des infections virales et bactériennes (Burrer et al, 2007 Geller et al, 2013 Geller et al, 2018). Au moment de cette revue, un essai clinique de phase I pour l'innocuité et la tolérabilité d'un conjugué CPP-ASO riche en arginine pour la DMD (SRP-5051) est terminé et une phase II est en cours de recrutement pour déterminer la dose optimale.

Lipides

La conjugaison de composés hydrophobes tels que le cholestérol aux ON peut améliorer l'administration in vitro en favorisant la libération endosomale (Wang et al, 2019 ) et entraîne une demi-vie plasmatique plus longue et une accumulation dans le foie lors de l'administration systémique (Osborn et al, 2019). De telles modifications peuvent améliorer l'administration, principalement au foie, mais aussi aux tissus périphériques tels que les muscles (Prakash et al, 2019 ), via un ciblage passif en augmentant l'affinité de liaison des ON aux protéines plasmatiques et/ou via un ciblage actif en détournant les voies de transport des lipides endogènes (Osborn et al, 2019 ).

Ligands récepteurs

Le ciblage actif tissu-spécifique peut être réalisé par la conjugaison d'ON à des ligands de récepteur qui facilitent la liaison spécifique aux récepteurs sur les cellules cibles et assurent la médiation de l'administration tissu-spécifique. Une grande variété de ligands récepteurs a été étudiée, y compris les glucides, les peptides/protéines, les aptamères, les anticorps/fragments d'anticorps et les petites molécules), et plusieurs systèmes récepteur-ligand réalisables ont été identifiés.

Le ligand de ciblage tissulaire le plus efficace est peut-être la N-acétyl galactosamine trimérique (GalNAc) (Lee et al, 1984). GalNAc se lie au récepteur des asialoglycoprotéines (AGPR), qui est abondamment exprimé dans le foie (Schwartz et al, 1980). Ce ligand de liaison à haute affinité a été directement conjugué aux ON et aux siARN et fournit une administration hautement spécifique et efficace aux hépatocytes (Matsuda et al, 2015 Janas et al, Debacker 2018 et al, 2020). Un autre exemple frappant est le système de récepteur (GLPR1) du glucagon-like peptide-1 (GLP1) pour le ciblage spécifique des cellules β pancréatiques (Muller et al, 2019). Des études récentes ont montré que les conjugués GLP1-ON sont spécifiquement absorbés par les cellules exprimant GLPR1 dans le pancréas, y compris les îlots pancréatiques isolés, et induisent une forte accumulation et activité dans les cellules pancréatiques β d'une manière dépendante du ligand lors de l'administration systémique chez la souris (Ammala et al, 2018 ).

Anticorps

Un développement récent prometteur dans les conjugués chimiques est celui des conjugués anticorps-ARN (ARC). Les ARC comprennent généralement des anticorps monoclonaux, ou des fragments d'anticorps, avec des ON fonctionnels, et ils ont été utilisés pour l'imagerie et la détection de protéines. Cependant, les anticorps peuvent également être utilisés comme agent d'administration pour les ON thérapeutiques. Un fragment d'anticorps spécifique du récepteur de la transferrine, qui est impliqué dans le transport intracellulaire de la transferrine chargée de fer, a été utilisé pour cibler les siRNA vers les tissus musculaires squelettiques et cardiaques (Sugo et al, 2016). Les entreprises font progresser cette technologie pour des maladies telles que la dystrophie myotonique et la maladie musculaire de Duchenne.

Aptamères

Il a été démontré que les aptamères médient l'administration d'ON thérapeutiques sous forme de conjugués aptamère-ON ou dans des formulations de nanoparticules (Catuogno et al, 2016 Soldevilla et al, 2018). Les premières chimères aptamère-siARN ciblaient les cellules cancéreuses exprimant l'antigène membranaire spécifique de la prostate pour délivrer des siARN induisant l'apoptose (McNamara et al, 2006). Le développement ultérieur des aptamères-ON a impliqué des modifications chimiques pour protéger les ON de la dégradation des nucléases et augmenter leur demi-vie plasmatique. Les Aptamer-ON se sont depuis montrés efficaces in vivo livraison de miARN, d'antagomirs, d'ASO et de miARN-antagomirs bimodulaires dans des modèles précliniques de cancer (Catuogno et al, 2015 Esposito et al, 2016 Soldevilla et al, 2018 ).

Systèmes de livraison basés sur les transporteurs

Les propriétés pharmacologiques des systèmes de livraison basés sur des transporteurs sont largement indépendantes des propriétés physico-chimiques de la cargaison ON et dépendent plutôt des propriétés du système de livraison. Par conséquent, les propriétés souhaitées peuvent y être intégrées via la conception de la formulation, résultant en des systèmes d'administration de médicaments avancés multifonctionnels. Ces systèmes de livraison peuvent servir (souvent simultanément) à de nombreux objectifs différents, notamment (i) protéger la cargaison ON d'une dégradation prématurée, (ii) augmenter la durée de l'effet et (iii) améliorer le ciblage. Ce ciblage amélioré peut se produire via un ciblage passif ou actif. Le ciblage passif exploite les caractéristiques microanatomiques des tissus, par exemple, les tissus avec une perméabilité et une rétention améliorées, ou des tissus avec un épithélium discontinu/fenêtré. Pour le ciblage actif, les systèmes d'administration sont décorés avec des ligands de ciblage actifs. Les systèmes d'administration à base de transporteurs particulaires facilitent également l'administration intracellulaire en améliorant l'absorption cellulaire, le trafic intracellulaire et l'échappement endosomique. De cette manière, la dose atteignant les tissus non cibles et/ou les cibles toxicologiques peut être réduite, tandis que la dose atteignant la cible pharmacologique peut être augmentée. Le résultat net est un index thérapeutique médicamenteux amélioré. La complexité de ces systèmes conduit à de nouveaux défis dans le développement, par exemple en ce qui concerne le coût, la fabricabilité, la sécurité, l'assurance qualité et le contrôle qualité.

Reflétant l'immense intérêt pour l'administration d'ON thérapeutiques, une pléthore de types de nanosupports ont été étudiés à des fins d'administration, tels que les nanoparticules d'or (Ding et al, 2014 Morgane et al, 2019 ), silice mésoporeuse (Steinbacher & Landry, 2014 Cha et al, 2017 ) et d'autres nanosupports inorganiques (Malmsten, 2013 ). Pourtant, l'accent actuel semble être mis sur les systèmes d'administration à base de lipides, de polymères et de peptides et leurs hybrides, qui sont décrits plus en détail ci-dessous (Fig 4).

Systèmes d'administration à base de lipides

L'approbation récente du patisiran (tableau 3) (Suhr et al, 2015 ), ainsi que les améliorations de la fabricabilité apportées par l'introduction de la microfluidique, ont renforcé l'intérêt pour les systèmes d'administration à base de lipides auprès de la communauté scientifique et de l'industrie pharmaceutique. Le terme nanoparticules lipidiques (LNP) est utilisé de manière générique ci-dessous pour décrire les systèmes d'administration à base de lipides chargés en ON, car la complexité structurelle de la plupart des nanotransporteurs à base de lipides complique leur classification ultérieure en, par exemple, des liposomes et des nanoparticules lipidiques solides.

Les lipides cationiques piègent les ON via des interactions électrostatiques attractives (Felgner et al, 1987 ), et commercial très efficace in vitro les réactifs de transfection sont à base de lipides cationiques. Cependant, comme la toxicité systémique des lipides cationiques est souvent dose-limitante pour in vivo application, des lipides ionisables chargés positivement à faible pH, par exemple. lors de la fabrication du LNP, et typiquement neutres au pH physiologique, sont favorisés (Semple et al, 2001). Aujourd'hui, un grand nombre de lipides ionisables ont été développés couvrant un large éventail de structures différentes. Il s'agit, entre autres, des lipides (Akinc et al, 2008 Dong et al, 2014 ) et le lipide ionisable DLin-MC3-DMA (Jayaraman et al, 2012 ), qui est considéré comme l'étalon-or des lipides cationiques ionisables. En général, ils présentent des groupes de tête contenant des amines tertiaires, qui sont protonées dans des conditions acides et non chargées à pH neutre. Les queues lipidiques hydrophobes stabilisent la structure LNP pendant la formation et la formulation via des interactions hydrophobes.

