Informations

B6. Mouvement et catalyse enzymatique - Biologie

B6. Mouvement et catalyse enzymatique - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Benkovic et Hammes-Schiffer ont proposé un examen approfondi des méthodes utilisées par les enzymes en catalyse. Les types de mouvements (qui peuvent être modélisés dans des simulations de dynamique moléculaire) sont décrits dans le tableau ci-dessous.

Tableau : Échelles de temps des événements dynamiques dans la catalyse enzymatique
MouvementEnviron. Échelle de temps - log(s)
vibration de liaison-14 à -13
transfert de protons-12
liaison hydrogène-12 à -11
vibration élastique de la région globulaire-12 à -11
repulpage de sucre-12 à -9
rotation des chaînes latérales à la surface-11 à -10
libration torsionnelle du groupe enterré-11 à -9
flexion des charnières aux interfaces de domaine-11 à -7
réorganisation de la structure de l'eau-8
rupture/formation d'hélice-8 à -7
transitions allostériques-5 à 0
dénaturation locale-5 à 1
rotation des chaînes latérales intérieures de taille moyenne-4 à 0

de Benkovic, S et Hammes-Schiffer, S. Science. 301, page 1197 (2003)

Warshel soutient que la stabilisation électrostatique de l'état de transition est le mécanisme prédominant pour une liaison plus étroite de l'état de transition que le substrat à l'enzyme. Des interactions hydrophobes faciliteraient une bonne orientation du substrat/état de transition dans la poche de site actif, qui est en effet préorganisée par la structure de l'enzyme. D'autres ont fait valoir que l'effet tunnel quantique (d'hydrures, de protons ou d'électrons) est un mécanisme principal pour surmonter les barrières énergétiques dans les réactions catalysées par des enzymes. En utilisant des simulations de dynamique théorique et moléculaire, Gao et al soutiennent que l'effet tunnel, un moyen de surmonter les barrières énergétiques classiques, joue un rôle beaucoup plus petit que la réduction de la hauteur de la barrière (énergie d'activation). Warshel note que des effets tunnel peuvent également se produire en solution en l'absence d'enzyme, ce qui rend d'autant plus important la comparaison des mécanismes de réaction en présence et en l'absence d'enzyme. Pourtant, les mouvements des protéines qui déplacent les chaînes latérales catalytiquement importantes vers l'état substrat/transition peuvent permettre à la fois une stabilisation électrostatique préférentielle de l'état de transition et un effet tunnel quantique. Encore une autre idée stipule que les enzymes doivent créer de nouvelles liaisons au substrat/état de transition qui ne pourraient pas être disponibles en l'absence de l'enzyme. Un tel type de liaison est une liaison hydrogène à faible barrière, dans laquelle un hydrogène sur un atome électronégatif est impliqué dans des liaisons H fortes vers deux accepteurs de liaisons hydrogène différents simultanément. Enfin, le substrat peut adopter des conformations de quasi-attaque (NAC), qui se rapprochent davantage de l'état de transition lié, et c'est la liaison de la NAC à l'enzyme, sans abaisser l'énergie d'activation, qui contribue à l'amélioration de la vitesse catalysée par l'enzyme.


Dynamique et dissipation en catalyse enzymatique

Nous utilisons des simulations de dynamique moléculaire quantifiée pour caractériser le rôle des vibrations enzymatiques dans la facilitation du transfert d'hydrure de dihydrofolate réductase. En échantillonnant l'ensemble complet des trajectoires réactives, nous sommes en mesure de quantifier et de distinguer les corrélations statistiques et dynamiques dans le mouvement enzymatique. Nous démontrons l'existence d'un couplage dynamique hors d'équilibre entre les résidus protéiques et la réaction tunnel d'hydrure, et nous caractérisons l'étendue spatiale et temporelle de ces effets dynamiques. Contrairement aux corrélations statistiques, qui donnent lieu à un couplage à l'échelle nanométrique entre les résidus protéiques distaux et la réaction intrinsèque, les corrélations dynamiques disparaissent à des distances au-delà de 4𠄶 Å de l'hydrure de transfert. Ce travail trouve un rôle minime pour la dynamique vibrationnelle non locale dans la catalyse enzymatique, et il soutient un modèle dans lequel les fluctuations des protéines à l'échelle nanométrique modulent statistiquement ou ouvrent la barrière de la réaction intrinsèque.

Les mouvements des protéines sont au cœur de la catalyse enzymatique, avec des changements de conformation à l'échelle de la microseconde et de la milliseconde bien établis pour régir les progrès tout au long du cycle catalytique (1, 2). On en sait moins sur le rôle des fluctuations plus rapides à l'échelle atomique qui se produisent dans l'environnement protéique du site actif. Le point de vue des manuels sur les mécanismes de réaction catalysés par une enzyme néglige le rôle fonctionnel de ces fluctuations et décrit un environnement protéique statique qui à la fois échafaude la région du site actif et réduit la barrière de réaction (3). Ce point de vue est devenu controversé au milieu des preuves que la chimie du site actif est couplée aux mouvements de l'enzyme (4 &# x020136), et il a été explicitement contesté par des propositions récentes selon lesquelles les réactions catalysées par l'enzyme sont entraînées par des excitations vibrationnelles qui canalisent l'énergie dans le coordonnée de réaction intrinsèque (7, 8) ou favoriser l'effet tunnel réactif (9, 10). Dans ce qui suit, nous combinons la dynamique moléculaire quantifiée et les méthodes d'échantillonnage d'événements rares pour déterminer le mécanisme par lequel les mouvements des protéines se couplent à l'effet tunnel réactif dans la dihydrofolate réductase et pour clarifier le rôle de la dynamique vibrationnelle hors d'équilibre dans la catalyse enzymatique.

Les manifestations du mouvement enzymatique comprennent à la fois des corrélations statistiques et dynamiques. Les corrélations statistiques sont des propriétés de l'ensemble d'équilibre et décrivent, par exemple, le degré auquel les fluctuations de la position spatiale d'un atome sont influencées par les fluctuations d'un autre ces corrélations régissent le paysage de l'énergie libre (EF) et déterminent la cinétique de la théorie de l'état de transition du système (6). Les corrélations dynamiques sont des propriétés de l'évolution temporelle du système et décrivent le couplage entre les mouvements atomiques inertiels, comme dans un mode vibrationnel collectif. Des preuves convaincantes de réseaux à longue distance (c'est-à-dire à l'échelle du nanomètre) de corrélations statistiques dans les enzymes émergent de l'analyse génomique (11), des simulations de dynamique moléculaire (11 �) et des études cinétiques d'enzymes à double mutation (14 � ). Mais le rôle des corrélations dynamiques dans la catalyse enzymatique reste non résolu (4, 5, 7, 17, 18), avec des résultats expérimentaux et théoriques suggérant que la réaction intrinsèque est activée par des modes vibrationnels impliquant le site actif de l'enzyme (9, 19, 20) et des résidus protéiques plus éloignés (7, 8, 21). Le degré auquel les réactions catalysées par des enzymes sont couplées à l'environnement protéique environnant, ainsi que les échelles de longueur et les échelles de temps sur lesquelles de tels couplages persistent, sont des questions centrales dans la compréhension, la régulation et la conception de novo des catalyseurs biologiques (22).

Escherichia coli la dihydrofolate réductase (DHFR) est un prototype largement étudié pour les mouvements des protéines dans la catalyse enzymatique. Il catalyse la réduction du substrat 7,8-dihydrofolate (DHF) via le transfert d'hydrure du cofacteur nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) (Fig.ਁ UNE et Fig. S1). Nous étudions cette réaction intrinsèque à l'aide de la dynamique moléculaire des polymères en anneau (RPMD) (23, 24), une méthode d'intégration de chemin récemment développée qui permet d'inclure les effets de quantification nucléaire, tels que l'énergie du point zéro et l'effet tunnel, dans la dynamique du transfert. hydrure. Les simulations RPMD avec plus de 14 000 atomes sont effectuées en utilisant un solvant explicite et en utilisant un potentiel de liaison de valence empirique (EVB) pour décrire la surface d'énergie potentielle pour l'hydrure de transfert. Le potentiel EVB est obtenu à partir d'une matrice hamiltonienne efficace, avec des éléments diagonaux (Vr(X) et Vp(X)) correspondant à l'énergie potentielle pour les connectivités de liaison du réactif et du produit et avec l'élément de matrice hors diagonale constant adapté au taux expérimental (11, 25). Le vecteur X inclut la position de l'hydrure quantifié et de tous les noyaux classiques dans le système. Le potentiel EVB utilisé ici a été choisi par souci de cohérence avec les études de simulation antérieures de DHFR (11, 26) bien que les problèmes mécaniques abordés dans cette étude ne soient pas très sensibles aux détails de la surface d'énergie potentielle, il convient de noter que plus des méthodes précises de théorie de la structure électronique pour décrire la surface de l'énergie potentielle de l'enzyme, y compris la méthode combinée de la mécanique quantique et de la mécanique classique (QM/MM), sont disponibles et largement utilisées dans les simulations enzymatiques.

La réaction de transfert d'hydrure catalysée par DHFR. (UNE) Le site actif avec l'hydrure (vert) indiqué dans la représentation en cycle-polymère du MD quantifié et les atomes C donneurs et accepteurs en violet. (B) Le profil d'énergie libre quantifié pour la réaction. (C) Le coefficient de transmission dépendant du temps correspondant à la surface de division à λ(X) = -4,8 kcal/mol.

La vitesse de réaction thermique est calculée à partir du produit de l'activation pondérée de Boltzmann FE et du coefficient de transmission de réaction (24), qui sont tous deux calculés en termes de surface de division λ(X) = -4,8 kcal/mol où λ(X) = Vr(X) - Vp(X). La surface FE F(λ) est obtenu en utilisant plus de 120 ns d'échantillonnage RPMD ( Fig.ਁ B), et le coefficient de transmission est obtenu à partir de plus de 5 000 trajectoires RPMD qui sont libérées de la distribution de Boltzmann contrainte à la surface de division ( Fig.ਁ C). Contrairement aux méthodes mixtes quantique-classique et de la théorie des états de transition, la RPMD donne des taux de réaction et des mécanismes qui sont formellement indépendants du choix de la surface de division ou de toute autre hypothèse de coordonnées de réaction (24). De plus, la méthode RPMD permet de générer l'ensemble des trajectoires de dynamiques moléculaires réactives et quantifiées, ce qui est essentiel pour l'analyse ultérieure des corrélations dynamiques. Les détails du calcul, y compris une description de la méthodologie d'échantillonnage d'événements rares utilisée pour générer l'ensemble non biaisé des trajectoires réactives (27, 28), sont fournis dans Matériaux et méthodes au dessous de.


Résumé

Comment les enzymes atteignent leurs énormes améliorations de taux reste une question centrale en biologie, et notre compréhension à ce jour a eu un impact sur le développement de médicaments, influencé la conception des enzymes et approfondi notre appréciation des processus évolutifs. Alors que les enzymes positionnent les groupes catalytiques et réactifs dans des sites actifs, la physique exige que les atomes subissent un mouvement constant. De nombreuses propositions ont invoqué le positionnement ou les mouvements comme élément central de la fonction enzymatique, mais la rareté des données expérimentales a limité notre compréhension du positionnement et du mouvement, de leur importance relative et de leurs changements au cours du cycle de réaction de l'enzyme. Pour examiner le positionnement et les mouvements et tester les propositions catalytiques, nous avons collecté des données de cristallographie aux rayons X à « température ambiante » pour Pseudomonas putida isomérase cétostéroïde (KSI), et nous avons obtenu des ensembles conformationnels pour cela et un KSI homologue à partir de plusieurs structures cristallines PDB. Les analyses d'ensemble ont indiqué un changement limité au cours du cycle de réaction de KSI. Le positionnement du site actif était sur l'échelle de 1 à 1,5 Å et n'était pas exceptionnel par rapport aux groupes non catalytiques. Les ensembles KSI ont fourni des preuves contre les propositions catalytiques invoquant une discrimination géométrique des trous d'oxyanion entre l'état fondamental et l'état de transition ou un positionnement général très précis de la base. Au lieu de cela, l'augmentation ou la diminution du positionnement de la base générale de KSI a réduit la catalyse, suggérant une hétérogénéité conformationnelle optimisée à l'échelle d'Ångstrom qui permet à KSI de catalyser efficacement plusieurs étapes de réaction. Les analyses d'ensemble des groupes environnants pour le WT et les KSI mutants ont fourni des informations sur les forces et les interactions qui permettent et limitent les mouvements du site actif. Plus généralement, cette perspective d'ensemble étend les relations structure-fonction traditionnelles, fournissant la base d'une nouvelle ère d'interrogation « ensemble-fonction » des enzymes.

Le rôle central des enzymes en biologie s'incarne dans les décennies d'efforts consacrés à une enquête approfondie sur les origines de leur catalyse (par exemple, réf. 1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –6). Les études enzymatiques identifient désormais systématiquement les groupes de sites actifs qui interagissent avec les substrats et révèlent leurs rôles dans la liaison et dans la facilitation des transformations chimiques. Néanmoins, ces soi-disant "groupes catalytiques" seuls, en dehors du contexte d'une enzyme repliée, ne tiennent pas compte des énormes augmentations de vitesse et des spécificités exquises présentées par les enzymes (4). Les propositions classiques de catalyse enzymatique ont invoqué l'importance du positionnement des groupes de sites actifs au sein d'une enzyme repliée et des substrats localisés et positionnés par des interactions de liaison (6 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –15). Bien que ces propositions invoquent universellement le mouvement restreint des groupes catalytiques, la quantité de restriction et la quantité de catalyse fournie par cette restriction ont fait l'objet de nombreuses discussions et débats (16 ⇓ ⇓ ⇓ -20). Inversement, il est également clair que les mouvements sont inhérents aux enzymes et que les transitions conformationnelles et les réarrangements structurels sont importants pour la fonction enzymatique (par exemple, les références 11 et 21 -23). Considérant à la fois le positionnement et les mouvements, il a été reconnu que : « Pour la catalyse, flexible mais pas trop flexible, ainsi que rigide mais pas trop rigide, est essentiel. Plus précisément, la protéine doit être suffisamment rigide pour maintenir la structure requise mais suffisamment flexible pour permettre des mouvements atomiques au fur et à mesure que la réaction se déroule » (3).

