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Quelle est la meilleure façon de fixer et de préserver les lames de test des comètes avant de les colorer au bromure d'éthidium ?

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Je souhaite utiliser la méthode d'électrophorèse sur gel à cellule unique (test des comètes). J'ai beaucoup d'échantillons, mais je n'ai pas le microscope approprié. Je dois donc conserver mes lames jusqu'au moment de la coloration et de l'analyse microscopique. J'ai lu de nombreux protocoles différents, et je ne peux pas décider lequel est le meilleur. De plus, après la coloration et l'analyse, je pourrais avoir besoin de réutiliser la même lame. Est-ce possible? et si oui, que dois-je faire ?


Mesures Comet Assay : une perspective

Le test Comet Assay ou test d'électrophorèse sur gel monocellulaire est l'un des tests très largement utilisés pour détecter au microscope les dommages à l'ADN au niveau d'une seule cellule. La détermination des dommages est effectuée soit par notation visuelle des cellules (après classification en différentes catégories sur la base de la longueur et de la forme de la queue), soit en utilisant différents logiciels disponibles dans le commerce ou du domaine public (qui reconnaissent automatiquement l'étendue des dommages). Dans cet essai, la forme, la taille et la quantité d'ADN dans la « comète » jouent un rôle important dans la détermination du niveau de dommage. L'utilisation d'un logiciel en particulier fournit également une gamme de paramètres différents, dont beaucoup peuvent ne pas être pertinents pour déterminer l'étendue des dommages à l'ADN. Comme un grand nombre de facteurs pourraient influencer la forme, la taille, l'identification et la détermination des dommages induits, ce qui inclut les critères de notation, les techniques de coloration, la sélection des paramètres (en utilisant les progiciels) et l'apparence du « hérisson » ou des « nuages », cet article vise (a) à fournir un aperçu de l'évolution des mesures des dommages à l'ADN à l'aide du test Comet et (b) à résumer et à analyser de manière critique les avantages et les inconvénients des différentes approches actuellement adoptées lors de l'utilisation de ce test. Il est suggéré qu'une sélection judicieuse de différents paramètres, des méthodes de coloration ainsi qu'une validation inter-laboratoires et une harmonisation des méthodologies contribueront davantage à rendre ce test plus robuste et largement acceptable pour les études scientifiques et réglementaires.


CometChip : une plate-forme à 96 puits à haut débit pour mesurer les dommages à l'ADN dans les cellules humaines microarrayées

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection par test de comète des dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Le dispositif modèle les cellules de mammifères dans une puce à ADN et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des dommages à l'ADN au niveau de la base, des dommages à l'ADN induits par l'exposition et de la cinétique de réparation de l'ADN.

Résumé

Les agents endommageant l'ADN peuvent favoriser le vieillissement, la maladie et le cancer et ils sont omniprésents dans l'environnement et produits dans les cellules humaines en tant que métabolites cellulaires normaux. Ironiquement, à fortes doses, des agents endommageant l'ADN sont également utilisés pour traiter le cancer. La capacité de quantifier les réponses aux dommages de l'ADN est donc critique dans les domaines de la santé publique, pharmaceutique et clinique. Ici, nous décrivons une nouvelle plate-forme qui exploite les techniques de microfabrication pour modéliser les cellules dans une puce à ADN fixe. Le « CometChip » est basé sur le test d'électrophorèse sur gel à cellule unique bien établi (alias le test des comètes), qui estime le niveau de dommages à l'ADN en évaluant l'étendue de la migration de l'ADN à travers une matrice dans un champ électrique. Le type de dommages mesurés par ce test comprend les sites abasiques, les réticulations et les ruptures de brins. Au lieu d'être dispersées au hasard dans de l'agarose dans le test traditionnel, les cellules sont capturées dans un réseau de micropuits d'agarose par gravité. La plate-forme s'étend également de la taille d'une lame de microscope standard à un format de 96 puits, permettant un traitement parallèle. Nous décrivons ici les protocoles d'utilisation de la puce pour évaluer les dommages à l'ADN causés par des agents génotoxiques connus et la réponse de réparation cellulaire suivie après l'exposition. Grâce à l'intégration de principes biologiques et d'ingénierie, cette méthode potentialise les mesures robustes et sensibles des dommages à l'ADN dans les cellules humaines et fournit le débit nécessaire pour les tests de génotoxicité, le développement de médicaments, les études épidémiologiques et les tests cliniques.