Le patisiran cliniquement approuvé contient du DLin-MC3-DMA, des lipides auxiliaires (Kulkarni et al, 2019 ) et des siARN encapsulant des lipides PEG dirigés contre l'ARNm de la transthyrétine (TTR) (Adams et al, 2018). Le lipide PEG stabilise les LNP pendant la fabrication et le stockage, et il augmente la demi-vie de circulation. Cependant, les lipides PEG inhibent la transfection cellulaire, ils sont donc conçus pour diffuser rapidement à partir des LNP après administration IV (Chen et al, 2016). Les LNP ciblent passivement le foie (Shi et al, 2011 ), et la taille des LNP permet la livraison à travers l'endothélium fenêtré dans le foie aux hépatocytes sous-jacents (Chen et al, 2016). En outre, il a été démontré que le ciblage actif des hépatocytes se produit via l'adsorption de surface de l'apolipoprotéine E, qui cible les LNP vers le récepteur des lipoprotéines de basse densité internalisant exprimé sur les hépatocytes (Akinc et al, 2010 Chen et al, 2016). Après absorption cellulaire, l'échappement endosomal de l'ARNsi dans le cytosol peut être facilité par des interactions entre le lipide cationique ionisable re-protoné dans l'environnement endosomal acide et les lipides endogènes anioniques dans la membrane endosomale (Habrant et al, 2016 ).

Systèmes de distribution à base de polymères

Bien que moins avancés cliniquement, les systèmes à base de polymères sont également des supports intéressants pour l'administration d'ON, en grande partie en raison de la flexibilité chimique des polymères, en particulier des polymères synthétiques (Fig 4) (Freitag & Wagner, 2020). Les fonctionnalités de séquence de monomère et de groupe latéral/d'extrémité peuvent être modifiées. De plus, les nanosupports polymères présentent une intégrité structurelle et une stabilité élevées pendant le stockage.

Un polymère à haute biocompatibilité qui a été largement étudié et utilisé est le copolymère poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) (Rezvantalab et al, 2018). Pour les médicaments à petites molécules, une encapsulation hautement efficace dans des nanoparticules polymères peut être réalisée, par exemple. par synthèse à base de mini-émulsion, suivie de in situ polymérisation (Fuser et al, 2019). Cependant, en raison de leur charge négative, les ON anioniques ne peuvent pas être encapsulés en utilisant cette approche. Au lieu de cela, l'encapsulation peut être réalisée grâce à des interactions électrostatiques attrayantes entre les ON anioniques et les polymères polycationiques. Les dendrimères sont des polymères hyperramifiés, bien adaptés à cette fin car ils peuvent complexer de nombreuses molécules ON. Plusieurs polymères cationiques ont été utilisés, notamment la poly(amidoamine), la poly(propylèneimine) et la poly(L-lysine) [revue par (Mignani et al, 2019 )].

Parmi les polymères synthétiques, les polyphosphazènes se distinguent par leur haute biocompatibilité et leur flexibilité chimique, et ils ont été utilisés avec succès pour délivrer des ON thérapeutiques (Peng et al, 2016 Hsu et al, 2020). Les polyphosphazènes peuvent être adaptés pour présenter une réactivité aux stimuli (bio)chimiques externes (Teasdale, 2019), par exemple. pH local. Cela permet une libération ciblée de la cargaison sur le site d'action souhaité. En complément de l'utilisation de polymères synthétiques, il existe un intérêt de longue date pour l'utilisation de biopolymères naturels pour l'encapsulation ON. L'exemple le plus notable est l'utilisation du polycation chitosan, souvent en complexe avec un autre polymère anionique, par exemple. PLGA (Taetz et al, 2009 ) ou alginate (Lee & Mooney, 2012 ).

Récemment, il y a eu un intérêt significatif pour les nanoparticules hybrides lipide-polymère (Thanki et al, 2017). Ces hybrides combinent les propriétés souhaitables des deux types de nanoparticules, c'est-à-dire la stabilité sérique du système matriciel à base de PLGA avec la biocompatibilité et la capacité de charge élevée des ON dans les systèmes de délivrance basés sur les lipides cationiques.

Systèmes de distribution à base de peptides

Les CPP représentent un autre groupe de composés qui ont également été utilisés avec succès comme système d'administration de médicaments à base de porteurs (Lehto et al, 2016). Dans ce contexte, la formation de nanoparticules CPP/ON est entraînée par des interactions électrostatiques et hydrophobes entre les CPP cationiques et les ON anioniques. Par rapport aux CPP-ON directement conjugués, les vecteurs à base de peptides sont plus amphipathiques et portent généralement des modifications chimiques supplémentaires qui les rendent compatibles avec l'encapsulation des ON. Généralement, de telles modifications comprennent l'incorporation de diverses modifications hydrophobes, telles que des dérivés d'acides gras, aux séquences CPP, qui augmentent la stabilité de la formulation et améliorent leur absorption cellulaire et leur échappement endosomique. Divers types de CPP ont démontré un potentiel considérable pour l'administration d'ON dans un format à base de nanoparticules, y compris les dérivés peptidiques MPG et PepFect [examinés dans (Boisguerin et al, 2015 Lehto et al, 2016 )].

Systèmes de délivrance de complexation d'anticorps

Les anticorps sont une autre forme prometteuse de système d'administration de porteurs utilisés à la fois comme conjugués directs ou comme porteurs non conjugués. En tant que supports non conjugués, des anticorps ou des fragments d'anticorps ont été fusionnés avec un peptide d'avidine ou de protamine. Profitant du système naturel de complexation avidine-biotine, les molécules de fusion anticorps-avidine se lient aux ON biotinylés (Penichet et al, 1999). Le peptide protamine est un peptide de liaison à l'ARN chargé positivement, qui se lie à l'ARNsi et le condense en un complexe anticorps-ARNi (Song et al, 2005). Ce système a été utilisé pour lier des ARNsi cytotoxiques avec des anticorps ciblés sur les cellules cancéreuses Her2-positives (Yao et al, 2012). Comme tous les systèmes de complexation, ces deux systèmes ont l'avantage d'avoir un support d'anticorps spécifique à la cible établi, qui peut facilement être complexé avec n'importe quel ARNsi.

Systèmes modèles pour le développement d'oligonucléotides

Le développement réussi de médicaments à base d'ON dépend d'une connaissance détaillée des propriétés pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PD). Les analyses PK/PD décrivent la relation entre la PK (concentration de médicament dans l'organisme) et la PD (réponse biologique de l'organisme aux médicaments) d'une manière dépendante du temps (Negus & Banks, 2018). La modélisation et les simulations PK/PD sont utilisées pour caractériser rapidement l'efficacité et l'innocuité des médicaments, et les modèles de simulation PK/PD contenant in vitro et in vivo les études précliniques permettent d'anticiper les risques potentiels chez l'homme (Li et al, 2016). L'utilisation de systèmes de modèles prédictifs pour les analyses PK/PD permet d'économiser du temps, des coûts et de minimiser le besoin de in vivo études, facilitant la traduction du banc au chevet.