L'importance du positionnement et des mouvements pour la fonction enzymatique suggère une vision nuancée de la catalyse enzymatique et souligne la nécessité de mesures expérimentales directes du positionnement et des mouvements au sein des enzymes.

Comme Feynman l'a noté, "Tout ce que font les êtres vivants peut être compris en termes de tremblements et de tremblements d'atomes" (24). Mais la simple observation des mouvements des résidus du site actif ne nous dit pas comment les enzymes réalisent la catalyse. Pour comprendre les enzymes, nous voulons savoir dans quelle mesure une enzyme atténue et modifie les mouvements des résidus catalytiques. Nous voulons savoir quelles augmentations ou diminutions du mouvement augmentent ou diminuent la vitesse de réaction et quelles interactions et forces sont les plus responsables de l'amortissement des mouvements. Avec ces informations, nous pourrons peut-être mieux concevoir de nouvelles enzymes. De plus, dans quelle mesure les résidus du site actif sont-ils positionnés lors du repliement de l'enzyme, ou ajustés au fur et à mesure que la réaction progresse, et les résidus du site actif sont-ils positionnés plus précisément que les résidus dans l'ensemble d'une enzyme ?

Pour répondre aux questions fondamentales sur le fonctionnement et l'évolution des enzymes, et sur la façon de concevoir des enzymes hautement efficaces, nous devons obtenir des informations expérimentales sur les ensembles de conformation enzymatique : la distribution des états enzymatiques dictée par leurs paysages énergétiques multidimensionnels très complexes sur lesquels se produisent des réarrangements conformationnels. Les observations de densités électroniques bien résolues à partir des données de diffraction des rayons X indiquent le positionnement des résidus dans et autour du site actif, mais ne fournissent pas d'informations sur l'étendue et la nature de ce positionnement. Les facteurs B cristallographiques des résidus sont parfois utilisés pour déduire des mouvements, mais ne sont qu'indirectement liés au mouvement intrinsèque et contiennent des contributions de facteurs supplémentaires, tels que l'ordre cristallographique (25, 26). Les expériences de RMN identifient les groupes avec une plus grande liberté de mouvement et peuvent fournir des informations temporelles, mais ces expériences manquent généralement d'informations sur les directions et l'étendue de ces mouvements (27). Les simulations de dynamique moléculaire fournissent des modèles au niveau atomique pour des systèmes entiers, mais nous manquons actuellement des tests expérimentaux rigoureux nécessaires pour déterminer si les sorties de calcul reflètent ou non le comportement physique réel, ce qui empêche de déduire des conclusions mécanistes fermes (28, 29).

Deux approches cristallographiques aux rayons X ont récemment émergé qui peuvent fournir des informations d'ensemble conformationnelles dérivées expérimentalement : les ensembles structuraux de la banque de données de protéines à similarité de séquence (PDB) (appelés ici « pseudoensembles ») (30, 31) et les modèles multiconformateurs de X -données de rayons obtenues à des températures supérieures à la transition vitreuse de la protéine (appelée diffraction des rayons X à "température ambiante" ou "RT" dans la littérature et ici) (22, 32, 33). Ces approches sont complémentaires. Les pseudo-ensembles fournissent des informations sur les résidus qui se déplacent de concert (c'est-à-dire des mouvements couplés) mais nécessitent des dizaines de structures (voir aussi Annexe SI, Texte supplémentaire 1).Les données radiographiques RT des monocristaux peuvent fournir des modèles multiconformateurs, de sorte que les informations d'ensemble sur les nouveaux complexes et mutants peuvent être acquises plus facilement, mais ne fournissent pas d'informations directes sur les mouvements couplés. De plus, les études aux rayons X RT fournissent des informations directes sur les distributions d'équilibre sans cryo-refroidissement, qui peuvent modifier et éteindre les mouvements, et sans supposer que différents cristaux cryo-refroidis reproduisent une distribution d'états d'équilibre (32, 34 -36).

Ici, nous démontrons la cohérence entre ces approches et tirons parti des points forts de chacune : la capacité d'évaluer les réarrangements corrélés des chaînes latérales dans et à proximité du site actif via des pseudo-ensembles, et la capacité d'obtenir de nouvelles informations de type ensemble de nouveaux états à partir d'un seul X jeux de données de rayons à des températures supérieures à la transition vitreuse. Surtout, ces analyses rendent compte de l'hétérogénéité conformationnelle et ne peuvent pas donner d'informations sur les échelles de temps des mouvements et des interconversions entre les états. De plus, chaque modèle traditionnel au sein du pseudo-ensemble représente principalement un état unique plutôt que moyen et la combinaison de ces états capture une distribution d'ensemble. De même, les conformations alternatives dans les modèles multiconformateurs réduisent explicitement le biais vers les structures moyennes des systèmes multi-états. Se concentrer sur une enzyme modèle avec des données à très haute résolution et avec des ligands représentant les étapes de son chemin de réaction nous a permis d'obtenir des informations qui ne seraient pas possibles à partir de structures statiques, à partir d'une approche d'ensemble seule ou à partir de données moins étendues ou à plus faible résolution. .

Nous avons choisi d'étudier l'enzyme kétostéroïde isomérase (KSI) (Fig. 1) en raison de notre capacité à obtenir des données de diffraction à haute résolution, en raison de la richesse accumulée des informations structurelles et mécaniques, et en raison de l'utilisation par KSI de stratégies catalytiques communes à de nombreux enzymatiques. En tant qu'enzyme à substrat unique, KSI permet d'obtenir des informations structurelles avec un réactif bonifié lié. De plus, nous avons obtenu des données d'ensemble pour le KSI de deux espèces, ce qui a donné des résultats cohérents et nous a permis de répondre aux questions non résolues de décennies d'études du KSI. Nous avons également utilisé nos ensembles de ces homologues KSI pour poser et répondre à des questions plus générales. Nos analyses approfondies de KSI apportent une perspective d'ensemble aux études traditionnelles de structure-fonction et fournissent la base d'une nouvelle ère d'études d'ensemble-fonction.

La réaction du KSI. Mécanisme de réaction et représentation schématique du site actif (UNE) et son organisation 3D (B) [Code ID PDB 1OH0 (87)]. KSI catalyse l'isomérisation des doubles liaisons de substrats stéroïdes (illustrés pour le substrat 5-androstène-3,17-dione) en utilisant un acide/base général D40 (que nous appelons ici une base générale, pour plus de simplicité), et un trou d'oxyanion composé des chaînes latérales de la base générale Y16 et D103 (protonée) et des résidus de trous d'oxyanion sont colorés en rouge et orange, respectivement. Le produit en UNE, 4-androstene-3,17-dione, est le substrat de la réaction inverse et a été utilisé pour la cristallographie aux rayons X RT ici. (C) Exemples de KSI TSA oxyanion utilisés pour les ensembles KSI TSA : Equilenin (La gauche) et un phénolate substitué (Droit).


Discussion

Ces dernières années ont vu une explosion d'intérêt pour l'idée qu'il existe un lien entre la dynamique de la milliseconde et la catalyse enzymatique (pour une revue détaillée, voir la référence 4). La popularité de cette idée persiste, malgré de nombreuses preuves pour la rendre controversée (4, 18, 23). Cependant, un travail récent est remarquable (6) dans son hypothèse que la réduction de la constante de vitesse des mutants DHFR présentés est due à l'élimination du couplage dynamique à la conformation occluse. Pour que cette déduction soit valable, il faut pouvoir écarter l'idée assez évidente que la mutation change l'énergie d'activation en changeant la préorganisation électrostatique. Ainsi, il a été avancé que, parce que les enzymes natives et mutantes ont des structures « très similaires », elles ont également des énergies de réorganisation similaires. Cependant, nos études de simulation quantitative ont établi que la préorganisation électrostatique est en fait assez différente dans les enzymes natives et mutantes, ce qui montre également que la simple inspection des structures protéiques ne peut pas évaluer la préorganisation. Par exemple, le simple fait de regarder une structure RMN (contrairement à son utilisation dans des calculs minutieux comme dans la référence 9) ne peut prédire ni la stabilisation électrostatique ni le pKunes (sans parler de l'énergie TS) car cela nécessite l'intervention d'outils de calcul fiables.

Plus important, cependant, est le fait que nous avons pu reproduire la tendance observée dans les effets mutationnels par les calculs EVB (sans ajuster aucun paramètre à cette fin), et ainsi montré que tous les changements observés dans khyd sont représentés par les énergies libres d'activation. Par conséquent, nous avons établi que l'effet catalytique n'a pas besoin d'être expliqué par des effets dynamiques ésotériques.

Ensuite, nous avons exploré la signification des différences entre les paysages conformationnels du mutant WT et N23PP/S148A, et nous avons montré qu'avoir accès à des mouvements dans le sens de l'état occlus n'aide pas à la catalyse, ni par couplage dynamique ni par une augmentation en flexibilité (à moins peut-être de petits effets entropiques non dynamiques). Nous avons également clarifié les concepts catalytiques récents et leurs implications intéressantes. Par exemple, l'un des concepts présentés dans la réf. 6 est l'idée d'échantillonner des conformations à haute énergie (par exemple, les références 24 et 25), qui est formulée, par exemple, en déclarant « bien que le site actif du mutant N23PP/S148A ecDHFR soit entièrement pré-organisé dans l'état fondamental, milliseconde - les fluctuations à l'échelle du temps du site actif sont limitées de sorte que l'enzyme ne peut pas échantillonner efficacement les sous-états conformationnels à plus haute énergie qui sont propices à la formation de l'état de transition. Malheureusement, il y a un sérieux problème avec cette idée, comme évoqué dans les sections précédentes. C'est-à-dire qu'il est vrai que la RMN nous permet de sonder les mouvements associés à des régions de relativement haute énergie. Cependant, l'observation de mouvements à l'échelle de la milliseconde par RMN a peu à voir avec la chance d'atteindre des régions le long du chemin menant au TS. L'échantillonnage dans les grosses molécules est complètement dicté par la surface d'énergie potentielle (ce qui conduit au paysage d'énergie libre) et, une fois que les barrières sont supérieures à quelques kilocalories par mole, l'échantillonnage suit la probabilité de Boltzmann. Ainsi, la seule façon d'atteindre le TS dans un délai de 1/20e de seconde (16 kcal/mol) chez le mutant est que le mutant passe des régions qui correspondent à des fluctuations en millisecondes (régions de 15 kcal/mol). Les considérations ci-dessus signifient que rien ne peut augmenter ou diminuer les chances de visiter des points à haute énergie sur la surface d'énergie libre (le long de la coordonnée de réaction), sauf changer l'énergie libre de ces points, car la probabilité de les échantillonner est complètement déterminée par l'exponentielle de l'énergie libre (ie, exp[-Δg(X)/RT], où X désigne la coordonnée de la réaction). Ce point a été prouvé dans notre étude de simulation d'AdK (18) et il n'y a aucune découverte expérimentale qui indique la possibilité d'un échantillonnage inertiel dans le cas des barrières millisecondes (notez que l'argument dans les découvertes expérimentales les plus récentes, réf. 6, était basée sur l'hypothèse que l'énergie de réorganisation ne change pas, ce que nous avons montré être incorrect). Apparemment, la question pertinente ici n'est pas le processus d'échantillonnage lui-même, mais plutôt la probabilité que différents points le long de la coordonnée de réaction soient échantillonnés. Le processus d'échantillonnage est en effet rigoureusement défini et simulé avec précision par nos simulations en énergie libre, comme le démontre la Texte SI (c'est-à-dire, la figure S6).

En considérant les affirmations de la réf. 6, il est utile d'aborder le concept de fluctuations qui sont nécessaires pour amener le site actif à « une forme étroitement fermée » et qui sont bloquées dans le mutant. C'est-à-dire que le RS est à un minimum d'énergie libre et qu'il n'y a pas besoin de fluctuations pour amener le système à ce site actif étroitement fermé (voir la figure 7 dans la référence 4 et la figure 4 dans cet article). En revanche, si les auteurs veulent dire que nous avons une sorte de blocage des fluctuations qui conduisent au TS, alors nous ne voyons aucune preuve de cela non plus. De plus, si les auteurs veulent dire des fluctuations sur la région TS, alors nous avons ici une relation mal définie avec l'entropie d'activation qui n'est ni définie ni correctement formulée. Enfin, notez qu'argumenter simplement dans le sens inverse - c'est-à-dire que le fait que le mutant ne peut pas adopter une conformation occluse pourrait être un indicateur que la flexibilité des boucles du site actif peut être considérablement atténuée lors de la mutation - n'est pas en soi définir une coordonnée de flexibilité appropriée, ni ne précise ce que les auteurs pensent que le but de cette coordonnée de flexibilité est réellement.

On pourrait faire valoir que notre étude n'a pas abordé la proposition dynamique de la réf. 6 parce que cette étude n'a jamais explicitement identifié le mouvement dynamique comme un mouvement vers la configuration OC. Nous devons encore une fois souligner que nous avons déployé de grands efforts pour étudier quelle était la proposition présentée dans la réf. 6 est en fait (parce que ce travail n'était pas clair sur l'effet dynamique observé). Par conséquent, nous avons choisi l'interprétation la plus raisonnable de la réf. 6, qui consisterait à examiner les fluctuations conformationnelles dans la direction bloquée par les mutations clés.