Introduction

Le test d'électrophorèse sur gel monocellulaire (SCGE) (alias test de comète) est une technique largement utilisée pour la quantification d'un large spectre de lésions de l'ADN, y compris les lésions basiques, les sites abasiques, les cassures simple brin, les cassures double brin, les réticulations et sensibles aux alcalis des sites. Le principe sous-jacent du test est que l'ADN endommagé migre plus facilement que l'ADN non endommagé en raison de la fragmentation et de la perte de structure superhélicoïdale. L'étendue de la migration est proportionnelle à la quantité de dommages à l'ADN et peut être visualisée en utilisant la microscopie à fluorescence. La capture d'images et l'analyse du profil d'intensité de l'ADN individuel en forme de comète fournissent ensuite des mesures de paramètres tels que la longueur de la queue, le moment de la queue et le % d'ADN dans la queue pour révéler le niveau de dommages à l'ADN dans une cellule 1-4.

Actuellement, il existe deux versions couramment utilisées du test des comètes : a) le test des comètes alcalines et b) le test des comètes neutres. Le test de comète alcaline est la version la plus largement utilisée, qui utilise un tampon à pH élevé pour dérouler l'ADN avant l'électrophorèse et détecte ainsi tous les types de ruptures de brins et de sites sensibles aux alcalis. Le test de comète neutre, d'autre part, est moins pratiqué car il utilise un tampon neutre pour maintenir les doubles hélices et détecter uniquement les cassures double brin 2,5. Pour les agents chimiques et physiques qui induisent les DSB, les SSB sont créés de concert et se forment à des niveaux beaucoup plus élevés (par exemple., les SSB induits par l'IR sont d'un ordre de grandeur plus fréquents que les DSB). Pour la plupart des expositions qui endommagent l'ADN, les DSB sont beaucoup moins fréquentes que les autres classes de dommages à l'ADN et sont donc plus difficiles à détecter. Nous avons démontré dans des publications précédentes la fenêtre de détection des deux versions. 6,7

Bien que le test des comètes ait été utilisé de manière routinière pour la recherche fondamentale sur les dommages et la réparation de l'ADN et les tests de génotoxicité 1,2,8-15, il a été rapporté que le test avait une faible reproductibilité en raison d'échantillon à échantillon, de personne à personne et de laboratoire. -variabilité au laboratoire. De plus, le dosage est à faible débit, en partie parce que l'acquisition d'images et l'analyse des données sont laborieuses. Ensemble, ces limitations contribuent à son acceptation relativement faible dans les études à grande échelle. Grâce à l'intégration des technologies et des principes d'ingénierie, le CometChip apporte une solution aux problèmes de débit et d'incohérences qui sont associés à l'analyse traditionnelle des comètes 6,7. Brièvement, pour créer la puce, un moule est microfabriqué en utilisant la photolithographie pour créer des micropostes avec des diamètres aussi petits que celui d'une seule cellule. Le moule est ensuite utilisé pour tamponner de l'agarose fondu, ce qui donne un réseau de micropuits après la solidification du gel. Des puces sont en cours de développement pour fournir aux chercheurs des puits de taille variable compatibles avec différents types de cellules. Pour charger la puce, les cellules dans les médias sont autorisées à se déposer dans les puits par gravité, les cellules en excès sont emportées. Les cellules piégées sont ensuite encapsulées à l'aide d'une fine couche d'agarose à bas point de fusion, et une plaque à 96 puits sans fond est ensuite fixée à la surface du gel pour créer 96 macropuits, chacun avec des centaines de micropuits sur sa surface inférieure.