Méthodologies de test in vitro des oligonucléotides

In vitro des modèles peuvent être mis en œuvre pour tester l'activité pharmacologique, l'efficacité de la transfection, l'hépatotoxicité et la demi-vie intracellulaire. Cependant, il est généralement difficile de corréler in vitro résultats aux tests précliniques et cliniques in vivo résultats (tableau 2). De nouvelles technologies, telles que la reprogrammation de cellules dérivées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (Takahashi & Yamanaka, 2006 Takahashi et al, 2007 ) et les techniques d'édition du génome pour créer des lignées cellulaires isogéniques, ont révolutionné le domaine (Ran et al, 2013). Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D), y compris les organoïdes, sont utilisées pour améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques des maladies, ainsi que les études d'efficacité ON. Un exemple de traduction réussie d'un modèle 3D à un essai clinique est le sepofarsen pour le traitement de la maladie rétinienne héréditaire de Leber amaurose congénitale (LCA) (Collin et al, 2012 de Hollander et al, 2006). La combinaison d'organoïdes rétiniens dérivés de patients avec des études de toxicité chez des primates non humains (PNH) était suffisante pour lancer un essai clinique de phase I/II (NCT03140969, NCT03913143) (Cideciyan et al, 2019). L'œil est un organe cible exceptionnel, compte tenu de son statut isolé et privilégié du système immunitaire, qui permet de traduire les résultats des organoïdes en culture vers l'œil humain. Cependant, pour d'autres maladies (multi-)organiques, l'établissement de modèles cellulaires prédictifs pour imiter les fonctions d'organes entiers reste un défi.

In vivo In vitro Organoïdes 3D Organes sur puces
Tissu d'origine humaine Non Oui Oui Oui
Médecine personnalisée Non Oui Oui Oui
Microenvironnement réaliste Oui Non Oui Oui
Fonction au niveau de l'orgue Oui Limité Potentiellement/Limité Potentiellement
Lectures en temps réel Non Limité Limité Oui
Tests à haut débit Non Oui Limité Peut-être
Pharmacodynamique / -cinétique Oui Non Non/Limité Potentiellement

Une alternative intéressante aux techniques de culture tissulaire 2D et 3D est la technologie basée sur la microfluidique. orgue sur puce (van der Meer & van den Berg, 2012 ), qui consiste en des modèles dérivés d'iPSC de micro-ingénierie qui combinent les avantages des in vitro et in vivo des modèles. La technologie décompose les organes en composants les plus essentiels, y compris les barrières biologiques, pour l'administration de médicaments, l'efficacité, la toxicité et les études PK/PD. Les organes sur puce reproduisent l'interaction entre les cultures de plusieurs types de tissus à l'aide de canaux et de chambres microfluidiques (Huh et al, 2010 Kim et al, 2012 Westein et al, 2013). Cette interaction peut être surveillée en temps réel pour étudier la PK/PD d'un médicament spécifique ainsi que les interactions médicament-médicament (Lee et al, 2017 Shinha et al, 2020).Par exemple, l'évaluation PK/PD de la terfénadine (un type d'antihistaminique) a été réalisée en utilisant un modèle cellulaire combinant des cellules cardiaques et hépatiques dans deux chambres interconnectées. Ce modèle, combiné à des réseaux de microélectrodes, a également contribué à prédire la cardiotoxicité potentielle du médicament (McAleer et al, 2019). Il est intéressant de noter que les récentes études de perméabilité aux médicaments dans les modèles de barrière hémato-encéphalique (BHE) sur puce se sont révélées plus prédictives que les modèles existants. in vitro modèles (van der Helm et al, 2016). D'autres modèles cellulaires en cours de développement incluent la rétine sur puce (Achberger et al, Référencement 2019 et al, 2019 ) et poumon sur puce (Huh et al, 2010) modèles. Imiter la fonction d'organes entiers dans une boîte en combinant plusieurs types de cellules dans un seul appareil peut avoir un potentiel précieux pour le criblage et le développement de médicaments, ainsi que pour les études PK/PD et de toxicité. À l'avenir, les modèles d'organes sur puce pourraient, dans une certaine mesure, remplacer les modèles animaux expérimentaux.

Investigation des propriétés PK/PD in vivo

In vivo les modèles ont été largement utilisés pour les études de détermination de la dose. Les propriétés pharmacocinétiques sont largement comparables entre plusieurs espèces, notamment la souris, le rat, le PNH et l'homme (Yu et al, 2009 Geary et al, 2015). Par conséquent, les relations PK/PD entre espèces sont très précieuses pour la prédiction du dosage chez l'homme. Les modèles animaux ont été essentiels pour déterminer in vivo l'efficacité des ON, l'administration de tissus spécifiques et l'optimisation de la voie d'administration pour les maladies systémiques et neurologiques (Schoch & Miller, 2017 Buijsen et al, 2019). Préclinique in vivo des tests sur un modèle de souris transgénique pour la SMA ont prédit le bénéfice accru du traitement des stades pré-symptomatiques de la maladie, qui a ensuite été validé en clinique.

Cependant, une connaissance détaillée du modèle de la maladie est vitale pour l'interprétation des données : Une étude dans le mdx modèle de souris pour DMD de la PK/PD de 2ʹ-OLes Me ON pour la DMD ont révélé des niveaux d'ON plus élevés dans les fibres musculaires déficientes en dystrophine que dans les fibres saines, ainsi qu'une efficacité améliorée de saut d'exon (Heemskerk et al, 2010). Cependant, l'efficacité de l'ON était plus faible dans les essais cliniques chez les patients DMD, potentiellement en raison d'une meilleure capacité de régénération chez la souris. De plus, les modèles animaux peuvent ne pas toujours être réciproques de la condition humaine en raison du contexte génomique différent des mutations, même lors de l'utilisation de modèles animaux humanisés. Ceci est évident pour l'épissage pré-ARNm, qui est régulé différemment entre les tissus, les organes et les espèces (Rivera-Barahona et al, 2015). Entre les tissus, il a été observé que des variantes d'ADN affectent l'épissage pré-ARNm, ce qui complique l'interprétation de in vitro études. Un exemple est le changement profondément intronique sous-jacent à l'ACL : alors que les cellules lymphoblastoïdes et fibroblastes dérivées de patients suggèrent un effet hypomorphe (Garanto et al, 2016), des iPSC reprogrammées dérivées de patients différenciées vers un destin rétinien ont révélé que le pourcentage d'ARNm épissé de manière aberrante était fortement augmenté dans les cellules photoréceptrices, expliquant le phénotype rétinien observé chez les patients LCA (Parfitt et al, 2016). Des études de suivi ont révélé qu'un pseudoexon présent chez l'homme était différemment reconnu dans les lignées cellulaires dérivées d'autres espèces (Garanto et al, 2015). Ainsi, il faut être prudent lors de la sélection d'un système modèle pour évaluer les effets d'une certaine variante génétique, ainsi que pour le développement de thérapies de modulation d'épissage.

Évaluation de l'innocuité des thérapies à base d'oligonucléotides

Bien que de nouvelles chimies et technologies d'administration puissent conduire à une efficacité plus élevée, il est important de dépister les effets secondaires potentiels dans les premières phases du développement préclinique pour éviter un échec ultérieur. Les aspects toxicologiques des ON thérapeutiques ont été largement résumés précédemment (Andersson & den Besten, 2019). Le groupe de travail sur la sécurité des oligonucléotides (OSWG) a également publié des directives détaillées pour évaluer les divers aspects de la sécurité de l'ON. Notre compréhension de la toxicité induite par l'ON augmente à mesure que davantage de données précliniques et cliniques deviennent disponibles. Bien que le concept de toxicité de classe semble nuancé à la lumière des connaissances croissantes sur diverses chimies, les effets secondaires liés à l'ON relèvent toujours de deux catégories principales : (i) les effets dépendants de l'hybridation, y compris les effets sur et hors cible, et ( ii) effets indépendants de l'hybridation, principalement causés par les propriétés de liaison aux protéines (figure 5).

Figure 5. Toxicités médiées par l'ASO

Représentation schématique des toxicités médiées par ON les plus courantes, qui sont principalement classées comme effets dépendants de l'hybridation (hybridation Watson-Crick) ou indépendants de l'hybridation (accumulation tissulaire, mécanismes pro-inflammatoires et/ou effets de liaison aux protéines). Certains d'entre eux sont strictement spécifiques à la classe (indépendants de la séquence), tandis que d'autres peuvent être influencés par la séquence (spécifiques à la séquence).