L'importance de la préorganisation du site actif est clairement visible dans le cas de la conception enzymatique. Ici, malgré des efforts importants dans cette direction, la plupart des tentatives de conception rationnelle d'enzymes ont rencontré un succès limité (voir la discussion dans, par exemple, la référence 26 et le Texte SI). Cependant, de tels concepts peuvent être perdus derrière des arguments qui prétendent que le site actif est encore entièrement pré-organisé lors de la mutation - encore une fois, la pré-organisation ne concerne pas la structure mais plutôt sur le travail impliqué dans le réarrangement de la protéine de son RS à son TS. Dans tous les cas, les changements structurels observés dans la distance D-A (de 3,3 à 2,9 ) sont suffisants pour rendre inutile toute hypothèse basée sur la structure d'une réorganisation électrostatique identique. C'est-à-dire que dans l'eau, par exemple, un tel changement réduirait l'énergie de solvatation d'une paire d'ions d'environ 15 kcal/mol (voir l'équation 7 dans la réf. 27 et la discussion qui s'y rapporte). Le fait que la distance dans le mutant soit plus petite résulte très probablement d'une augmentation de la réorganisation orthogonale (c'est-à-dire d'une augmentation de l'énergie de solvatation). Il est également utile de noter que les efforts de conception d'enzymes bénéficieront beaucoup plus des calculs directs de l'énergie de réorganisation que de la recherche du lien entre les mouvements conformationnels et l'étape chimique (un lien qui est fréquemment suggéré par les partisans de l'importance des contributions dynamiques à la catalyse).

Notre travail s'est concentré sur les tentatives récentes de relier les études mutationnelles dans DHFR à la proposition dynamique (6). Cependant, il convient de souligner que le même type de tentative a émergé dans une autre étude très médiatisée sur la cyclophiline A (7). Ici, encore une fois, la découverte que les mutations qui bloquent l'interconversion entre des sous-états conformationnellement différents réduisent également l'activité catalytique a été utilisée comme preuve de l'existence d'une sorte d'effet dynamique. Cependant, comme nous l'avons discuté dans notre étude récente (4), ce système spécifique ne fournit pas de lien causal et logique entre les observations expérimentales intéressantes et importantes et les effets dynamiques présumés. Ici encore, il est évident que les sites actifs avec une préorganisation différente (en raison d'une séquence différente) auront des barrières d'activation différentes et, à l'heure actuelle, il n'y a rien dans l'étude expérimentale rapportée qui permettrait de déterminer la préorganisation sans modélisation informatique ( qui, s'il est fait correctement, donnerait certainement des résultats différents pour les deux systèmes et reproduira, sur la base de tout autre cas antérieur, l'effet mutationnel observé sans dépendre de l'interconversion entre les sous-états).

Il est également important de répondre à l'affirmation selon laquelle le mouvement de la boucle Met20 (6) est lié aux mouvements de la protéine dans le TS et à la catalyse. Nous notons que nous n'avons aucun problème à trouver tous les modes de la protéine qui ont des projections sur la coordonnée de réaction, le font depuis de nombreuses années (19, 28), et l'ont déjà fait pour ce système (voir Texte SI). Cependant, l'effet du déplacement dans la direction OC est décrit sur la figure 3 avec plus de soin qu'il ne serait possible en examinant simplement les modes normaux du système. Maintenant, à l'examen de la figure 3, nous ne trouvons pas d'avantage majeur pour se déplacer dans la direction conformationnelle (voir la crête TS). De plus, même s'il y avait un effet significatif du mouvement dans la direction d'occlusion sur le TS (c'est-à-dire que le TS serait déplacé dans la direction d'occlusion), cela aurait peu à voir avec la dynamique. C'est-à-dire que, comme nous l'avons montré depuis 1984, les coordonnées de l'enzyme [appelées dans nos travaux coordonnées généralisées du solvant (par exemple, la figure 6 de la réf. 19 et de la réf. 28)] et pas seulement le substrat font partie du réaction globale, de la même manière que la réorientation de l'eau fait partie de la coordonnée de réaction dans l'eau. Ainsi, se déplacer le long de la coordonnée enzymatique fait partie du paysage de l'énergie libre et n'explique aucune catalyse (la catalyse s'explique par les facteurs qui monnaie la surface et non par la surface résultante elle-même).

Fait intéressant, la possibilité d'avoir un TS peu profond le long de la coordonnée conformationnelle du WT signifie que le -TΔS ≠ global est réduit. Il en sera de même pour l'entropie du produit, si la coordonnée conformationnelle est moins profonde dans l'état du produit. Bien sûr, ces contributions entropiques sont évaluées dans nos calculs d'énergie libre, mais le fait que les études RMN puissent aider à explorer les effets entropiques (29) est important. Il serait bien sûr intéressant que l'entropie d'activation se révèle plus positive chez le WT que chez le mutant, mais il est crucial de préciser que l'entropie est un effet d'énergie libre bien défini qui n'a rien à voir avec la dynamique ( en fait, les mouvements potentiels le long de la crête TS seront de l'ordre de la nanoseconde et non de la milliseconde). Quoi qu'il en soit, la corrélation expérimentale entre la RMN et l'entropie d'activation nécessite au moins des informations séparées de la RS et de la PS.

Nous avons abordé ici les principaux points soulevés dans les récentes études expérimentales pertinentes. Cependant, étant donné que les questions explorées dans ce travail sont controversées, il ne nous est pas possible d'aborder chaque affirmation ou conclusion des partisans de la proposition dynamique avant même d'en être conscients. Néanmoins, nous essayons de fournir une clarification utile de cette question dans le Texte SI, y compris une discussion sur les problèmes généraux liés à la catalyse (voir, par exemple, la figure S7). Dans l'ensemble, nous avons fourni ici des preuves claires que les soi-disant mutations knock-out dynamiques modifient simplement l'étape chimique de la catalyse en modifiant l'énergie libre d'activation et ne pas par tout effet dynamique. D'autres défis expérimentaux de nos résultats devront venir avec des interprétations informatiques détaillées et cohérentes, ou avec des démonstrations directes d'un couplage dynamique (comme, par exemple, sonder la corrélation entre les mouvements conformationnels et chimiques), plutôt que des arguments circonstanciels basés sur des preuves indirectes .


CHAPITRE 7 - CATALYSE

Nous pouvons appliquer ce que nous avons appris sur la catalyse par de petites molécules aux réactions catalysées par des enzymes. Pour comprendre le mécanisme d'une réaction catalysée par une enzyme, nous essayons de modifier autant de variables, une à la fois, et de déterminer les effets des changements sur l'activité de l'enzyme. Les méthodes cinétiques peuvent être utilisées pour obtenir des données à partir desquelles des inférences sur le mécanisme peuvent être faites. De toute évidence, les structures cristallines de l'enzyme en présence et en l'absence d'un inhibiteur compétitif donnent des informations abondantes sur les mécanismes possibles. Il est étonnant, cependant, de voir combien d'informations sur le mécanisme enzymatique peuvent être obtenues même si tout ce que vous avez est un mélangeur, un chronomètre, une enzyme impure et quelques substrats et réactifs inhibiteurs. Systématiquement, le cinétique, le chimiste médicinal et les biologistes moléculaires (c'est-à-dire un chimiste bien formé) peuvent changer :

  1. le substrat - par exemple, changer le groupe partant ou les substituants acyle d'un substrat hydrolysable
  2. le pH ou la force ionique - qui peut donner des données sur les acides/bases généraux dans le site actif
  3. l'enzyme - par modification chimique d'acides aminés spécifiques, ou par mutagenèse spécifique à un site
  4. le solvant - comme nous le verrons dans la section du chapitre suivant.

Nous explorerons en détail les mécanismes de trois enzymes. Pour la carboxypeptidase, nous étudierons les mécanismes possibles de clivage des acides aminés hydrophobes C-terminaux à partir d'un peptide. Pour le lysozyme, nous étudierons les caractéristiques structurelles de l'enzyme et des substrats ainsi que le mécanisme de clivage des liens glycosidiques dans les parois cellulaires des peptidoglycanes bactériens. Pour la chymotrypsine, nous étudierons des expériences faisant varier le substrat, le pH et l'enzyme et déduirons de ces informations un mécanisme cohérent avec les données expérimentales. Les analyses cinétiques peuvent être utilisées pour déterminer :

  • ordre de liaison/dissociation des substrats et produits
  • constantes de vitesse pour les étapes individuelles
  • et des indices sur la nature des groupes catalytiques trouvés dans l'enzyme.

Un substrat peptidique se lie au site actif de l'enzyme. Les structures aux rayons X de l'enzyme avec et sans inhibiteur compétitif montrent un grand changement de conformation au site actif lorsque l'inhibiteur ou le substrat est lié. Sans inhibiteur, plusieurs eaux occupent le site actif. Lorsque l'inhibiteur et vraisemblablement le substrat sont liés, l'eau s'en va (ce qui est favorisé au niveau entropique) et Tyr 248 oscille depuis près de la surface de la protéine en l'absence d'une molécule dans le site actif pour interagir avec le groupe carboxyle de la molécule liée , une distance de mouvement égale à environ 1/4 du diamètre de la protéine. Cela ferme efficacement le site actif et expulse l'eau. Un ion Zn2+ est présent sur le site actif. Il est lié par His 69, His 196, Glu 72, et enfin une molécule d'eau comme quatrième ligand. Une poche hydrophobe qui interagit avec le groupement phénolique du substrat rend compte de la spécificité de la protéine.

Dans le mécanisme catalytique, le Zn2+ aide à polariser la liaison amide labile, tandis que le Glu 270, agissant comme une base générale, qui, avec le Zn2+, aide à favoriser la dissociation d'un proton de l'eau liée, ce qui en fait un meilleur nucléophile. L'eau attaque le carbone électrophile de la liaison sessile, le Glu 270 agissant comme un catalyseur basique général. L'intermédiaire tétraédrique s'effondre alors, expulsant le groupe amine partant, qui capte un proton de Glu 270, qui agit maintenant comme un catalyseur acide général.Les gens croyaient que Tyr 248 agissait comme un acide général, mais la mutagenèse a montré que Tyr 248 peut être remplacé par Phe 248 sans effet significatif sur la vitesse de la réaction.

Jmol : Mise à jour de la Carboxypeptidase A Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Cette enzyme, présente dans les cellules et les sécrétions des vertébrés mais aussi dans les virus qui infectent les bactéries, clive les liaisons répétées du peptidoglycane GlcNAc (β 1->4) (NAG-NAM) dans les parois cellulaires des bactéries et le GlcNAc (β 1->4) GlcNAc (poly-NAG) dans la chitine, présente dans les parois cellulaires de certains champignons. Puisque ces polymères sont hydrophiles, le site actif de l'enzyme devrait contenir un canal accessible au solvant dans lequel le polymère pourrait se lier. Les structures cristallines du lysozyme et des complexes de lysozyme et de NAG ont été résolues à haute résolution. Les inhibiteurs et les substrats forment de fortes liaisons H et certaines interactions hydrophobes avec la fente enzymatique. Des études cinétiques utilisant des polymères (NAG)n montrent une forte augmentation de kcat lorsque n augmente de 4 à 5. Les kcat pour NAG6 et (NAG-NAM)3 sont similaires. Des études de modèles ont montré que pour que la catalyse se produise, (NAG-NAM)3 se lie au site actif avec chaque sucre dans la conformation de la chaise sauf le quatrième qui est déformé en une forme de demi-chaise, ce qui labilise le lien glycosidique entre le 4e et le 5e sucres. Des études supplémentaires montrent que si les sucres qui s'insèrent dans le site de liaison sont marqués A-F, alors en raison du substituant lactyle volumineux sur le NAM, les résidus C et E ne peuvent pas être NAM, ce qui suggère que B, D et F doivent être des résidus NAM. Le clivage se produit entre les résidus D et E.

Un examen de la chimie de la formation et du clivage des liaisons glycosidiques (un acétal) montre que le clivage de l'acétal est catalysé par des acides et procède par l'intermédiaire d'un ion oxonium qui existe sous forme de résonance sous forme de carbocation.

La catalyse par l'enzyme implique Glu 35 et Asp 52 qui sont dans le site actif. Asp 52 est entouré de groupes polaires mais Glu 35 est dans un environnement hydrophobe. Cela devrait augmenter le pKa apparent du Glu 35, le rendant moins susceptible de donner un proton et d'acquérir une charge négative à des valeurs de pH faibles, ce qui en fait un meilleur acide général à des valeurs de pH plus élevées. Le mécanisme général semble impliquer :

liaison d'une unité hexasaccharidique du peptidoglycane avec distorsion concomitante du D NAM.

protonation de l'acétal sessile O par l'acide général Glu 35 (avec le pKa élevé), ce qui facilite le clivage de la liaison glycosidique et la formation de l'ion oxonium stabilisé résonant.

Asp 52 stabilise l'oxonium positif par catalyse électrostatique. La forme demi-chaise déformée du DNAM stabilise l'oxonium qui nécessite une coplanarité des substituants attachés au carbone hybride sp2 de la forme résonante carbocation (un peu comme nous l'avons vu avec la liaison peptidique planaire).

l'eau attaque le carbocation stabilisé, formant l'hémiacétal avec libération du proton supplémentaire de l'eau vers le Glu 35 déprotoné reformant la catalyse acide générale.

La liaison et la distorsion du substituant D du substrat (à la forme demi-chaise comme indiqué ci-dessus) se produisent avant la catalyse. Étant donné que cette distorsion aide à stabiliser l'ion intermédiaire oxonium, elle stabilise vraisemblablement également l'état de transition. Par conséquent, cette enzyme semble se lier plus étroitement à l'état de transition que le substrat libre et non déformé, ce qui est encore une autre méthode de catalyse.

Des études de pH montrent que des chaînes latérales avec des pKa de 3,5 et 6,3 sont nécessaires à l'activité. Ceux-ci correspondent vraisemblablement à Asp 52 et Glu 35, respectivement. Si les groupes carboxy du lysozyme sont modifiés chimiquement en présence d'un inhibiteur compétitif de l'enzyme, les seuls groupes carboxy protégés sont Asp 52 et Glu 35.

Dans un mécanisme alternatif, Asp 52 agit comme une catalyse nucléophile et forme une liaison covalente avec NAM, expulsant un groupe partant NAG avec Glu 35 agissant comme un acide général. Ce mécanisme alternatif est également cohérent avec d'autres enzymes de clivage des liaisons β-glycosidiques. La distorsion du substrat est également importante dans ce mécanisme alternatif.