Ce protocole décrit les procédures générales pour les expériences avec cette puce, qui comprennent la préparation du gel, le chargement des cellules, le dosage et la réparation, la lyse cellulaire, l'électrophorèse et l'imagerie fluorescente. Nous démontrons deux exemples d'expériences dose-réponse avec des cellules lymphoblastes exposées à des agents endommageant l'ADN connus, en utilisant respectivement des versions alcalines et neutres de l'essai. Deux expériences de réparation sont également présentées pour décrire comment la réponse de réparation post-exposition peut être évaluée à l'aide du système.

Protocole

  1. Retirez le gel de puce de l'emballage et placez-le dans une plaque rectangulaire à un puits, côté film de gel vers le bas.
  2. Laver le gel dans 25 ml de PBS 1x pendant 15 min, répéter deux fois.
  3. Placez le gel sur une plaque de verre et étiquetez l'orientation du gel en conséquence.
  4. Appuyez doucement sur une plaque à 96 puits sans fond inversée sur le gel, assurez-vous que tous les puits de la plaque à puits sans fond se trouvent dans la zone du gel.
  5. Utilisez des pinces de reliure 1.5’’ de chaque côté de la plaque pour sécuriser le serrage avec le verre.
  6. Aspirer l'excès de tampon PBS dans chaque puits.
  1. Préparer des suspensions cellulaires :
    1. Pour les lignées cellulaires en suspension, diluer la suspension cellulaire dans un milieu pour obtenir une concentration finale de 10 5 󈝶 6 cellules/ml.
    2. Pour les lignées cellulaires adhérentes, suivez les protocoles normaux de détachement/trypsinisation et diluez les cellules détachées dans le milieu à une concentration finale de 10 5 󈝶 6 cellules/ml. Si les cellules s'agrègent, passez la suspension cellulaire dans un filtre cellulaire pour obtenir une suspension cellulaire unique.

    REMARQUE : Pour étudier le niveau de référence des dommages à l'ADN, passez à l'étape 4.

    1. Alignez soigneusement les puits de la puce (créée à partir du serrage précédent) avec les puits d'une nouvelle plaque à 96 puits sans fond. Appuyez à nouveau sur la plaque à 96 puits sans fond sur le dessus et fixez le serrage avec des clips de reliure.
    2. Ajouter 100 μl de produit chimique de la dose souhaitée à chaque puits de la plaque à 96 puits, effectuer le dosage/traitement sur de la glace ou dans un réfrigérateur à 4 °C pendant la durée souhaitée.
    3. Après le dosage, aspirez les produits chimiques de chaque puits et rincez les produits chimiques résiduels en utilisant 1x PBS. Si les dommages directs sont étudiés ici, passez à l'étape 4.
    4. Pour étudier la cinétique de réparation, laissez les cellules de la puce se réparer dans un milieu à 37 °C. Lyse (passez à l'étape 4) à des moments précis.
      REMARQUE : La réparation peut être effectuée sur puce avec une plaque à 96 puits sans fond attachée, ou la puce peut être coupée en morceaux séparés après le retrait de la plaque à 96 puits sans fond.
    1. Pour effectuer un test de comète alcaline :
      1. Faire un tampon de lyse alcaline de travail en ajoutant 1% de Triton X-100 à une solution mère de lyse alcaline (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, Tris 10 mM, pH 10). Préparer environ 25 ml de tampon de lyse de travail pour chaque puce.
      2. Tampon de lyse alcalin de travail de pré-refroidissement à 4 °C.
      3. Immerger la puce dans un tampon de lyse alcalin de travail froid et permettre à la lyse d'effectuer O/N dans un réfrigérateur à 4 °C.
      1. Faire un tampon de lyse neutre de travail en ajoutant 1 % de Triton X-100 et 10 % de DMSO à une solution mère de lyse neutre (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% N-Lauroylsarcosine, pH 9,5). Préparer environ 25 ml de tampon de lyse de travail pour chaque puce.
      2. Préchauffer le tampon de lyse neutre de travail à 43 °C.
      3. Immerger la puce dans un tampon de lyse neutre et chaud et permettre à la lyse d'effectuer O/N dans un incubateur à 43 °C.
      1. Pour effectuer un test de comète alcaline :
        1. Retirer le tampon de lyse et rincer rapidement la puce avec 1x PBS.
        2. Puce sécurisée dans une chambre d'électrophorèse avec le côté du film de gel vers le bas à l'aide de ruban adhésif double face.
        3. Apportez la chambre dans une chambre froide à 4 °C.
        4. Remplir la chambre avec un tampon d'électrophorèse alcaline froide (0,3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) à un niveau qui recouvre juste le gel.
        5. Autoriser un déroulement alcalin pendant 40 min.
        6. Exécuter l'électrophorèse à 1 V/cm et 300 mA pendant 30 min dans la chambre froide. Ajustez le volume de tampon d'électrophorèse dans la chambre pour obtenir le courant de fonctionnement souhaité.
        1. Retirer le tampon de lyse et rincer la puce avec un tampon d'électrophorèse neutre (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM acide borique, pH 8,5) pendant 2 x 15 min à 4 °C.
        2. Puce sécurisée dans une chambre d'électrophorèse avec le côté du film de gel vers le bas à l'aide de ruban adhésif double face.
        3. Apportez la chambre dans une chambre froide à 4 °C.
        4. Remplir la chambre avec du tampon d'électrophorèse neutre froid (2 mM Na2EDTA, 90 mM de Tris, 90 mM d'acide borique, pH 8,5) à un niveau qui recouvre juste le gel.
        5. Laisser le gel reposer dans une chambre froide pendant 60 min.
        6. Exécuter l'électrophorèse à 0,6 V/cm et 6 mA pendant 60 min dans la chambre froide. Ajustez le volume de tampon d'électrophorèse dans la chambre pour obtenir le courant de fonctionnement souhaité.
        1. Retirer la puce de la chambre d'électrophorèse de la chambre froide.
        2. Neutraliser les gels dans le tampon de neutralisation (0,4 M Tris, pH 7,5) pendant 2 x 15 min au réfrigérateur à 4°C.
        3. Colorez la puce avec le colorant d'ADN fluorescent de votre choix (c'est à dire., SYBR Gold, Ethidium Bromide) selon les procédures recommandées par l'usine. Image en microscopie à fluorescence.