Effets dépendants de l'hybridation

La sécurité sur cible, également appelée pharmacologie exagérée, concerne les toxicités possibles induites par une activité excessive ou prolongée de l'ON dans les organes cibles ou non cibles. Ces effets sont considérés comme rares et sont généralement découverts dans des études précliniques. Cependant, en raison de l'action spécifique à la séquence des médicaments à base d'ON, les séquences cibles peuvent ne pas être conservées d'une espèce à l'autre. Par conséquent, les séquences humaines pourraient ne pas montrer d'efficacité chez les rongeurs ou les PSN, par conséquent, des substituts spécifiques à l'espèce sont nécessaires pour l'évaluation des risques ciblée (Levin et Henry, 2008).

Les effets hors cible correspondent aux toxicités potentielles associées à l'hybridation de l'ON à des cibles d'ARN non souhaitées (complémentarité complète ou partielle). Ils ont augmenté avec le développement des chimies de haute affinité, par exemple. LNA, tcDNA et éthyle contraint (cEt), qui permettent l'utilisation de séquences beaucoup plus courtes. Les effets hors cible sont particulièrement préoccupants pour les gapmer ONs et siRNA, qui visent à réguler à la baisse leurs cibles, car ils pourraient réguler à la baisse l'expression de ceux qui ne le sont pas (Fedorov et al, 2006 Burel et al, 2016). Plusieurs études ont caractérisé les mécanismes associés aux effets hors cible et décrit des moyens élégants de réduire les risques et d'améliorer la conception de gapmers et d'ARNsi spécifiques (Hagedorn et al, 2017 Janas et al, 2018). En revanche, les ASO à commutation d'épissage doivent lier des éléments régulateurs d'épissage spécifiques pour être efficaces, et ils sont donc moins susceptibles d'induire des effets hors cible. Avec le développement d'ON plus stables et de systèmes d'administration efficaces, les administrations systémiques pourraient être distribuées dans les tissus cibles mais aussi non cibles. Par conséquent, les effets hors cible doivent être soigneusement évalués pendant le développement préclinique. Les lignes directrices publiées par l'OSWG pour évaluer les effets hors cible recommandent (i) in silico évaluation, (ii) interprétation de in silico hits utilisant des données auxiliaires (par exemple. expression dépendante du temps et de l'espace-temps de l'ARN hors cible) et (iii) in vivo évaluation des médicaments ON (Lindow et al, 2012 ).

Effets indépendants de l'hybridation

La plupart des toxicités médiées par ON ne sont pas causées par l'appariement des bases Watson-Crick à l'ARN, mais sont plutôt le résultat d'interactions ON-protéine et dépendent donc de la chimie et/ou du système de délivrance. Les ON monocaténaires modifiées par PS présentent des affinités de liaison aux protéines particulièrement élevées, et la majorité des effets indépendants de l'hybridation ont ainsi été rapportés pour cette classe d'ON, par opposition aux siRNA contenant moins de résidus PS modifiés.

Inhibition de la coagulation sanguine

L'inhibition de la voie intrinsèque de la coagulation sanguine est un effet secondaire bien documenté de la chimie du PS (Henry et al, 1997b Échevarria et al, 2019). Il est considéré comme un effet de classe, modulé par les interactions de l'ON avec les protéines plasmatiques de manière indépendante de la séquence. La modification PS prolonge sélectivement le temps de thromboplastine partielle à de faibles concentrations plasmatiques en inhibant le complexe ténase. Cependant, à des concentrations plasmatiques élevées, les voies intrinsèques et extrinsèques sont affectées, suggérant des effets inhibiteurs supplémentaires (Sheehan & Lan, 1998). L'allongement des temps de coagulation est corrélé à la concentration plasmatique maximale (Cmax) des ON circulantes, et il n'a pas été associé à des signes cliniques pertinents, car il peut être contrôlé par une réduction de la dose ou par l'allongement des temps de perfusion. Néanmoins, il devrait être inclus dans les études de dépistage, qui peuvent être réalisées à la fois in vivo et in vitro dans le sérum de souris, de PNH et humain, respectivement, puisque les résultats peuvent être extrapolés à travers les espèces (Andersson & den Besten, 2019 ).

Activation du complément

Il a été rapporté que l'administration systémique d'ON modifiées par PS active la voie alternative du complément en conséquence de la liaison aux protéines plasmatiques (Henry et al, 2002). Bien que cet effet indépendant de l'hybridation soit principalement lié à la chimie ON (effet de classe), une activation inattendue du complément a été observée avec une certaine spécificité de séquence, comme dans le cas de l'ADNtc (Aupy et al, 2020). L'activation de la voie alternative du complément a été étudiée de manière approfondie dans les modèles NHP, qui sont particulièrement sensibles (Henry et al, 2016). L'effet dépend de la concentration plasmatique et peut être contrôlé en augmentant le temps de perfusion IV pour réduire la Cmax.max. Il a été démontré que les ON modifiées par PS interagissent directement avec le facteur H plasmatique, qui est un régulateur négatif de la cascade du complément qui réduit les niveaux libres d'inhibiteur, permettant une amplification incontrôlée de la cascade et la libération de produits fractionnés tels que Bb et les anaphylotoxines C3a et C5a (Henri et al, 1997a). Le complément peut être activé de la même manière à chaque dose. Par conséquent, l'administration chronique d'ON toxiques peut entraîner une déplétion en C3, entraînant éventuellement une altération de la fonction du complément, une inflammation secondaire et une vascularite (Engelhardt et al, 2015 Shen et al, 2016 Andersson & den Besten, 2019 ). Bien que les humains semblent moins sensibles à l'activation du complément, il est recommandé d'évaluer systématiquement l'activation du complément dans les études d'innocuité précliniques de nouveaux candidats-médicaments ON dans les PSN.

L'activation du complément peut être évaluée in vitro dans les PNH ou le sérum humain, ou le sang total, pour mesurer les produits fractionnés de la voie alternative du complément (Bb, C3a et C5a). Néanmoins, il faut être prudent dans l'interprétation des résultats, car il est difficile d'extrapoler et de prédire les relations dose-réponse (Andersson & den Besten, 2019 ).

Immunostimulation

L'immunostimulation induite par l'ON est un effet secondaire complexe qui dépend de plusieurs aspects, dont la chimie et la séquence nucléotidique (Krieg, 1998 Agrawal & Kandimalla, 2004). Les ON peuvent activer le système immunitaire inné en se liant à des récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) tels que les récepteurs Toll-like (TLR). L'activation du système immunitaire inné par les ON contenant des CpG est comparable à celle observée pour l'ADN bactérien et les ON contenant des CpG sont utilisées pour les thérapies contre le cancer et les maladies auto-immunes ainsi que comme adjuvants vaccinaux (Krieg & Davis, 2001 Krieg, 2006 Kline & Krieg, 2008). Cependant, l'activité immunostimulante des ON conçues à des fins antisens constitue un effet secondaire potentiel. À cet égard, des ON modifiées avec des modifications 2ʹ-ribose, des résidus 5-méthyl cytosine ou sans motifs CpG, ont été conçues pour éviter l'activation de TLR9. Des études supplémentaires ont démontré que les ONs sans CpG et modifiées par PS peuvent également provoquer des réponses pro-inflammatoires, bien que le mécanisme moléculaire soit encore débattu (Vollmer et al, 2004 Senn et al, 2005 Younis et al, 2006). Il est à noter que les effets immunostimulants n'ont jamais été rapportés pour les ON à squelette neutre, par exemple. PMO (Zhang et al, 2015). Les rongeurs sont particulièrement sensibles à la stimulation immunitaire. Les souris traitées avec de fortes doses de PS-ON présentent des niveaux accrus de cytokines circulantes (IL-1b, IL-6, interféron, facteur de nécrose tumorale-α) et de chimiokines, ainsi qu'une prolifération de lymphocytes B (Monteith et al, 1997). Bien que généralement moins critiques, certaines réponses inflammatoires significatives, par exemple. vascularite, liée à l'activation du complément médiée par les PS-ON, ont été décrites dans des études sur les PSN (Levin & Henry, 2008 Engelhardt et al, 2015 Frazier, 2015 EMA, 2016 ). Les différences de réponse immunitaire entre les espèces ont été attribuées à la séquence différentielle, à l'expression et à la fonction des PRR codés dans la lignée germinale (Barchet et al, 2008 ).