La chymotrypsine, une protéase, clive les amides ainsi que les petits substrats esters après les résidus aromatiques. Les données suivantes utilisant différents substrats de la chymotrypsine suggèrent qu'un intermédiaire covalent se produit sur le clivage catalysé par la chymotrypsine des esters et des amides.

  1. changer le substrat - par exemple changer le groupe partant ou les substituants acyle d'un substrat hydrolysable :

Constantes cinétiques pour le clivage de la chymotrypsine des dérivés de N-acétyl-L-Trp - N-acétyl-L-Trp-X

  1. le kcat et le kcat/Km sont plus grands et le Km plus petit pour les substrats esters par rapport aux substrats amides, suggérant que les amides sont plus difficiles à hydrolyser (tableaux 1 et 2 ci-dessus). Ceci est attendu étant donné le groupe partant plus pauvre de l'amide.
  2. le kcat pour l'hydrolyse des substrats esters ne dépend pas de la nature du groupe partant (c'est-à-dire s'il s'agit d'un groupe partant plus pauvre tel que le méthoxy ou d'un meilleur groupe partant tel que le p-nitrophénolate) suggérant que cette étape n'est pas la vitesse étape limitante pour le clivage de l'ester. (Tableau 2). Sans l'enzyme, les esters p-nitrophényliques sont clivés beaucoup plus rapidement que les esters méthyliques. Par conséquent, la désacylation doit être limitante. Mais désacylation de quoi ? Si l'eau était le nucléophile, la libération du groupe partant entraînerait la formation simultanée du groupe carboxyle libre et de l'amine. Ceci suggère un intermédiaire covalent acyl-enzyme.
  3. Lorsque l'extrémité acyle du substrat ester est modifiée, sans changer le groupe partant (un groupe p-nitrophényle), un intermédiaire covalent peut être piégé. Plus précisément, la désacylation d'un groupe triméthylacétyle est beaucoup plus lente que celle d'un groupe acétyle. Il est si lent qu'un intermédiaire de chymotrypsine marqué au triméthylacétyle marqué au 14C peut être isolé après incubation de la chymotrypsine avec du p-nitrophényltriméthylacétate marqué au 14C en utilisant une chromatographie par filtration sur gel.

Nous avons déjà vu un mécanisme cinétique compatible avec ces idées. Les équations de réaction sont présentées ci-dessous :

Dans cette réaction, un substrat S pourrait interagir avec E pour former un complexe, qui est ensuite clivé en produits P et Q. Q est libéré de l'enzyme, mais P peut rester attaché de manière covalente jusqu'à ce qu'il soit expulsé. Ceci est conforme exactement au mécanisme décrit ci-dessus. Pour le clivage catalysé par la chymotrypsine, l'étape caractérisée par k2 est l'étape d'acylation (avec libération du groupe partant tel que le p-nitrophénol dans le laboratoire 5). L'étape caractérisée par k3 est l'étape de désacylation dans laquelle l'eau attaque l'enzyme acyle pour libérer le produit P (phosphate libre dans Lab 5). En classe et pour les devoirs, vous avez dérivé l'équation suivante :

Équation 7 : v = [(k2k3)/(k2 + k3)]EoS/[Ks(k3)/(k2+k3)] + S

Comme mentionné ci-dessus, pour l'hydrolyse des substrats esters, qui ont de meilleurs groupes partants par rapport aux amides, la désacylation est limitante, ( k3<<k2). Alors l'équation 7 devient

Vm = k3Eo et Km = Ks(k3)/(k2)

Pour l'hydrolyse des amides, comme mentionné ci-dessus, l'acylation peut être limitante (k2<<k3). Alors l'équation 7 devient :

Vm = k2Eo et Km = Ks

Tout comme nous l'avons vu précédemment pour l'hypothèse d'équilibre rapide (lorsque ES se désagrège en E + S plus rapidement qu'il ne se transforme en produit), Km = Ks dans l'hydrolyse de l'amide.

  1. changer le pH ou la force ionique - ce qui peut donner des données sur les acides/bases généraux dans le site actif :
  • un graphique de kcat en fonction du pH indique qu'un groupe de pKa d'env. 6 doit être déprotoné pour exprimer l'activité (c'est-à-dire que Vm/2 est à environ pH 6). Ceci suggère qu'un site actif d'histidine est nécessaire, qui, s'il doit être déprotoné pour exprimer une activité, doit agir comme une base générale.
  • un graphique de kcat/Km montre une courbe en cloche indiquant la nécessité d'une chaîne latérale déprotonée avec un pKa d'environ 6 (c'est-à-dire le même His ci-dessus) et un groupe qui doit être protoné avec un pKa d'environ 10. Cela s'avère être une Ile N terminale (en fait à la position 16 dans le précurseur inactif de la chymotrypsine appelé chymotrypsinogène, qui lors de l'activation du chymotrypsinogène perd les 15 premiers acides aminés par protéolyse sélective), qui doit être protoné pour former un pont salin stabilisant dans la protéine .

Remarque : Un nouveau programme informatique théorique, appelé THEMATICS (courbes de titrage microscopiques théoriques) a été développé pour calculer les courbes de titrage pour tous les groupes ionisables dans une protéine. Lorsqu'ils sont effectués sur des protéines de test, les acides aminés qui présentent des courbes anormales (aplaties par rapport aux courbes de titrage normales) se trouvent généralement dans le site actif de la protéine. Les courbes aplaties montrent que l'acide aminé est partiellement protoné sur une plage de pH plus large que celle théoriquement attendue. Le programme peut être utilisé pour prédire les régions de sites actifs sur des protéines de structure connue mais de fonction inconnue, et sera utile dans le domaine émergent de la protéomique. (figure ci-dessous de Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Numéro 22, 12473-12478, 23 octobre 2001)

Fig. 1. Exemples de courbes de titrage théoriques. Charge nette moyenne prévue en fonction du pH. (A) Tous les résidus histidine de la chaîne A du TIM : His-26 (+), His-95 (�), His-100 (*), His-115 (carré vide), His-185 ( carré plein), His-195 (cercle vide), His-224 (cercle plein) et His-248 (). (B) Résidus tyrosine sélectionnés de AR : Tyr-39 (+), Tyr-48 (�), Tyr-177 (*), Tyr-291 (carré vide) et Tyr-309 (carré plein). (C) Résidus lysine sélectionnés de PMI : Lys-100 (+), Lys-117 (�), Lys-128 (*), Lys-136 (carré vide) et Lys-153 (carré plein). TIM, triosephosphate isomérase AR, aldose réductase PMI, phosphomannose isomérase. N'oubliez pas qu'en fonction du microenvironnement protéique, le pKa d'une chaîne latérale comme Asp peut varier de 0,5 à 9,2 !

  1. l'enzyme - par modification chimique d'acides aminés spécifiques, ou par mutagenèse spécifique à un site :
  1. la modification de la chyrmotrypsine (et de nombreuses autres protéases) avec du diisopropylphosphofluoridate (DIPF) modifie l'un des nombreux résidus Ser (Ser 195), suggérant qu'il est hypernucléophile. et probablement l'acide aminé qui attaque le carbonyle C dans le substrat, formant l'acyl-intermédiaire.

Le malathion et l'éthyl parathion (pesticides à base de phosphate organique) ont des structures et des réactivités similaires à celles du DIPF et inhibent sélectivement les protéases à sérine chez les insectes.

  1. la modification de l'enzyme avec la tos-L-Phe-chlorométhyl cétone inactive l'enzyme avec une stoechiométrie 1:1 qui se traduit par une His modifiée.
  1. la comparaison de la séquence primaire de nombreuses protéases montre que trois résidus sont invariants : Ser 195, His 57, Asp 102.
  2. la mutagenèse site-spécifique montre que si Ser 195 est changé en Ala 195, l'activité enzymatique est presque réduite au bruit de fond.
  • Le His 57 déprotoné agit comme une base générale pour extraire un proton de Ser 195, améliorant sa nucléophilie lorsqu'il attaque le C électrophile de la liaison amide ou ester, créant l'intermédiaire tétraédrique oxyanion. Asp 102 agit électrostatiquement pour stabiliser la charge positive sur le His.
  • L'oxyanion s'effondre pour former une double liaison entre le O et le carbonyle C d'origine, avec le produit amine comme groupe partant. Le His 57 protoné agit comme un acide général donnant un proton au groupe partant de l'amine, régénérant le His 57 non protoné.
  • Le mécanisme se répète seulement maintenant avec l'eau comme nucléophile, qui attaque l'intermédiaire acyl-enzyme, pour former l'intermédiaire tétraédrique.
  • L'intermédiaire s'effondre à nouveau, libérant le E-SerO- en tant que groupe partant qui est reprotoné par His 57, régénérant à la fois His 57 et Ser 195 dans l'état de protonation normal. L'enzyme est maintenant prête pour un autre cycle d'activité catalytique.
  • Le mécanisme de la première attaque nucléophile (par Ser) est le même que pour la seconde (par l'eau). Le mécanisme inverse de condensation de deux peptides serait l'inverse du mécanisme ci-dessus, et est un exemple du principe de réversibilité microscopique.

Bref, tous les mécanismes catalytiques que nous avons rencontrés précédemment sont en jeu dans la catalyse de la chymotrypsine. Ceux-ci incluent la catalyse nucléophile (avec le Ser 195 formant un intermédiaire covalent avec les substrats), la catalyse acide/base générale avec His 57, et plus ou moins, la catalyse électrostatique avec Asp 102 stabilisant non pas l'état de transition ou intermédiaire, mais la forme protonée de His 57 Un point important à noter est que His, en tant que catalyseur acide et basique général, non seulement stabilise les charges en développement dans l'état de transition, mais fournit également une voie pour le transfert de protons, sans laquelle les réactions auraient des difficultés à se dérouler. Un dernier mécanisme est à l'œuvre. L'enzyme se lie en effet plus étroitement à l'état de transition que le substrat. Les structures cristallines avec de mauvais substrats "pseudo" qui sont piégés en tant que substrats partiellement déformés tétraédriquement de l'enzyme et avec des inhibiteurs montrent que l'intermédiaire oxyanion, et donc vraisemblablement le TS, peut former des liaisons H avec l'amide H (de la chaîne principale) de Gly 193 et ​​Ser 195. Ceux-ci ne peuvent pas être fabriqués sur le substrat hybride trigonal sp2. Dans l'enzyme seule, le trou dans lequel l'intermédiaire oxyanion et le TS seraient placés n'est pas occupé. Ce trou d'oxyanion est occupé dans l'intermédiaire tétraédrique.

Jmol : Mise à jour du complexe Chymotrypsine:D-Leu-L-Phe-p-fluorobenzylamde Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Jmol : Mise à jour du complexe inhibiteur de chymotrypine-phényléthylboronate Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

De nombreuses enzymes ont des sérines à site actif qui agissent comme des catalyseurs nucléophiles dans les réactions de substitution nucléophile (généralement l'hydrolyse). L'une de ces enzymes est l'acétylcholine estérase qui clive le neurotransmetteur acétylcholine dans la synapse de la jonction neuromusculaire. L'émetteur entraîne une contraction musculaire lorsqu'il se lie à son récepteur à la surface des cellules musculaires. L'émetteur ne doit pas rester trop longtemps dans la synapse, sinon la contraction musculaire se poursuivra de manière incontrôlée. Pour éviter cela, une enzyme hydrolytique, l'acétylcholine estérase, une sérine estérase présente dans la synapse, clive le transmetteur, à des vitesses proches du contrôle de la diffusion. Le diisopropylphosphofluoridate (DIPF) inhibe également cette enzyme, ce qui en fait un puissant agent de guerre chimique. Un inhibiteur encore plus fluoré de cette enzyme, le sarin, est l'agent chimique létal le plus puissant connu de cette classe. Seulement 1 mg est nécessaire pour tuer un être humain.

Les protéases à sérine ne sont qu'un type d'endoprotéases. Cependant, ils sont extrêmement abondants chez les procaryotes et les eucaryotes. La protéase A, une protéase de type chymotrypine de Stremptomyces griseus, a une séquence primaire très différente de celle de la chymotrypsine, mais sa structure tertiaire globale est assez similaire à celle de la chymotrypsine. Les positions des acides aminés de la triade catalytique dans les séquences primaires de la protéine sont très similaires , indiquant que les gènes des protéines divergeaient d'un gène précurseur commun. En revanche, la subtilisine, une sérine protéase de B. Subtilis, a à la fois une séquence limitée et une homologie de structure tertiaire avec la chymotrypsine. Cependant, une fois plié, il présente également une triade catalytique (Ser 221 - His 64 - Asp 32) similaire à celle de la chymotrypsine (Ser 195 - His 57 - Asp 102).

Jmol : Comparaison mise à jour de la chymotrypine et de la subtilisine Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Les protéases ont de multiples fonctions, autres que la digestion, notamment la dégradation de protéines anciennes ou mal repliées et l'activation de protéines précurseurs (telles que les protéases de coagulation et les protéases impliquées dans la mort cellulaire programmée). En général, quatre classes différentes de protéases ont été trouvées, sur la base des résidus trouvés dans leurs sites actifs. Les protéases peuvent également être des protéines membranaires intégrales et exercer leurs activités dans l'environnement hydrophobe de la membrane. Par exemple, un clivage aberrant de la protéine précurseur amyloïde par la protéase membranaire préséniline peut conduire au développement de la maladie d'Alzheimer.

Classification des protéases

Classe (site actif) Nucléophile de site actif Emplacement Exemples
Sérine/Thréonine Hydrolases Ser/Thr soluble trypsine, chymotrypsine, subtilisine, élastase, enzymes de coagulation, protéasome
membrane Famille rhomboïde
Hydrolases aspartiques H2O activé par 2 Asps soluble pepsine, cathepsine, rénine, protéase du VIH
membrane β-sécrétase (BACE), préséniline I, peptide signal peptidase
Cystéinyl hydrolases Cys soluble bromélaïne, papaïne, cathespsines, caspases
membrane ?
Métallo Hydrolases H2O activé par 1 ou 2 ions métalliques soluble thermolysine, enzyme de conversion de l'angiotensine
membrane Famille S2P
Glutamate Hydrolases glu . équolysines (fongiques)
Asparagine Lysases (EC4) (élimination rx qui sont auto-clivées et donc non catalytiques) Asn . Tsh autotransporteur E. Coli

La β-sécrétase (BACE) est une protéine membranaire qui contient deux résidus Asp nécessaires dans son ectodomaine (domaine extracellulaire) qui sont utilisés dans le premier clivage du domaine N terminal de la protéine précurseur bêta-amyloïde pour libérer un fragment N-terminal soluble d'environ 100 000 MW. La -sécrétase, nécessaire au second clivage qui libère le peptide Aβ est un hétérotétramère composé de préséniline-1, nicastrine, APH-1 et PEN-2, et est localisé dans les membranes plasmiques neurales et le réticulum endoplasmique. Le peptide Aβ se déplace vers le côté extracellulaire de la membrane neurale où il s'agrège. La partie cytoplasmique restante de la protéine précurseur bêta-amyloïde peut réguler la transcription. La sous-unité présénilline a une activité protéasique. La -sécrétase clive également une autre protéine réceptrice de la surface cellulaire, Notch. Lorsque ce récepteur a lié un ligand extracellulaire, la -sécrétase clive Notch dans le cytoplasme et le fragment libéré modifie la transcription du gène. La sous-unité APH-1 semble inhiber l'activité de la préséniline protéase tandis que PEN-2 la favorise. L'inhibition de la -sécrétase serait un traitement efficace pour la maladie d'Alzheimer, mais pourrait avoir des effets secondaires graves puisque le traitement Notch serait également affecté.

Le quatuor de protéines γ-sécrétase et ses rôles dans le développement du cerveau et la maladie d'Alzheimer. La préséniline-1, la nicastrine, l'APH-1 et le PEN-2 forment un complexe fonctionnel de -sécrétase, situé dans la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique (RE) des neurones. Le complexe clive Notch (à gauche) pour générer un fragment (NICD) qui se déplace vers le noyau et régule l'expression des gènes impliqués dans le développement du cerveau et la plasticité neuronale adulte. Le complexe aide également à générer le peptide-peptide amyloïde (centre Aβ). Cela implique un clivage initial de la protéine précurseur amyloïde (APP) par une enzyme appelée BACE (ou β-sécrétase). La -sécrétase libère alors Aβ, ainsi qu'un fragment cytoplasmique APP, qui peut se déplacer vers le noyau et réguler l'expression des gènes. Les mutations de la préséniline-1 qui provoquent l'apparition précoce de la maladie d'Alzheimer augmentent l'activité de la γ-sécrétase et la production d'Aβ, et perturbent également l'équilibre calcique du RE. La dégénérescence neuronale qui en résulte peut résulter d'un stress oxydatif associé à la membrane, induit par l'agrégation de formes d'Aβ (qui créent des plaques d'Aβ) et par l'équilibre calcique perturbé. Réimprimé avec la permission de Nature : Mattson, M. Nature. 422, 385-387 (2003)

Comment la protéase membranaire intégrale catalyse l'hydrolyse (en utilisant l'eau) des domaines transmembranaires dans les protéines, étant donné l'environnement hydrophobe de la bicouche ? La classe rhomboïde des protéases membranaires, que l'on trouve dans les cellules procaryotes et eucaryotes, est l'une des protéines membranaires les plus conservées dans la nature. La comparaison de séquences de protéines rhomboïdes montre un résidu de sérine catalytique possible qui est enfoui à la même profondeur dans la bicouche que le site de clivage pour les substrats de protéines rhomboïdes. De plus, les protéases partagent des acides aminés conservés similaires à la triade catalytique des protéases à sérine solubles, l'acide aminé critique étant localisé sur différentes régions transmembranaires de la protéine. Les acides aminés de la triade membranaire sont Ser, His et Asn (au lieu de Asp comme dans les sérine protéases classiques). Les inhibiteurs classiques de la protéase à sérine empêchent le clivage des substrats protéiques membranaires, mais étant donné la difficulté de reconstituer une protéine rhomboïde purifiée fonctionnelle in vitro, l'identité d'acides aminés spécifiques dans le mécanisme catalytique est actuellement inférentielle.

Les diagrammes de roue hélicoïdale des domaines transmembranaires putatifs des rhomboïdes (déterminés par des tracés d'hydropathie) montrent que plusieurs sont amphiphiles. Cela pourrait permettre à l'eau, nécessaire à l'hydrolyse, d'entrer dans le site actif catalytique de l'enzyme, bien que, comme cela a été noté précédemment, l'eau ait une perméabilité raisonnablement élevée à travers une bicouche membranaire. La principale exigence pour les substrats protéiques des rhomboïdes est la présence d'un domaine transmembranaire dans la protéine cible. Aucune séquence d'acides aminés spécifique ne semble être requise pour la spécificité d'un substrat particulier, la protéine transmembranaire de drosophile spitz trouvée dans les membranes de Golgi. Lors du clivage de cette protéine, la partie restante de la protéine est libérée sous forme de protéine hydrosoluble dans la lumière de l'appareil de Golgi où elle peut éventuellement être libérée de la cellule. Le fragment de protéine soluble qui est libéré de la cellule contient un domaine de facteur de croissance épidermique.

Récemment, la structure d'une protéase rhomboïde, GlpG, d'E. Coli, a été déterminée. Cette protéine transmembranaire possède 6 hélices transmembranaires. L'enzyme possède un site actif polaire au fond d'une ouverture en V située latéralement dans la membrane. Les résidus His et Asn du site actif et de nombreuses molécules d'eau se trouvent profondément dans cette fente en forme de V bien en dessous de la surface de la membrane. L'accès au brin transmembranaire du substrat protéique est bloqué par une boucle, qui doit être fermée pour permettre l'accès au substrat entre l'espace en forme de V entre les hélices S1 et S3. Ser 201 (nucléophile) et His 254 (base générale/acide) sont essentiels à l'activité.

Jmol : mise à jour de la protéase intramembranaire rhomboïde Jmol14 de E. Coli GlpG (Java) | JSMol (HTML5)

B5. Activation de la protéase et le protéasome

Les protéases sont potentiellement dangereuses si leur activité n'est pas réglementée. Une méthode courante pour éviter une activité protéasique indésirable consiste à activer l'enzyme à partir d'un précurseur inactif appelé zymogène. Le précurseur est souvent appelé proenyzme. Une protéolyse limitée mais régulée de la proenzyme soit par une protéase différente soit par autoprotéolyse conduit à l'activation de l'activité protéolytique du zymogène. Un exemple important est l'activation de procaspases en caspases actives, qui sont des protéases à cystéine activées par le calcium qui sont des homodimères. L'activation des caspases initie la mort cellulaire programmée. Les cellules cancéreuses qui sont immortelles ont trouvé des moyens d'inhiber l'activation de la procaspase. Par conséquent, une éventuelle thérapie anticancéreuse pourrait impliquer une activation médicamenteuse des procaspases. Wolan et ont utilisé un criblage à haut débit pour identifier les composés qui favorisent l'activation de la procaspase-3 dans des conditions et des concentrations physiologiques. Une douzaine de composés se sont avérés favoriser une telle activité, et leur capacité à activer d'autres enzymes similaires dans la famille des procaspases a été explorée. Les caspases actives semblent être en équilibre entre un état actif et un état inactif plus similaire au zymogène inactif. Un petit médicament qui se lie préférentiellement à l'état actif déplacerait l'équilibre de l'état inactif à l'état actif. De même, il pourrait se lier au zymogène inactif et favoriser une conformation "active" du zymogène conduisant à l'activation réelle du zymogène par autoprotéolyse. Wolan et al ont découvert que la procaspase était capable de subir un changement de conformation avec l'ajout d'un activateur de petite molécule spécifique (appelé 1541) qui a rendu la conformation « active (active) » plus probable et a donc encouragé l'auto-activation.

Les protéases se trouvent à la fois dans les emplacements extracellulaires (tractus digestif, sang, matrice extracellulaire), membranaire et intracellulaire. Comme mentionné précédemment, un rôle des proteases intracellulaires est de dégrader les protéines "plus anciennes" et chimiquement endommagées. L'une des principales protéases impliquées dans une telle protéolyse intracellulaire est le grand complexe protéique appelé protéasome. Il se compose de trois grandes structures

un complexe 20S de 700 000 MW qui contient 14 sous-unités différentes disposées en 4 anneaux de 7 sous-unités (2 exemplaires de chaque sous-unité). Les anneaux sont empilés les uns sur les autres. Les deux anneaux extérieurs contiennent sous-unités tandis que les deux du milieu contiennent β sous-unités. Le clivage dépendant de l'ATP des substrats protéiques se produit au sein du complexe, avec des groupes N terminaux Ser ou Thr OH agissant comme nucléophiles.

deux complexes 19S qui coiffent les deux extrémités du complexe 20S (un peu comme la structure du complexe chaperon E. Coli GroEL/ES.

Les protéines destinées au clivage par le protéasome doivent d'abord être modifiées chimiquement par l'attachement de multiples copies de la protéine ubiquitine de 8 500 MW, une protéine hautement conservée trouvée ubiquitairement chez les eucaryotes. (Nous avons modélisé cette protéine dans le premier laboratoire en utilisant VMD et NAMD.) Le groupe carboxyle du résidu Gly C-terminal de l'ubiquitine forme un lien amide avec le groupe amine de la chaîne latérale des résidus Lys dans la protéine ciblée pour la dégradation. La liaison résultante est une liaison isopeptidique puisque la terminaison N de la protéine cible n'est pas utilisée dans la liaison amide. Trois protéines différentes sont impliquées dans l'ubiqutinylation de la protéine cible, notamment E1 (enzyme d'activation de l'ubiquitine qui nécessite de l'ATP), E2 (enzyme de conjugaison de l'ubiquitine) et E3 (ubiquitine-protéine lyase). Une fois attachée, une chaîne latérale Lys d'ubiquitine peut former une autre liaison isopeptidique à un groupe carboxyle C-terminal d'une autre ubiquitine, formant une chaîne d'ubiquitine en croissance sur la protéine cible. Les protéines avec 4 ubiquitines liées ou plus sont de meilleurs substrats pour le protéasome. Les protéines à demi-vie courte (celles avec certains acides aminés amino-terminaux comme l'arginine ou la leucine, ou enrichies en Pro (P), Glu (E), Ser (S) et Thr (T) - (PEST) semblent être meilleures cibles pour la voie de l'ubiquitine et la dégradation subséquente par le protéasome.

L'activité du protéasome est intimement liée à la santé et à la maladie. Le protéasome joue un rôle majeur dans la reconnaissance immunitaire du soi et du non-soi. Le système immunitaire doit être capable de reconnaître une cellule infectée par un virus ou tumorale (les deux auto-cellules exprimant des protéines étrangères ou aberrantes) ainsi que des cellules étrangères telles que des bactéries, qui peuvent être englouties par des cellules immunitaires telles que des macrophages. L'implication du protéasome se produit lorsque des protéines virales, tumorales ou bactériennes sont dégradées en peptides courts, qui se lient aux protéines intercellulaires d'histocompatibilité majeure (MHC) et sont transloquées vers la membrane cellulaire. Les complexes peptide/CMH sont affichés à la surface des cellules et sont reconnus par les récepteurs des cellules immunitaires (en particulier les cellules T). Les cellules du soi ne sont pas reconnues par les cellules T puisque les peptides du complexe peptide:CMH sont des peptides du soi dérivés de protéines normales. Le récepteur des cellules T reconnaît des déterminants à la fois sur la protéine MHC et sur le peptide présenté.

La non-reconnaissance des complexes self peptide:MHC empêche le système immunitaire de cibler les cellules saines normales. Les maladies auto-immunes surviennent lorsque le récepteur des cellules T reconnaît les peptides du soi présentés.

Les voies ubiquitine/protéasome ont été liées à la manifestation de la maladie dans de nombreuses maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington (qui implique le repliement aberrant de la protéine de Huntington qui contient un domaine poly-Glu étendu) et la maladie de Parkinson. La voie de dégradation est impliquée dans de nombreuses autres fonctions cellulaires normales, notamment la transcription des gènes et la mort cellulaire programmée.

Jmol : Mise à jour du protéasome de mammifère - (1IRU) Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

B6. Mouvement et catalyse enzymatique

Benkovic et Hammes-Schiffer ont proposé un examen approfondi des méthodes utilisées par les enzymes en catalyse. Ils ont divisé leur analyse en un cadre biochimique et théorique. D'un point de vue biochimique, on pensait que la catalyse enzymatique résultait de la liaison du substrat suivie de l'activation du substrat par l'enzyme. Le substrat peut se lier dans une conformation particulièrement réactive d'une manière verrouillée, ou être déformé par l'enzyme lors de la liaison, le rendant plus susceptible de créer/casser des liaisons. Dans un diagramme d'énergie pour ce dernier cas, le substrat déformé lié a une énergie plus élevée que le substrat libre et est un exemple de déstabilisation du substrat (état fondamental). Avec les travaux théoriques de Pauling et le développement d'anticorps catalytiques par Lerner, l'idée que l'enzyme fonctionne en liant l'état de transition avec une affinité plus élevée que le substrat est devenue acceptée. Des preuves d'une liaison plus étroite à l'état de transition ont été trouvées pour les protéases à sérine (par la stabilisation de l'intermédiaire tétraédrique oxyaninon) et le lysozyme (par la stabilisation de l'ion oxocarbénium en développement (charge positive) par les résidus Asp et Glu adjacents (les deux étant décrits ci-dessus). des augmentations de l'hydrolyse catalytique des phosphoesters et des diesters de 1015 à 1017 par certaines phosphatases et nucléases par rapport à l'hydrolyse spontanée non catalysée dans des solutions aqueuses sont connues. En supposant que le rapport de la vitesse catalysée à faible S (kcat/Km avec des unités de M-1s -1) versus le taux non catalysé (pseudo premier ordre avec l'utilisation de s-1) donne une mesure de la concentration efficace de substrat dans le taux non catalysé qui donnerait le même taux que le taux catalysé, les concentrations efficaces atteignent 1024 pour enzymes comme l'acide orotique décarboxylase. Quelle est la source de ce pouvoir catalytique? De nombreuses preuves ont été accumulées pour partager la catalyse en contrib utions de la catalyse acide/base générale, de la catalyse nucléophile et électrostatique, ainsi que des effets de liaison qui améliorent la catalyse. Les effets des solvants montrent également que pour certaines réactions, la solvatation ralentit la réaction, ce qui implique que la désolvatation du substrat pendant la liaison substrat-enzyme affecte la vitesse de réaction. N'oubliez pas que le site actif du complexe E-S est dépourvu de la plupart des molécules d'eau présentes dans l'enzyme libre. Enfin, l'enzyme peut avoir le cadre 3D correct qui positionne toutes les chaînes latérales impliquées dans la liaison en catalyse dans des positions optimales, ce qui peut avoir pour effet de sélectionner uniquement les conformations catalytiquement compétentes du substrat (c'est-à-dire celles qui ressemblent le plus à l'état de transition). Ces contributions suggèrent que le mouvement des résidus critiques dans le site actif est nécessaire, ce qui positionne le substrat et les résidus catalytiques dans des positions optimales pour la catalyse. Les types de mouvements (qui peuvent être modélisés dans des simulations de dynamique moléculaire) sont décrits dans le tableau ci-dessous.