Dans les essais cliniques, des effets indésirables inflammatoires peuvent se manifester par des symptômes pseudo-grippaux et des réactions au site d'injection après administration sous-cutanée (SC) (Rudin et al, 2001 Thomas et al, 2013 Voix et al, 2014). La compréhension des mécanismes sous-jacents de l'induction thérapeutique médiée par ON d'effets indésirables pro-inflammatoires a facilité la conception de séquences plus sûres et plus puissantes qui sont efficaces à des doses plus faibles. Néanmoins, certaines séquences présentent encore une toxicité inattendue et un dépistage spécifique des effets indésirables immunostimulants est recommandé. En plus de in vivo études chez les rongeurs et les PSN, une évaluation pro-inflammatoire est généralement effectuée in vitro utilisant des cellules mononucléées du sang périphérique humain ou du sang total (Apter et al, 1990 Lankveld et al, 2010 ).

Les formulations à base de nanoparticules administrées par voie IV peuvent également induire des réactions liées à la perfusion (IRR), par exemple. hypersensibilité, évidente sous forme de symptômes pseudo-grippaux et même d'anaphylaxie cardiaque (Szebeni, 2018). Par conséquent, avant la perfusion IV de patisiran, les patients doivent recevoir une prémédication avec des antihistaminiques IV (antihistaminiques H1/H2), des corticostéroïdes IV et de l'acétaminophène ou du paracétamol par voie orale pour supprimer les RIR. Des IRR légers à modérés ont été observés dans un essai de phase III sur le patisiran chez environ 20 % des patients, qui étaient tous prémédiqués, dont l'incidence a diminué au fil du temps (Adams et al, 2018). En revanche, une prémédication n'est pas nécessaire avant l'administration d'ON et de conjugués GalNAc-siRNA.

Thrombocytopénie

La thrombocytopénie associée à l'ON est un événement occasionnel qui a été observé chez les rongeurs et les PSN, ainsi que dans trois essais cliniques récents avec des PS-ON non apparentés [volanesorsen (FDA, 2018), inotersen (Benson et al, 2018 Mathew & Wang, 2019 ) et drisapersen (EMA, 2016 Goemans et al, 2016 )]. Les mécanismes sous-jacents exacts de la thrombocytopénie sont encore débattus et plusieurs mécanismes à médiation immunitaire et non immunitaire ont été proposés. L'activation directe des plaquettes par les PS-ON via la liaison aux récepteurs plaquettaires a été démontrée (Flierl et al, 2015 Couture et al, 2017). De plus, un mécanisme de type thrombocytopénie induit par l'héparine via l'induction d'anticorps IgG anti-facteur plaquettaire 4 a également été proposé, basé sur la liaison d'acides nucléiques au facteur plaquettaire 4 (Jaax et al, 2013 ), bien que des résultats contradictoires aient été rapportés. Une étude récente suggère que la séquestration des plaquettes dans le foie et la rate se produit par l'activation des monocytes, mais pas des plaquettes, et s'accompagne d'une augmentation des taux sériques d'IgM (Narayanan et al, 2018). Dans la plupart des cas, la thrombocytopénie après traitement par ON est légère à modérée et réversible. Le nombre de plaquettes ne descend pas en dessous de la limite normale pendant le traitement et se normalise après l'arrêt du traitement. Cependant, une baisse inquiétante et sévère (< 50 000 plaquettes/µl) a été observée dans les études sur les PSN après des doses répétées (Henry et al, 2017). À ce jour, aucune thrombocytopénie sévère n'a été signalée pour les médicaments à ARNsi, ni dans les études précliniques ni dans les essais cliniques, mais il a été démontré que l'encapsulation de l'ARNsi dans les LNP provoque une thrombocytopénie chez le rat, vraisemblablement induite par les molécules lipidiques cationiques elles-mêmes (Chi et al, 2017 ).

Organes à forte exposition

Après administration IV et indépendamment de la chimie, les concentrations les plus élevées d'ON se trouvent dans le foie et les reins, qui sont considérés comme des organes à forte exposition (Fig 5). Les toxicités observées dans ces organes ne sont pas nécessairement associées à l'accumulation d'ONs en soi mais peut aussi être due à des effets spécifiques à la séquence. Les ON accumulés sont souvent apparents sous forme de granules basophiles (ON dans les compartiments lysosomal) dans les coupes de tissus. Cependant, ces effets sont considérés comme non indésirables en raison de leur caractère réversible à l'arrêt du traitement. En revanche, des toxicités aiguës caractérisées par de vastes zones de nécrose, une élévation prononcée des taux d'enzymes hépatiques, une morbidité et une mortalité ont été rapportées pour certains gapmers de haute affinité après une ou quelques doses chez la souris (Hagedorn et al, 2013 Burdick et al, 2014). Les mécanismes sous-jacents à ces toxicités aiguës spécifiques à une séquence peuvent être l'accumulation de produits d'ARNm clivé par la RNase H et/ou des interactions protéiques (Burel et al, 2016 Couture et al, 2016 Shen et al, 2019). Alors que le dépistage de ces toxicités aiguës reposait auparavant sur in vivo études évaluant les taux d'enzymes hépatiques après administration IV chez les rongeurs, un nombre croissant de in silico (Hagedorn et al, 2013 Burdick et al, 2014) et in vitro modèles (Couture et al, 2016 Dieckmann et al, 2018 ) ont été établis.

Les lésions rénales sont généralement limitées aux tubules proximaux et n'apparaissent que chez les animaux traités avec des doses d'ON beaucoup plus élevées que les doses cliniquement pertinentes. Aucun dysfonctionnement rénal cliniquement significatif n'a été rapporté dans une grande étude rétrospective d'essais de gapmer 2ʹ-MOE (Crooke et al, 2018). La toxicité rénale était principalement considérée comme une toxicité liée à l'accumulation et principalement sans séquence spécifique jusqu'à ce que des lésions tubulaires plus aiguës soient signalées avec des ON de haute affinité, par exemple. LNA (Engelhardt et al, 2015). Au-delà des biomarqueurs classiques des lésions rénales, par exemple. augmentation de l'excrétion de la β2-microglobuline et de la molécule de lésion rénale-1, un test prédictif basé sur le facteur de croissance épidermique a récemment été développé pour exclure ce type de candidats néphrotoxiques (Moisan et al, 2017 ).

Produits thérapeutiques à base d'oligonucléotides approuvés

Les progrès de la technologie ON thérapeutique au cours des dernières décennies offrent une opportunité unique d'aborder des cibles médicamenteuses auparavant inaccessibles (Bennett et al, 2017). Depuis l'approbation du fomivirsen en 1998 par la FDA pour le traitement de la rétinite à cytomégalovirus (CMV) (Marwick, 1998), 11 médicaments à base d'ON ont reçu une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés chez l'homme, et deux autres médicaments à base d'ON ont reçu un avis favorable de commercialisation par l'EMA (tableau 3). Ici, nous discutons des thérapies ON approuvées en fonction de leurs modalités fonctionnelles.