Mouvement Environ. Échelle de temps - log(s)
vibration de liaison -14 à -13
transfert de protons -12
liaison hydrogène -12 à -11
vibration élastique de la région globulaire -12 à -11
repulpage de sucre -12 à -9
rotation des chaînes latérales à la surface -11 à -10
libration torsionnelle du groupe enterré -11 à -9
flexion des charnières aux interfaces de domaine -11 à -7
réorganisation de la structure de l'eau -8
rupture/formation d'hélice -8 à -7
transitions allostériques -5 à 0
dénaturation locale -5 à 1
rotation des chaînes latérales intérieures de taille moyenne -4 à 0

de Benkovic, S et Hammes-Schiffer, S. Science. 301, page 1197 (2003)

Warshel soutient que la stabilisation électrostatique de l'état de transition est le mécanisme prédominant pour une liaison plus étroite de l'état de transition que le substrat à l'enzyme. Des interactions hydrophobes faciliteraient une bonne orientation du substrat/état de transition dans la poche de site actif, qui est en effet préorganisée par la structure de l'enzyme. D'autres ont fait valoir que l'effet tunnel quantique (d'hydrures, de protons ou d'électrons) est un mécanisme principal pour surmonter les barrières énergétiques dans les réactions catalysées par des enzymes. En utilisant des simulations de dynamique théorique et moléculaire, Gao et al soutiennent que l'effet tunnel, un moyen de surmonter les barrières énergétiques classiques, joue un rôle beaucoup plus petit que la réduction de la hauteur de la barrière (énergie d'activation). Warshel note que des effets tunnel peuvent également se produire en solution en l'absence d'enzyme, ce qui rend d'autant plus important la comparaison des mécanismes de réaction en présence et en l'absence d'enzyme. Pourtant, les mouvements des protéines qui déplacent les chaînes latérales catalytiquement importantes vers l'état substrat/transition peuvent permettre à la fois une stabilisation électrostatique préférentielle de l'état de transition et un effet tunnel quantique. Encore une autre idée stipule que les enzymes doivent créer de nouvelles liaisons au substrat/état de transition qui ne pourraient pas être disponibles en l'absence de l'enzyme. Un tel type de liaison est une liaison hydrogène à faible barrière, dans laquelle un hydrogène sur un atome électronégatif est impliqué dans des liaisons H fortes vers deux accepteurs de liaisons hydrogène différents simultanément. Enfin, le substrat peut adopter des conformations de quasi-attaque (NAC), qui se rapprochent davantage de l'état de transition lié, et c'est la liaison de la NAC à l'enzyme, sans abaisser l'énergie d'activation, qui contribue à l'amélioration de la vitesse catalysée par l'enzyme.

L'Enzyme Function Initiative développe de tels outils pour prédire les fonctions enzymatiques in vitro et physiologiques in vivo d'enzymes inconnues.

Uniprot, une base de ressources Web contenant des informations sur les séquences protéiques et fonctionnelles, compte plus de 44 millions de séquences protéiques (dérivées de séquences nucléotidiques) et la plupart n'ont pas de fonction protéique bien définie.

Docker métabolique : utilise l'amarrage moléculaire comme base pour prédire la fonction des enzymes. Il prend en charge l'amarrage à la fois de l'état fondamental et des formes intermédiaires à haute énergie de métabolites et de composés disponibles dans le commerce aux structures protéiques

Les trois enzymes étudiées ci-dessus sont toutes des hydrolases - des enzymes qui catalysent l'hydrolyse des liaisons (amide ou acétal). Il ne s'agit que d'une classe de six types de réaction différents qui ont été classés par la Commission des enzymes de l'Union internationale de biochimie et de biologie moléculaire. Les six types (tous des liens externes) comprennent :

EC1 : Oxidioréductases - réactions d'oxydation/réduction (nous en discuterons au chapitre 8B)

EC2 : Transférases - acyle, glycosyle, 1C, N, O, aldéhydes, cétones, etc.

EC4 : Lyases - clivage des liaisons C-C, C-O, C-N, C-S, etc.

EC5 : Isomérases - racémases, épimérases, isomérases cis-trans

Enzyme Nomenclature Database : Site interactif pour rechercher des informations sur les enzymes à l'aide du système de nomenclature CE.

BRENDA : (Brauschweig Enzyme Database) Système d'information complet sur les enzymes

CHEMIN KEGG : collection de cartes de voies dessinées manuellement représentant nos connaissances sur les réseaux d'interaction et de réaction moléculaires à l'aide de KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

F MM (From Metabolite to Metabolite) - reconstruit les voies métaboliques d'un métabolite à un autre

  1. Wolan, D. et al. Activateurs à petites molécules d'une proenzyme. Sciences 326, 853 (2009)
  2. Wang, Y. et al. Structure cristalline d'une protéase intramembranaire de la famille des rhomboïdes. La nature. 444, 179 (2006)
  3. Freeman, M. Protéolyse dans la membrane : les rhomboïdes révélés. Revues de la nature : biologie cellulaire moléculaire. 5, p 188 (2004)
  4. Borman, S. Beaucoup de bruit sur les mécanismes enzymatiques. C&FR. page 35 (23 février 2004)
  5. Garcia-Cioloca, M. Goa, J., Karplus, M. et Truhlar, D. Comment fonctionnent les enzymes : analyse par la théorie des taux modernes et la simulation par ordinateur Science. 303, page 186 (2004)
  6. Benkovic, St. & Hammes-Schiffer, S. Une perspective sur la catalyse enzymatique. Science. 301, page 1196 (2003)
  7. Takasugi, N. et al. Le rôle des cofacteurs de la préséniline dans le complexe γ-sécrétase. La nature. 422, page 438 (2003)
  8. Weihofen et al. Identification de Signal Peptide Peptidase, une protéase aspartique de type préséniline. Science, 296, p. 2156, 2215,
  9. Vocadlo. D. et al. La catalyse par le lysozyme de blanc d'œuf de poule passe par un intermédiaire covalent. La nature. 412. page 835 (2001)
  10. Walsh, C. Permettre la chimie de la vie. Excellent article de synthèse sur les mécanismes des enzymes. La nature. 409, page 226 (2001)
  11. Koeller et Wong. Enzymes pour la synthèse chimique. Nature 409. p. 232 (2001)
  12. Simeonov et al. Anticorps bleu-fluorescent. Science. 290, pages 286, 307 (2000)
  13. Huntington et al. La structure d'un complexe serpine-protéase montre une inhibition par déformation. La nature. 407, page 923 (2000)
  14. Nouvelle façon d'étudier les protéines étroitement apparentées (protéines de remodelage pour les rendre plus sensibles à l'inhibition) Science 289. pg 2029 (2000)
  15. Vocadlo et al. La catalyse par le lysozyme de blanc d'œuf de poule passe par un intermédiaire covalent. La nature. 412. page 835 (2001)
  16. Istan et Deisenhofer. Mécanisme structurel pour l'inhibition des statines de la HMG-CoA réductase. Science. 292, page 1160 (2001)
  17. Heine et al. Observations d'intermédiaires covalents dans un mécanisme enzymatique à résolution atomique. Science 294. page 369 (2001)
  18. Carpenter et al. La structure de la déshydorquinate synthase révèle un site actif capable de catalyse en plusieurs étapes. La nature. 394, page 299 (1998)
  19. Kohen et al. Tunnel Vision (sur les raisons pour lesquelles l'activité des enzymes thermophiles (>60oC) est faible ou absente aux températures mésophiles (< 40oC) - de la réduction de la flexibilité des enzymes thermophiles aux températures mésophiles - explication de l'effet tunnel quantique). La nature. 399, pages 417, 496 (1999)
  20. Finnin et al. Structure d'un homologue d'histone désacétylase lié aux inhibiteurs de la TSA et de la SAHA (et mécanisme). La nature. page 189, septembre 1999.
  21. Ondrechen. THÉMATIQUES : Un simple prédicteur informatique de la fonction enzymatique à partir de la structure. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis, 98, page 12473 (2001)

Version archivée du chapitre 7B complet : Mécanismes de la catalyse des enzymes

/>
Biochemistry Online par Henry Jakubowski est sous licence Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.


Contenu

Avant la découverte des ribozymes, les enzymes, qui sont définies comme des protéines catalytiques, [7] étaient les seuls catalyseurs biologiques connus. En 1967, Carl Woese, Francis Crick et Leslie Orgel ont été les premiers à suggérer que l'ARN pourrait agir comme un catalyseur. Cette idée était basée sur la découverte que l'ARN peut former des structures secondaires complexes. [8] Ces ribozymes ont été trouvés dans l'intron d'un transcrit d'ARN, qui s'est retiré du transcrit, ainsi que dans le composant ARN du complexe RNase P, qui est impliqué dans la maturation des pré-ARNt. En 1989, Thomas R. Cech et Sidney Altman se sont partagé le prix Nobel de chimie pour leur « découverte des propriétés catalytiques de l'ARN ». [9] Le terme ribozyme a été introduit pour la première fois par Kelly Kruger et al. en 1982 dans un article publié dans Cellule. [1]

C'était une croyance fermement établie en biologie que la catalyse était réservée aux protéines.Cependant, l'idée de la catalyse par ARN est motivée en partie par la vieille question concernant l'origine de la vie : laquelle vient en premier, les enzymes qui font le travail de la cellule ou les acides nucléiques qui transportent l'information nécessaire pour produire les enzymes ? Le concept d'"acides ribonucléiques comme catalyseurs" contourne ce problème. L'ARN, par essence, peut être à la fois la poule et l'œuf. [dix]

Dans les années 1980, Thomas Cech, à l'Université du Colorado à Boulder, étudiait l'excision d'introns dans un gène d'ARN ribosomique dans Tetrahymena thermophila. En essayant de purifier l'enzyme responsable de la réaction d'épissage, il a découvert que l'intron pouvait être épissé en l'absence de tout extrait cellulaire ajouté. Malgré tous leurs efforts, Cech et ses collègues n'ont pu identifier aucune protéine associée à la réaction d'épissage. Après de nombreux travaux, Cech a proposé que la partie de séquence d'intron de l'ARN puisse rompre et reformer les liaisons phosphodiester. À peu près au même moment, Sidney Altman, professeur à l'université de Yale, étudiait la façon dont les molécules d'ARNt sont traitées dans la cellule lorsque lui et ses collègues ont isolé une enzyme appelée RNase-P, qui est responsable de la conversion d'un précurseur d'ARNt en ARNt actif. À leur grande surprise, ils ont découvert que la RNase-P contenait de l'ARN en plus des protéines et que l'ARN était un composant essentiel de l'enzyme active. C'était une idée tellement étrangère qu'ils ont eu du mal à publier leurs découvertes. L'année suivante, Altman a démontré que l'ARN peut agir comme un catalyseur en montrant que la sous-unité d'ARN RNase-P pouvait catalyser le clivage de l'ARNt précurseur en ARNt actif en l'absence de tout composant protéique.

Depuis la découverte de Cech et Altman, d'autres chercheurs ont découvert d'autres exemples d'ARN auto-clivant ou de molécules d'ARN catalytique. De nombreux ribozymes ont un centre actif en épingle à cheveux ou en tête de marteau et une structure secondaire unique qui leur permet de cliver d'autres molécules d'ARN à des séquences spécifiques. Il est maintenant possible de fabriquer des ribozymes qui cliver spécifiquement n'importe quelle molécule d'ARN. Ces catalyseurs d'ARN peuvent avoir des applications pharmaceutiques. Par exemple, un ribozyme a été conçu pour cliver l'ARN du VIH. Si un tel ribozyme était fabriqué par une cellule, toutes les particules virales entrantes verraient leur génome d'ARN clivé par le ribozyme, ce qui empêcherait l'infection.