Le fomivirsen (Vitravene) est un ON basé sur l'ADN PS 21-mer développé pour le traitement des patients atteints de rétinite à CMV, en particulier ceux atteints du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) (Étude Vitravene G, 2002). Cet ASO de première génération cible l'ARNm du gène majeur immédiat du CMV humain pour la dégradation de la RNAse H (Geary et al, 2002). Fomivirsen est délivré localement par l'administration IVT et ne nécessite donc pas d'agent de livraison. Alors qu'une séquence gapmer de deuxième génération basée sur la 2ʹ-MOE (ISS 13312) était en cours de développement clinique (Henry et al, 2001 ), Novartis a arrêté le développement et retiré la commercialisation (Wathion, 2002 ). Le nombre de cas de rétinite à CMV avait considérablement diminué en raison du développement d'un traitement antirétroviral hautement actif. Néanmoins, le fomivirsen a été un succès et a établi que les thérapies ON étaient viables pour le développement clinique.

5′-Cs^-As^-G^-A^-A^-A^-GF -A^-GF -U^-GF -U^-CF -U^-CF -A^-U^-C ^-U^-U^-A^-3′

3′-Us^-Gs^-G^-UF -C^-UF -U^-UF -C^-UF -C^-AF -C^-AF -G^-AF -G^-UF -A ^-GF -Comme F -Comme F -U^-5′

5′-As^-Cs^-C^-U^-G^-A^-A^-AF -G^-UF -A^-G^-G^-A^-CF -CF -U^- UF -U^-A^-Us^-As F -U^-3′

5′-As^-CF s-As^-AF -AF -AF -G^-CF -A^-AF -A^-A^-C^-AF -G^-GF -U^-CF -U ^-A^-Gs^-As^-A^-3′

  • s, liaison phosphorothioate *, 2′-MOE d, 2′-désoxy m, 5-méthyl F , 2′-F ^, 2′-OMe en italique, PMO † Approbation de Viltolarsen par le ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être, 25 mars 2020 ‡ Milasen approuvé par la FDA pour les essais cliniques uniquement, ¥, le lumasiran et l'inclisiran ont reçu un avis favorable pour la commercialisation par le CHMP.

Les ASO de deuxième génération RNase-dépendants ciblant le foie ont été approuvés pour la polyneuropathie de l'amylose héréditaire à médiation par la transthyrétine (ATTR) (inotersen) ainsi que le syndrome de chylomicronémie familiale (FCS), l'hypertriglycéridémie et la lipodystrophie partielle familiale (volanesorsen) et l'hypercholestérolémie familiale ( mipomersen). La maladie rare hATTR est liée à des mutations faux-sens dans le TTR gène, ce qui entraîne un mauvais repliement de la protéine TTR. La protéine TTR est sécrétée dans le sang et le liquide céphalo-rachidien, et l'accumulation de dépôts amyloïdes (à la fois de type sauvage et mutant) dans les tissus provoque une polyneuropathie, un dysfonctionnement de plusieurs organes et une cardiomyopathie. Inotersen cible l'expression hépatique de l'ARNm de TTR de type sauvage et mutant. Les patients traités par inotersen présentent une réduction des taux sériques de protéine TTR et une meilleure qualité de vie (Benson et al, 2018). Le volanesorsen, bien qu'en attente de l'approbation de la FDA au moment de la rédaction de cette revue, a obtenu l'approbation de l'EMA en mai 2019. En ciblant le 3ʹ UTR de l'ARNm de l'apolipoprotéine C3, le volanesorsen réduit les niveaux de triglycérides et d'apolipoprotéine C3, qui représentent deux facteurs de risque connus pour maladies cardiovasculaires, tout en augmentant les taux de cholestérol à lipoprotéines de basse et haute densité et d'apolipoprotéine B chez les patients atteints de FCS et d'hypertriglycéridémie (Graham et al, 2013 EMA, 2019 ). Mipomersen cible également l'apolipoprotéine B-100 pour réduire le cholestérol à lipoprotéines de basse densité circulant, qui constitue un autre facteur de risque majeur de maladie cardiovasculaire (Wong et Goldberg, 2014). Contrairement à l'inotersen et au volanesorsen, le mipomersen a reçu l'approbation de la FDA, mais l'autorisation de l'EMA a été refusée en raison de problèmes de sécurité liés à la toxicité hépatique et aux événements cardiovasculaires graves (EMA, 2012). Il a depuis été abandonné par la FDA et n'est disponible que via une stratégie d'évaluation et d'atténuation des risques restreinte. Les trois thérapies ON sont dosées par administration SC sans agent d'administration en raison de l'absorption naturelle des ON par le foie. En 2004, l'aptamère pegaptanib (Macugen) a été approuvé par la FDA pour la prévention de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (Ng et al, 2006). Le pegaptanib est un conjugué covalent d'un aptamère simple brin hautement modifié et de deux unités PEG de 20 kDa. Il se lie avec une spécificité et une affinité élevées à l'isoforme extracellulaire du VEGF 165 et bloque son activité néo-angiogénique (Ruckman et al, 1998). Les patients traités par pegaptanib ont présenté une perte de vision réduite par rapport aux témoins placebo (Gragoudas et al, 2004). Commun aux maladies dégénératives, un traitement précoce permet d'améliorer les résultats thérapeutiques (Gonzales CR & Group VISiONCT, 2005 ).

Plusieurs médicaments à base d'ON modifiant l'épissure sont approuvés pour traiter les troubles pédiatriques DMD et SMA, en se concentrant sur la modification de l'épissure et ciblent les tissus au-delà du foie. Le premier médicament approuvé, c'est à dire. eteplirsen (Exondys51), est un ASO de commutation d'épissure basé sur PMO qui interagit spécifiquement avec DMD exon 51, et est utilisé chez les patients DMD présentant des délétions de dystrophine susceptibles de sauter l'exon 51 (

14 % des patients) (Cirak et al, 2011). L'expression de la dystrophine est principalement limitée aux muscles squelettiques et cardiaques, et l'eteplirsen devrait être le plus efficace dans le muscle squelettique. Cependant, propice à tous les PMO, une accumulation élevée dans les reins et une excrétion urinaire rapide sont également attendues (Heemskerk et al, 2009). L'approbation de l'eteplirsen par la FDA s'est accompagnée d'une controverse en raison de la conception de l'essai et des difficultés à quantifier l'augmentation de l'expression de la dystrophine, ce qui laisse planer le doute sur l'efficacité de l'eteplirsen (Aartsma-Rus & Arechavala-Gomeza, 2018). En conséquence, il n'a pas été approuvé par l'EMA. Renforcés par des conceptions d'essais cliniques améliorées, deux ASO supplémentaires basés sur le PMO ont récemment été approuvés pour les patients DMD susceptibles de sauter l'exon 53 de la dystrophine, c'est à dire. golodirsen et viltolarsen, par la FDA, et à la fois par la FDA et le ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être, respectivement (Dhillon, 2020 Heo, 2020).

Le seul traitement à base d'ON approuvé pour une maladie neurologique est le nusinersen, utilisé pour le traitement de la SMA (Aartsma-Rus, 2017 Finkel et al, Mercuri 2017 et al, 2018). Nuusinersen cible l'exon 7 à épissage alternatif de SMN2 pré-ARNm, augmentant l'inclusion d'exons et produisant une protéine SMN fonctionnelle. Il est administré directement dans le liquide céphalo-rachidien entourant la moelle épinière par injection informatique (Hache et al, 2016). L'administration informatique dirige l'absorption dans le SNC, permettant de faibles doses et le contournement du métabolisme hépatique et de l'excrétion rénale. Les patients, en particulier les jeunes patients pré-symptomatiques, rapportent une survie prolongée et des étapes motrices atteintes au cours de l'histoire naturelle attendue de la maladie. La controverse liée au nusinersen ne porte pas sur l'efficacité mais plutôt sur le coût excessivement élevé, qui a retardé l'approbation et empêché la commercialisation dans les pays dotés de services de santé nationaux (Starner & Gleason, 2019).

Le succès du nusinersen a conduit à l'utilisation des ON comme médicaments personnalisés, illustrés par le développement du milasen, qui cible une mutation spécifique à un seul patient atteint d'une forme de maladie de Batten (Kim et al, 2019). Dans ce cas, l'insertion d'un rétrotransposon SVA (SINE-VNTR-Alu) a modifié l'épissage du domaine majeur de la superfamille facilitateur contenant 8 (MFSD8) exon 6 dans un site accepteur d'épissage cryptique. Les cliniciens ont suivi les études précliniques et les plans d'essai des études nusinersen pour accélérer l'approbation de l'étude clinique par la FDA : le dosage du milasen a été initié 14 mois après le diagnostic clinique et seulement 4,5 mois après l'identification d'un ASO thérapeutique. Le taux de détérioration du patient signifiait que le dosage devait être initié dès que possible, le patient a donc été administré parallèlement aux études de toxicologie chez l'animal. Bien que l'efficacité thérapeutique chez un seul patient ne puisse être définie, le milasen a réduit la fréquence et la durée des crises et a potentiellement diminué le déclin neurodégénératif.

Deux ON thérapeutiques basées sur l'ARNi, c'est à dire. patisiran et givosiran, ont été approuvés par la FDA en 2018 et 2019, respectivement. Patisiran représente une étape importante, car il s'agit du premier médicament commercialisé à base de siRNA, lancé seulement 20 ans après la découverte du mécanisme RNAi (Fire et al, 1998). Comme l'inotersen, le patisiran inhibe l'expression hépatocytaire de la TTR chez les patients atteints d'ATTRh (Adams et al, 2018). Patisiran se compose de siRNA dirigés contre l'ARNm de TTR formulés sous forme de LNP, qui sont administrés par voie systémique par perfusion IV. La dernière percée est le givosiran, qui représente le premier conjugué GalNAc-siRNA approuvé. Givosiran inhibe la synthèse hépatique de la delta aminolévulinate synthase 1 (ALAS1) chez les patients atteints de porphyrie hépatique aiguë (AHP), qui est une maladie héréditaire rare de la biosynthèse de l'hème (Sardh et al, 2019). L'administration sous-cutanée mensuelle de givosiran entraîne une distribution spécifique des hépatocytes et une régulation négative de ALAS1 ARNm dans le foie.

Récemment, deux nouveaux médicaments GalNAc-siRNA ciblant le foie ont reçu un avis favorable pour leur commercialisation en Europe, c'est à dire. lumasiran et inclisiran (Fitzgerald et al, 2017 McGregor et al, 2020). Le lumasiran cible l'hydroxyacide oxydase 1 (HAO1) ​​pour le traitement de l'hyperoxalurie primaire de type 1 (PH1), une maladie héréditaire rare caractérisée par une surproduction d'oxalate. Le ciblage de HAO1 réduit le substrat nécessaire à la production d'oxalate dans le foie (McGregor et al, 2020). Inclisiran cible la proprotéine convertase subtilisine-kexine de type 9 (PCSK9) pour réduire le cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL). PCSK9 est une sérine protéase, qui se lie aux récepteurs LDL pour induire leur dégradation lysosomale. Par conséquent, l'extinction de PCSK9 améliore la demi-vie des récepteurs LDL responsables de la clairance du cholestérol (Fitzgerald et al, 2017). L'inclisiran réduit de plus de 50 % les taux de cholestérol LDL chez les patients traités avec des effets secondaires minimes (Khvorova, 2017 Ray et al, 2020). L'approbation d'Inclisiran étendra les indications des ON pour inclure non seulement les maladies rares mais aussi les maladies courantes.

Commentaires de conclusion et perspectives d'avenir

En 1978, il a été démontré qu'une ON basée sur l'ADN 13-mer se liant à l'ARN du virus du sarcome de Rous pouvait inhiber l'expression des protéines en culture cellulaire (Zamecnik & Stephenson, 1978), mais ce n'est que 20 ans plus tard (1998) que le premier Le médicament thérapeutique à base d'ON, le fomiversen, a été approuvé. En 2016, seuls deux médicaments supplémentaires (pegaptanib et mipomersen) avaient été approuvés (tableau 3), mais depuis lors, le rythme de développement des médicaments à base d'ON s'est accéléré avec 11 médicaments à base d'ON actuellement approuvés (Aartsma-Rus & Corey, 2020). Pourtant, nombre de ces médicaments présentent une efficacité limitée (eteplirsen, golodirsen, viltolersen), et les médicaments les plus efficaces profitent de l'administration locale (nusinersen). Cependant, la conjugaison GalNAc et la technologie LNP représentent des percées dans l'administration qui ont complètement changé la perspective des thérapies ciblant les hépatocytes : d'un seul coup, ce tissu est désormais accessible pour un traitement avec des ON. Ces exemples de la façon dont les technologies d'administration peuvent être utilisées pour surmonter les obstacles à l'administration ont donné à l'ensemble du domaine un nouvel élan qui accélérera les découvertes pour le ciblage des tissus au-delà du foie.

La conception et la fabrication de systèmes de livraison efficaces ne sont pas le seul obstacle : la sécurité de ceux-ci et leur combinaison avec les ON sont également primordiales. Tester l'innocuité de l'ON n'a pas été facile, principalement parce que beaucoup de ces médicaments ont été développés pour traiter des maladies rares. Cela implique une abondance de modèles précliniques mais des données cliniques limitées. S'agissant d'une toute nouvelle classe de médicaments, les parties prenantes craignent de manquer une étape du développement. Une exception frappante à cela est les récentes études cliniques n-of-one : le développement de milasen (Kim et al, 2019 ) a été réalisé en un temps record, mais il a fallu un pari haut risque/haute récompense, en s'appuyant sur la sécurité de l'administration informatique d'une chimie déjà approuvée pour nusinersen.

Les résultats de l'essai clinique en cours (NCT04023552 testant l'APO(a)-LRx, un ASO conjugué à GalNAc3) pour la réduction de la lipoprotéine (a) dans les maladies cardiovasculaires pourraient constituer un bond en avant dans l'application clinique des ON thérapeutiques. Cet essai comprend 7 680 patients et le grand ensemble de données qui sera généré est dû au changement dans le paysage de ces médicaments. D'ici là, de nombreuses nouvelles technologies d'administration pourraient avoir été développées avec succès pour d'autres cibles, faisant de cette décennie l'ère de la thérapie ON.


Un octaèdre en origami d'ARN avec des siARN intrinsèques pour un puissant knockdown de gène

Les domaines de la nanotechnologie de l'ADN et de l'ARN ont établi que les acides nucléiques sont des éléments constitutifs précieux pour les nanodispositifs fonctionnels avec des applications en nanomédecine. Ici, une méthode simple pour concevoir et assembler une structure filaire d'origami d'ARN échafaudé 3D avec de petits ARN interférents à fonctionnement intrinsèque (siARN) intégrés est présentée. De manière unique, la méthode utilise un fragment d'ARNm comme brin d'échafaudage, qui est replié par complémentarité de séquence de neuf brins synthétiques plus courts. La production à haut rendement de la structure 3D prévue est vérifiée par microscopie électronique à transmission (MET). La production d'ARNsi fonctionnels est facilitée par l'incorporation de sites de reconnaissance pour Dicer à des emplacements sélectionnés dans la structure, et l'extinction efficace d'un gène rapporteur cible est démontrée.

En tant que service à nos auteurs et lecteurs, ce journal fournit des informations complémentaires fournies par les auteurs. Ces documents sont examinés par des pairs et peuvent être réorganisés pour une livraison en ligne, mais ne sont ni retouchés ni composés. Les problèmes de support technique résultant des informations de support (autres que les fichiers manquants) doivent être adressés aux auteurs.

Nom de fichier La description
biot201700634-sup-0001-SuppData-S1.pdf4.9 Mo Prise en charge des données S1.

Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant à l'article.