Bien qu'ils n'aient que quatre choix pour chaque unité monomère (nucléotides), par rapport aux 20 chaînes latérales d'acides aminés trouvées dans les protéines, les ribozymes ont des structures et des mécanismes divers. Dans de nombreux cas, ils sont capables d'imiter le mécanisme utilisé par leurs homologues protéiques. Par exemple, dans les ARN de ribozymes auto-clivants, une réaction SN2 en ligne est effectuée en utilisant le groupe hydroxyle 2' comme nucléophile attaquant le phosphate de pontage et faisant en sorte que l'oxygène 5' de la base N+1 agisse comme un groupe partant. En comparaison, la RNase A, une protéine qui catalyse la même réaction, utilise une coordination histidine et lysine pour agir comme base pour attaquer le squelette phosphate. [2] [ éclaircissements nécessaires ]

Comme de nombreuses enzymes protéiques, la liaison aux métaux est également essentielle au fonctionnement de nombreux ribozymes. [11] Souvent, ces interactions utilisent à la fois le squelette phosphate et la base du nucléotide, provoquant des changements conformationnels drastiques. [12] Il existe deux classes de mécanismes pour le clivage du squelette phosphodiester en présence de métal. Dans le premier mécanisme, le groupe interne 2'-OH attaque le centre du phosphore dans un SN2 mécanisme. Les ions métalliques favorisent cette réaction en coordonnant d'abord l'oxygène du phosphate puis en stabilisant l'oxyanion. Le deuxième mécanisme suit également un SN2 déplacement, mais le nucléophile provient de l'eau ou de groupes hydroxyles exogènes plutôt que de l'ARN lui-même. Le plus petit ribozyme est UUU, qui peut favoriser le clivage entre G et A du tétranucléotide GAAA via le premier mécanisme en présence de Mn 2+ . La raison pour laquelle ce trinucléotide plutôt que le tétramère complémentaire catalyse cette réaction peut être parce que l'appariement UUU-AAA est le trinucléotide le plus faible et le plus flexible parmi les 64 conformations, qui fournit le site de liaison pour Mn2+. [13]

Le transfert de phosphoryle peut également être catalysé sans ions métalliques. Par exemple, la ribonucléase A pancréatique et les ribozymes du virus de l'hépatite delta (HDV) peuvent catalyser le clivage du squelette de l'ARN par catalyse acide-base sans ions métalliques. [14] [15] Le ribozyme en épingle à cheveux peut aussi catalyser l'auto-clivage de l'ARN sans ions métalliques, mais le mécanisme n'est toujours pas clair. [15]

Le ribozyme peut également catalyser la formation d'une liaison peptidique entre les acides aminés adjacents en abaissant l'entropie d'activation. [14]

Bien que les ribozymes soient assez rares dans la plupart des cellules, leurs rôles sont parfois essentiels à la vie. Par exemple, la partie fonctionnelle du ribosome, la machine biologique qui traduit l'ARN en protéines, est fondamentalement un ribozyme, composé de motifs structuraux tertiaires d'ARN qui sont souvent coordonnés à des ions métalliques tels que Mg 2+ en tant que cofacteurs. [16] Dans un système modèle, il n'y a aucune exigence pour les cations divalents dans un ARN catalysant à cinq nucléotides trans-phénylalanation d'un substrat à quatre nucléotides avec 3 paires de bases complémentaires du catalyseur, où le catalyseur/substrat a été conçu par troncature du ribozyme C3. [17]

Les ribozymes les mieux étudiés sont probablement ceux qui se coupent eux-mêmes ou d'autres ARN, comme dans la découverte originale de Cech [18] et Altman. [19] Cependant, les ribozymes peuvent être conçus pour catalyser une gamme de réactions (voir ci-dessous), dont beaucoup peuvent se produire dans la vie mais n'ont pas été découvertes dans les cellules. [20]

L'ARN peut catalyser le repliement de la conformation protéique pathologique d'un prion d'une manière similaire à celle d'une chaperonine. [21]

L'ARN peut également agir comme une molécule héréditaire, ce qui a encouragé Walter Gilbert à proposer que dans un passé lointain, la cellule utilisait l'ARN à la fois comme matériel génétique et comme molécule structurelle et catalytique plutôt que de diviser ces fonctions entre l'ADN et la protéine comme elles le sont aujourd'hui. L'hypothèse est connue sous le nom d'« hypothèse du monde de l'ARN » de l'origine de la vie. [22] Étant donné que les nucléotides et l'ARN et donc les ribozymes peuvent provenir de produits chimiques inorganiques, ils sont candidats pour les premières enzymes, et en fait, les premiers "réplicateurs", c'est-à-dire des macromolécules contenant des informations qui se répliquent. Un exemple d'un ribozyme auto-répliquant qui ligature deux substrats pour générer une copie exacte de lui-même a été décrit en 2002. [23] La découverte de l'activité catalytique de l'ARN a résolu le paradoxe "poulet et œuf" de l'origine de la vie, problème de l'origine du dogme central des peptides et des acides nucléiques. Selon ce scénario, au tout début de la vie, toute l'activité enzymatique et le codage de l'information génétique étaient effectués par une seule molécule, l'ARN.

Depuis la découverte des ribozymes qui existent dans les organismes vivants, il y a eu un intérêt pour l'étude de nouveaux ribozymes synthétiques fabriqués en laboratoire. Par exemple, des ARN auto-clivants produits artificiellement qui ont une bonne activité enzymatique ont été produits. Tang et Breaker [24] ont isolé des ARN auto-clivants par sélection in vitro d'ARN provenant d'ARN à séquence aléatoire. Certains des ribozymes synthétiques produits avaient de nouvelles structures, tandis que d'autres étaient similaires au ribozyme en tête de marteau d'origine naturelle. En 2015, des chercheurs de la Northwestern University et de l'Université de l'Illinois à Chicago ont conçu un ribosome captif qui fonctionne presque aussi bien que le composant cellulaire authentique qui produit toutes les protéines et enzymes dans la cellule. Appelé Ribosome-T, ou Ribo-T, le ribosome artificiel a été créé par Michael Jewett et Alexander Mankin. [25] Les techniques utilisées pour créer des ribozymes artificiels impliquent une évolution dirigée. Cette approche tire parti de la double nature de l'ARN en tant que catalyseur et polymère informationnel, ce qui permet à un chercheur de produire facilement de vastes populations de catalyseurs d'ARN à l'aide d'enzymes polymérases. Les ribozymes sont mutés par transcription inverse avec une transcriptase inverse dans divers ADNc et amplifiés avec une PCR sujette aux erreurs. Les paramètres de sélection dans ces expériences diffèrent souvent. Une approche pour sélectionner un ribozyme de ligase consiste à utiliser des marqueurs de biotine, qui sont liés de manière covalente au substrat. Si une molécule possède l'activité ligase souhaitée, une matrice de streptavidine peut être utilisée pour récupérer les molécules actives.

Lincoln et Joyce ont développé un système enzymatique à ARN capable de s'auto-répliquer en une heure environ. En utilisant la compétition moléculaire (in vitro évolution) d'un mélange d'ARN candidat, une paire de ribozymes a émergé, dans laquelle chacun synthétise l'autre en joignant des oligonucléotides synthétiques, sans protéine présente. [26]

Bien qu'il ne s'agisse pas de véritables catalyseurs, la création de riboswitchs artificiels auto-clivants, appelés aptazymes, a également été un domaine de recherche actif. Les riboswitches sont des motifs d'ARN régulateurs qui modifient leur structure en réponse à un petit ligand moléculaire pour réguler la traduction. Bien qu'il existe de nombreux riboswitchs naturels connus qui se lient à un large éventail de métabolites et d'autres petites molécules organiques, un seul ribozyme basé sur un riboswitch a été décrit, glmS. [27] Les premiers travaux de caractérisation des riboswitchs auto-clivants se sont concentrés sur l'utilisation de la théophylline comme ligand. Dans ces études, une épingle à cheveux d'ARN est formée qui bloque le site de liaison du ribosome, inhibant ainsi la traduction. En présence du ligand, dans ces cas la théophylline, la région d'ARN régulatrice est clivée, permettant au ribosome de se lier et de traduire le gène cible. Une grande partie de ce travail d'ingénierie de l'ARN était basée sur une conception rationnelle et des structures d'ARN préalablement déterminées plutôt que sur une évolution dirigée comme dans les exemples ci-dessus. Des travaux plus récents ont élargi les ligands utilisés dans les ribozymes riboswitches pour inclure le pyrophosphate de thymine (2). Le tri cellulaire activé par fluorescence a également été utilisé pour concevoir des aptazymes. [28]

ARN polymérase ribozyme Modifier

On pense que la vie moderne, basée en grande partie sur l'ADN comme matériel génétique, est issue d'organismes à base d'ARN dans un monde d'ARN antérieur. La vie de l'ARN aurait dépendu d'un ribozyme d'ARN polymérase ARN-dépendant pour copier des molécules d'ARN fonctionnelles, y compris la copie de la polymérase elle-même. Tjhung et al. [29] ont obtenu un ribozyme d'ARN polymérase par in vitro évolution qui a un niveau d'activité sans précédent dans la copie de molécules d'ARN complexes. Cependant, ce ribozyme est incapable de se copier et ses produits d'ARN ont un taux de mutation élevé. Néanmoins, des progrès continuent d'être accomplis vers l'objectif d'obtenir, en in vitro evolution, un ribozyme d'ARN polymérase auto-reproductible précis et efficace afin d'améliorer la compréhension de l'évolution précoce de la vie.

Samanta et Joyce [30] ont découvert qu'un ribozyme d'ARN polymérase hautement évolué était capable de fonctionner comme une transcriptase inverse, c'est-à-dire qu'il pouvait synthétiser une copie d'ADN à l'aide d'une matrice d'ARN. Une telle activité est considérée comme cruciale pour la transition des génomes à ARN à ADN au début de l'histoire de la vie sur terre. La capacité de transcription inverse pourrait avoir surgi en tant que fonction secondaire d'un ribozyme d'ARN polymérase ARN-dépendant précoce.

Les ribozymes ont été proposés et développés pour le traitement de maladies par thérapie génique (3). L'un des principaux défis de l'utilisation d'enzymes à base d'ARN en tant que thérapeutique est la courte demi-vie des molécules d'ARN catalytiques dans le corps. Pour lutter contre cela, la position 2' sur le ribose est modifiée pour améliorer la stabilité de l'ARN. Un domaine de la thérapie génique par ribozyme a été l'inhibition des virus à base d'ARN.

Un type de ribozyme synthétique dirigé contre l'ARN du VIH appelé cisaillement de gènes a été développé et a fait l'objet d'essais cliniques pour l'infection par le VIH. [31] [32]

De même, des ribozymes ont été conçus pour cibler l'ARN du virus de l'hépatite C, le coronavirus du SRAS (SARS-CoV), [33] l'adénovirus [33] et l'ARN des virus de la grippe A et B. [34] [35] [36] [33] Le ribozyme est capable de cliver les régions conservées du génome du virus, ce qui s'est avéré réduire le virus dans la culture de cellules de mammifères. [37] Malgré ces efforts des chercheurs, ces projets sont restés au stade préclinique.


Couplage entre les mouvements de la boucle catalytique et la dynamique globale des enzymes

Les mouvements de boucle catalytique facilitent la reconnaissance du substrat et la liaison dans de nombreuses enzymes. Bien que ces mouvements semblent être très flexibles, leur signification fonctionnelle suggère que les préférences codées par la structure peuvent jouer un rôle dans la sélection de mécanismes particuliers de mouvements. Nous avons réalisé une étude approfondie sur un ensemble d'enzymes pour évaluer si la dynamique collective/globale, telle que prédite par les modèles de réseaux élastiques (ENM), facilite ou même définit les mouvements locaux subis par les boucles fonctionnelles. Notre ensemble de données comprend un total de 117 structures cristallines pour dix enzymes de différentes tailles et états d'oligomérisation. Chaque enzyme contient une boucle fonctionnelle/catalytique spécifique (10-21 résidus de long) qui se referme sur le site actif pendant la catalyse. L'analyse en composantes principales (ACP) des structures cristallines disponibles (y compris les formes liées à l'apo et au ligand) pour chaque enzyme a révélé les changements conformationnels dominants qui se produisent dans ces boucles lors de la liaison au substrat. Ces reconfigurations de boucle observées expérimentalement se sont révélées être principalement entraînées par des modes de mouvement énergétiquement favorisés intrinsèquement accessibles à l'enzyme en l'absence de son substrat. L'analyse suggère que les modes globaux robustes définis de manière coopérative par l'architecture globale de l'enzyme impliquent également des composants locaux qui aident à l'ouverture/fermeture appropriée de la boucle catalytique sur le site actif. © 2012 Kurkcuoglu et al.


Aperçu de la recherche sur les enzymes

Insights in Enzyme Research offre la meilleure plate-forme pour les chercheurs et les scientifiques de la technologie des bioprocédés. Il s'agit d'une revue internationale à accès libre, en ligne et évaluée par des pairs, dont l'objectif principal est de faire découvrir la technologie enzymatique à tous les lecteurs.

Insights in Enzyme Research vise à publier les recherches révolutionnaires en enzymologie, en incluant le métabolisme lipidique cellulaire, la biocatalyse, les mécanismes enzymatiques et les fonctions cellulaires dans des aspects plus larges de la biologie. Principalement sur les aspects liés à la découverte d'enzymes, la structure enzymatique, les mécanismes enzymatiques, les fonctions cellulaires et métaboliques des enzymes, l'exploitation d'enzymes pour des applications biotechnologiques et pharmaceutiques, la découverte de médicaments, les aspects biochimiques des enzymes, la bioinformatique, l'analyse informatique, les études de modélisation moléculaire, les nouvelles avancées dans l'expression et la purification d'enzymes, la biocatalyse, l'ingénierie biomoléculaire, la cinétique enzymatique et les inhibiteurs.

Insights in Enzyme Research sera unique dans sa discipline et encourage les manuscrits sous forme d'articles de recherche, de critiques, de commentaires et de brèves communications sur des sujets connexes, notamment les applications des enzymes, la biocatalyse, l'enzymologie biomédicale, la dynamique conformationnelle des enzymes, l'enzymologie computationnelle, les études de liaison enzymatique, Inhibition et inhibiteurs enzymatiques, Cinétique enzymatique, Thérapie enzymatique, Enzymes et métabolisme, Enzymes en médecine, Enzymes en nutrition, Enzymes en pharmacologie, Enzymologie industrielle, Mécanismes des réactions enzymatiques, Spectroscopie, Méthodes de recherche enzymatique, Structure et fonction des enzymes, Synthèse de Enzymes.

Catalyseurs enzymatiques

Les catalyseurs enzymatiques sont les substances chimiques qui augmentent la vitesse de réaction sur le site actif de la protéine et utilisées pour accélérer la réaction en restant inchangée en termes de quantité et de propriétés chimiques. Ces propriétés distinguent les catalyseurs des substrats. Les substrats sont les réactifs sur lesquels agissent les catalyseurs.

Revues connexes de catalyseurs enzymatiques
Journal de catalyse enzymatique, Catalyse moléculaire, Journal de catalyse, Catalyseur enzymatique, Aperçu de la recherche sur les enzymes

Bioinformatique structurelle

La bioinformatique structurale est l'application de la technologie à la gestion des données biologiques. Les ordinateurs sont utilisés pour rassembler, stocker, analyser et intégrer des données biologiques et génétiques qui peuvent ensuite être appliquées à la découverte et au développement de médicaments basés sur les gènes.

Revues connexes de bioinformatique structurale

Journal of Bioinformatic and Computational Biology, Journal of Computational Biology and Bioinformatics Research, International Journal of Bioinformatics Research and Applications, Journal of Applied Bioinformatics and Computational Biology, Journal of Protieomics and Bioinformatics, J Bioinformatics Comput Biol, Bulletin in Mathematical Biology, Cancer Informatics, Clinical Cancer Informatics, Cancer Informatics Initiative, Journal of Biomedical Informatics, Journal of Biomedical and Health Informatics, Insights in Enzyme Research

Dynamique conformationnelle des enzymes

Il traite de la mécanique enzymatique impliquée dans le mouvement du site actif sous l'action des forces.

Revues connexes de la dynamique conformationnelle des enzymes
Journal of Computational Dynamics, Journal of Computational and Nonlinear Dynamics, International Journal of Molecular Sciences: Open Access, Open Journal of Physical Chemistry, Journal of Physical Chemistry and Biophysics, Russian Journal of Physical Chemistry A

Enzymologie computationnelle

L'enzymologie computationnelle est une branche de la sous-discipline scientifique qui applique la simulation moléculaire et la modélisation des processus aux enzymes, en particulier pour simuler des réactions catalysées par des enzymes.

Revues connexes de Computatioanl Enzymology
Journal of Computational Biology, Computational Biology and Chemistry, International Journal of Computational Biology and Drug Design, International Journal of Computational Biology, SMT Journals: Journal of Computational Biology, Journal of Computer Science and Systems Biology, International Journal of Computational Biology

Découvertes de médicaments

Les découvertes de médicaments ou la conception rationnelle de médicaments sont la méthode par laquelle de nouveaux médicaments sont découverts.

Revues connexes de découvertes de médicaments

Drug Discovery Today : Eslevier, Drug Discovery Today, Journal of Drug Discovery and Therapeutics, International Journal of Drug Development and Research, Journal of Drug Discovery, Development and Delivery, Drug Development and Therapeutics, American Journal of Drug Discovery and Development, Drug Discovery : Libre accès, informations sur la recherche enzymatique

Études de liaison enzymatique

La liaison enzymatique est l'étude des interactions enzyme-substrat ou enzyme-protéine au cours de laquelle l'inhibition de la méthode ou l'amélioration de la méthode a lieu.

Revues connexes d'études de liaison enzymatique
The Journal of Biological Chemistry, International Journal of Biological Chemistry, World Journal of Biological Chemistry, Journal of Biological Chemistry, Biochemistry and Physiology: Open Access, Biological Chemistry

Inhibiteurs enzymatiques

L'inhibiteur d'enzyme est une molécule chimiquement active qui se lie à une enzyme et réduit son activité. Car bloquer l'activité d'une enzyme tuera un agent infectieux ou corrigera un déséquilibre métabolique.

Journaux connexes d'inhibiteurs d'enzymes
Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, The Open Enzyme Inhibiton Journal, Current Enzyme Inhibition

Cinétique enzymatique

La cinétique enzymatique est l'étude des réactions chimiques catalysées par les enzymes.En cinétique enzymatique, la vitesse de réaction est mesurée et les effets de diverses conditions de la réaction sont étudiés.

Revues connexes d'Enzyme Kinetics
Journal of Chemical Education, World Journal of Chemical Education, Biochimie et physiologie : accès libre, ingénierie enzymatique, chimie organique et biomoléculaire

Mécanismes enzymatiques

Les mécanismes enzymatiques sont les transformations des produits chimiques, ainsi que les étapes à l'intérieur de ceux-ci, générées par l'action enzymatique sur les substrats. Le mécanisme du changement chimique enzymatique est en principe analogue à différents types de catalyse chimique.

Revues connexes des mécanismes enzymatiques
Biochem Journal, Enzyme and Microbial Technology, Biochimie et biochimie analytique, Avancées dans la recherche sur les enzymes

Spectroscopie enzymatique

La spectroscopie enzymatique est l'étude et la mesure des spectres produits lorsque l'enzyme interagit avec le rayonnement électromagnétique.

Revues connexes de spectroscopie enzymatique
Société canadienne des sciences analytiques et de la spectroscopie, Journal canadien des sciences analytiques et de la spectroscopie, Journal of Chemical Biology and Therapeutics, Current Opinion in Chemical Biology, Journal of Biomolecular Research and Therapeutics, Austin Journal of Biotechnology and Bioengineering, IJBBR, Journal of Advanced Biotechnology and Bio-ingénierie, biotechnologie et bio-ingénierie

Thérapie enzymatique

La thérapie enzymatique est un ensemble de compléments alimentaires d'enzymes végétales et animales qui facilitent le processus digestif et améliorent la capacité du corps à maintenir un métabolisme équilibré.

Revues connexes de thérapie enzymatique
Ingénierie Enzymatique, Ingénierie Enzymatique

Enzymologie industrielle

L'enzymologie industrielle est une étude du rôle clé des enzymes dans les applications industrielles.

Revues connexes d'Enzymologie Industrielle
Journal of Industrial and Engineering Chemistry, Industrial Chemistry, Industrial and Engineering Chemical Research, Journal of Food and Industrial Microbiology, Fermentation Technology, International Journal of Industrial Chemistry, Tendances en biotechnologie : Elsevier, Tendances en biotechnologie, Tendances actuelles en biotechnologie et recherche chimique, Journal of Microbiology and Biotechnology, Journal of Microbiology and Biotechnology, Journal of Microbiology and Biotechnology, Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, Journal of Scientific and Industrial Research, American Journal of Scientific and Industrial Research, Blangladesh Journal of Scientific and Industrial Research

Modélisation moléculaire

La modélisation moléculaire englobe toutes les stratégies théoriques et techniques des machines utilisées pour modéliser ou imiter le comportement des molécules.
Revues connexes de modélisation moléculaire
Journal of Molecular Modelling, Journal of Molecular Graphics and Modelling, Journal of Computer Sciences and Systems Biology, Journal of Computational Chemistry


Possibilités d'accès

Obtenez un accès complet au journal pendant 1 an

Tous les prix sont des prix NET.
La TVA sera ajoutée plus tard dans la caisse.
Le calcul des taxes sera finalisé lors du paiement.

Obtenez un accès limité ou complet aux articles sur ReadCube.

Tous les prix sont des prix NET.


Mécanismes enzymatiques

Une gamme d'approches est appliquée à la dissection des mécanismes enzymatiques et au rôle de l'énergie de liaison enzyme-substrat dans la catalyse. Celles-ci comprennent des analyses cinétiques à l'état stable et pré-stationnaire avec des enzymes de type sauvage et mutantes. Les approches spécifiques utilisées comprennent la mesure des relations linéaires d'énergie libre avec une gamme de substrats synthétiques, l'analyse de l'effet isotopique cinétique et la conception, la synthèse et l'évaluation d'inhibiteurs d'enzymes.

Des études de marquage basées sur les mécanismes, en conjonction avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, sont utilisées pour identifier les principaux résidus de sites actifs. Un accent particulier a été mis sur le développement de méthodes pour piéger et sonder les intermédiaires de réaction en catalyse enzymatique en utilisant des inhibiteurs basés sur des mécanismes. Ces inhibiteurs, ainsi que des analogues d'états de transition étroitement liés, sont utilisés dans des études structurelles pour sonder la structure du site actif et la reconnaissance et la distorsion du substrat. Des études RMN collaboratives sont également utilisées pour sonder les problèmes de conformation du substrat lié et de l'état d'ionisation, ainsi que pour sonder les interactions électrostatiques et la dynamique au sein du site actif de l'enzyme le long de la coordonnée de réaction.

Mécanismes classiques des glycosidases - Sondage des détails fins

Les deux mécanismes canoniques de clivage des glycosidases avec inversion ou rétention de la configuration anomérique ont été proposés par Koshland et ont été démontrés par ce groupe et d'autres comme impliquant deux acides carboxyliques clés du site actif, comme le montrent les mécanismes d'inversion et de rétention suivants.

Les efforts actuels pour mieux comprendre comment ces enzymes accélèrent ces réactions par des facteurs de >10 17 fois se concentrent sur les rôles de la distorsion du substrat, l'environnement électrostatique du site actif et sa modulation au cours de la catalyse, le rôle des interactions de liaison individuelles dans la stabilisation de l'état de transition et le rôle de mouvement en catalyse. D'une importance particulière ont été nos études détaillées sur les deux xylanases Cex (33 kDa) et Bcx (20 kDa) qui semblent effectuer une hydrolyse via des états de transition assez différents. (Jacqueline Wicki, David Poon, Terrence Raasch, Ian Greig, Luke Lairson, Miriam Kötzler, Hongming Chen)

Variations sur un thème : Mécanismes alternatifs de clivage des glycosides

Nous avons découvert des variations sur ces mécanismes et continuons de les sonder. Les exemples comprennent:

Hydrolases d'acides uroniques insaturés de la famille GH88 : ces enzymes éliminent le sucre insaturé laissé à l'extrémité non réductrice par les polysaccharides lyases en utilisant un mécanisme d'hydratation.

Famille GH33 & 34 sialidases et trans-sialidases: ces enzymes, qui clivent un substrat contenant un acide carboxylique en son centre anionique, utilisent maintenant la tyrosine comme nucléophile catalytique. (Andrew Watts, Iben Damager, Mark Chen, Yuan Yao, Jin-Hyo Kim, Tom Wennekes, Sabrina Buchini, Ricardo Resende, Stefan Lutz, Zhizeng Gao, Kyle Robinson)

Famille de GH18 & 20 N-acétyl hexosaminidases : bon nombre de ces enzymes utilisent le propre groupe N-acétyle du substrat comme nucléophile catalytique, la réaction s'effectuant via un intermédiaire oxazolinium. (Ian Grieg, James MacDonald, Dave Vocadlo, Berit Aam, Andrés Gonzalez-Santana)

Famille GH31 -glucane lyases : ces enzymes clivent les glycosides par élimination via le mécanisme en deux étapes illustré ci-dessous. (Seung-Seo Lee, Young-Wan Kim, Ran Zhang)

Glusidases de la famille GH4 : un mécanisme redox. Cette classe d'enzymes inhabituelle utilise un NAD étroitement lié pour faciliter le clivage des glycosides via une séquence d'oxydation, d'élimination, d'addition et de réduction. (Vivian Yip, Yunsong Li)

Polysaccharides lyases de la famille PL4 : ces enzymes dégradent les polysaccharides contenant des acides uroniques (sucres avec un acide carboxylique en C6) via un mécanisme d'élimination E1cb. (Carl Rye, James MacDonald)

Hydrolases d'acides uroniques insaturés de la famille GH88 : ces enzymes éliminent le sucre insaturé laissé à l'extrémité non réductrice par les polysaccharides lyases en utilisant un mécanisme d'hydratation.

Glycosyl transférases : les enzymes qui synthétisent les glycosides, en utilisant typiquement un phosphosucre nucléotidique tel que l'UDP glucose comme donneur de glycosyle. Les mécanismes d'inversion des glycosyl transférases semblent être de simples analogues des glycosidases inverseuses. Nos études dans cette classe sont représentées par la sialyl transférase de Campylobacter. Cependant, les mécanismes de rétention des glycosyl transférases sont loin d'être clairs. Nos efforts se sont fortement concentrés sur la -galactosyl transférase IgtC de Neisseria. Après de nombreux efforts pour piéger d'éventuels intermédiaires de l'enzyme glycosyle, nous et d'autres avons choisi un mécanisme SNi inhabituel comme le plus probable. Toutes ces études sont menées en collaboration avec Warren Wakarchuk (Université Ryerson, Toronto), Natalie Strynadka et Lawrence McIntosh (UBC) et sont financées par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). (Luke Lairson, Chris Tarling, Hao Ly, Fathima Shaikh, Amir Aharoni, Patrick Chan, Francesco Rao, Bojana Rakic, Ching-Ching Yu, Lars Baumann, David Kwan, Kevin Mehr)


Température, dynamique et taux de réaction catalysés par des enzymes

Nous passons en revue les adaptations de l'activité enzymatique à différentes températures. Les enzymes psychrophiles (adaptées au froid) présentent des paramètres d'activation significativement différents (enthalpies et entropies d'activation inférieures) de leurs homologues mésophiles. En outre, il est de plus en plus évident que la dépendance à la température de nombreuses réactions catalysées par des enzymes est plus complexe qu'on ne le croit généralement. De nombreuses enzymes présentent une courbure dans les tracés d'activité en fonction de la température qui n'est pas expliquée par la dénaturation ou le dépliement. Ceci s'explique par la théorie de la vitesse macromoléculaire : une capacité thermique d'activation négative pour l'étape chimique limitant la vitesse conduit directement à des prédictions d'optimums de température, l'entropie et l'enthalpie dépendent de la température. Les fluctuations dans l'ensemble des états de transition sont réduites par rapport à l'état fondamental. Nous montrons comment les enquêtes combinant l'expérience avec la simulation moléculaire révèlent des détails fondamentaux de la thermoadaptation enzymatique qui sont pertinents pour comprendre les aspects de l'évolution des enzymes. Les simulations peuvent calculer des propriétés thermodynamiques pertinentes (telles que les enthalpies d'activation, les entropies et les capacités thermiques) et révéler les mécanismes moléculaires sous-jacents au comportement observé expérimentalement.


Voir la vidéo: Comment fonctionnent les enzymes (Août 2022).