Conclusion et perspectives futures

RNA Therapeutics est un domaine en plein essor de la biothérapie. Ces thérapies sont basées sur une plate-forme puissante et polyvalente qui a une capacité presque illimitée pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits. RNA Therapeutics est destiné à changer la norme de soins pour de nombreuses maladies. Le nombre de médicaments à ARN en cours de développement et d'essais cliniques augmente rapidement. La croissance rapide des thérapies à base d'ARN a été due à la résolution des problèmes de stabilité, d'administration et d'immunogénicité. Alors qu'il y a encore place à l'amélioration et à l'innovation dans chacun de ces domaines, les solutions ont progressé au point que RNA Therapeutics est désormais réalisable. Bien que plusieurs acteurs dominants du secteur biopharmaceutique de l'ARN aient émergé, de nouvelles petites startups biotechnologiques ainsi que des groupes universitaires aux idées transformatrices se propagent. En outre, les programmes de thérapie à base d'ARN en milieu hospitalier faciliteront le développement de médicaments à base d'ARN et accéléreront la traduction des thérapies transformatrices du laboratoire au chevet du patient.


Introduction

L'ARN polymérase (RNAP) cellulaire multi-sous-unités dépendante de l'ADN est une machine moléculaire qui effectue la réaction fondamentale de la transcription de l'ADN et sert de centre de régulation génétique. La machine avance par étapes élémentaires, dans lesquelles la réaction catalytique dans le centre actif est couplée à la translocation de la protéine RNAP par rapport à l'ADN/ARN dans le complexe ternaire d'élongation (TEC). Ainsi, une description structure-fonctionnelle de la réaction catalytique est une condition préalable pour comprendre comment le complexe de transcription se déplace et comment il est régulé.

L'activité enzymatique principale de RNAP est le transfert d'un fragment nucléotidyle du substrat NTP au 3'-hydroxyle sur l'extrémité ARN (figure 1A). Ainsi, le centre actif RNAP devrait a priori inclure les sites de liaison pour le NTP entrant (le site « i + 1 ») et pour la terminaison ARN (le site « i »). La formation résultante de la liaison phoshodiester est suivie d'une translocation de l'extrémité nouvellement formée du site "i + 1" au site "i". La réaction et le mouvement sont réversibles : le pyrophosphate stimule la dégradation processive de l'ARN avec la libération de NTP 3'-terminaux (Rozovskaya et al., 1984 ). Avant la pyrophosphorolyse, l'extrémité 3' doit retourner dans le site « i + 1 » (figure 1B). Ainsi, à tout moment au cours de l'allongement, le TEC existe en équilibre entre les complexes «i» et «i + 1» (figure 1A et B), conduisant respectivement aux réactions directes et inverses.

Le centre actif RNAP peut également effectuer l'hydrolyse de la liaison phosphodiester. Dans le complexe « reculé » (figure 1D), l'ARN est enfilé à travers le centre actif, ce qui donne une extrémité 3' en saillie (Komissarova et Kashlev, 1997a, b Nudler et al., 1997 ). Le fragment 3' peut être éliminé par une activité endonucléase intrinsèque (Orlova et al., 1995 ), qui est stimulée par les protéines procaryotes GreA et GreB ( Borukhov et al., 1993 ) et par le facteur SII eucaryote ( Reines, 1992 Izban et Luse, 1993 ). Le pyrophosphate peut également stimuler le clivage de l'ARN dans les complexes rétrogrades de la Pol II eucaryote, libérant un fragment d'ARN avec le 5′-triphosphate ( Rudd et al., 1994) (Figure 1E).

L'élucidation de la structure cristalline aux rayons X RNAP a rendu une vue en trois dimensions du centre actif (figure 2A) ( Zhang et al., 1999 Korjeva et al., 2000 Cramer et al., 2001 Gnatt et al., 2001 Vassiliev et al., 2002 ). Son composant principal est un patch de trois résidus aspartate invariants dans l'évolution, D460β′, D462β′ et D464β′, de la sous-unité (ci-après, la nomenclature des acides aminés utilisée est celle de Escherichia coli), qui coordonnent un ion Mg 2+ étroitement lié impliqué dans la catalyse ( Zaychikov et al., 1996 ). Ce Mg 2+ est appelé ci-après Mg-I (représenté par une boule rouge sur la figure 2A). Mg-I est suspendu dans l'ouverture joignant deux canaux principaux dans la molécule RNAP : le canal principal hébergeant l'ADN et l'ARN (en haut à gauche sur la figure 2A) et le canal secondaire pour l'entrée des substrats NTP (au centre à droite sur la figure 2A), qui sert également à accueillir l'extrémité 3' saillante de l'ARN pendant le retour en arrière ( Epshtein et al., 2002 ).

En plus des trois aspartates mentionnés ci-dessus, l'ouverture est constituée de plusieurs résidus de sous-unité β (en bas sur la figure 2A), dont deux résidus acides (E813β et D814β) et un amas basique (K1073β, R678β, R1106β et R731β′ ), et la «structure de paroi» de la sous-unité (en haut au centre de la figure 2A).

En plus du Mg-I, un deuxième ion Mg 2+ a été postulé pour participer au centre actif de grandes polymérases d'ARN multi-sous-unités, par analogie avec de petites enzymes à sous-unités simples (Steitz, 1998).Cependant, les trois structures cristallines de RNAP rapportées fournissent des données contradictoires sur le second Mg 2+ catalytique : dans la structure de RNAP du noyau bactérien, on ne le voit pas du tout ( Zhang et al., 1999 ) tandis que dans la structure de levure Pol I ( Cramer et al., 2001 ) et dans l'holoenzyme RNAP de Thermus thermophilus ( Vassiliev et al., 2002), il a été positionné à différents endroits (représentés par des boules violettes et vertes non marquées sur la figure 2A, respectivement).

Dans cette étude, nous avons profité d'une activité fortuite d'exonucléase 3′–5′ dépendante de Mg 2+ dans RNAP de E. coli (Figure 1C) pour explorer les aspects structure-fonctionnels des deux ions Mg 2+ dans le centre actif. Les résultats, en combinaison avec la modélisation moléculaire, conduisent à un positionnement sans équivoque du deuxième catalytique Mg 2+ (ci-après dénommé Mg-II, représenté par la boule bleue sur la figure 2A) et révèlent une architecture fonctionnelle du centre actif qui explique tout des réactions RNAP illustrées à la figure 1 par un seul mécanisme unifié.


L'administration de nucléoside-triphosphate à l'ARN ou à l'ADN polymérase est-elle active ou passive ? - La biologie

a Département de chimie, Université du Minnesota, 207 Pleasant Street SE, Minneapolis, Minnesota 55455, États-Unis
E-mail: [email protected]

b Département de chimie médicinale, Université du Minnesota, 208 Harvard Street SE, Minneapolis, Minnesota 55454, États-Unis

c Département de biochimie, biologie moléculaire et biophysique, Université du Minnesota, 321 Church St SE, Minneapolis, Minnesota 55454, États-Unis

Résumé

Les nucléosides triphosphates modifiés (NTP) sont des outils précieux pour sonder les mécanismes enzymatiques bactériens, développer un nouveau matériel génétique et concevoir des médicaments et des protéines dotés de nouvelles fonctionnalités. Bien que l'impact des altérations des nucléobases ait été principalement étudié en raison de leur importance pour la reconnaissance des protéines, les modifications des sucres et des phosphates ont également été étudiées. Cependant, les NTP sont imperméables aux cellules en raison de leur queue de phosphate chargée négativement, un obstacle majeur à la réalisation d'études bactériennes vivantes. Ici, nous passons en revue les progrès récents réalisés pour étudier et faire évoluer les bactéries et leurs processus avec l'utilisation de NTP modifiés en explorant les altérations dans l'une des trois fractions : la nucléobase, le sucre et la queue de phosphate. Nous présentons également les méthodes innovantes qui ont été mises au point pour internaliser les NTP dans des bactéries pour in vivo applications.