        Analysez les images de comètes à l'aide d'un logiciel d'analyse de comètes standard tel que Komet 5.5.

        Résultats représentatifs

        Dans ce premier exemple, nous décrivons l'approche pour quantifier les niveaux initiaux de dommages à l'ADN dans les cellules lymphoblastoïdes humaines après exposition à des dommages oxydatifs à l'aide de H2O2. Afin d'évaluer H2O2-les lésions basiques induites et les cassures simple brin, des conditions de comète alcalines sont utilisées. Une fois le chargement terminé et les cellules encapsulées avec la couche d'agarose, une plaque à 96 puits sans fond est pressée sur la surface pour créer 96 compartiments sur la puce. Chacun des 96 puits peut être dosé avec un type ou une concentration de produits chimiques différents. Ici quatre doses différentes de H2O2 ont été utilisés et 1x PBS a été utilisé comme contrôle négatif. Des images représentatives de comètes en réseau sont présentées dans Figure 1A, où non traité (en haut), 50 μM (au milieu) et 100 μM (en bas) H2O2-les échantillons exposés ont montré différents niveaux de queues de comètes. L'analyse des images de comètes peut être effectuée à l'aide d'un logiciel disponible dans le commerce, qui quantifie généralement les niveaux de dommages en fonction de l'intensité de fluorescence totale et de la distance de migration de chaque queue de comète. Les mesures sont généralement effectuées sur 50 à 100 comètes par condition et la valeur médiane (soit le % d'ADN de la queue ou la longueur de la queue) est calculée. Figure 1B illustre la courbe de réponse de l'ADN de la queue en pourcentage analysée à partir des comètes de cellules lymphoblastoïdes TK6 exposées à quatre concentrations différentes de H2O2. La cohérence entre les expériences indépendantes démontre l'efficacité de cette approche dans l'évaluation de la réponse aux dommages de l'ADN à partir de divers niveaux de traitements chimiques dans les cellules.

        Pour en savoir plus sur la variation entre les échantillons (par exemple., parmi les macropuits) et parmi les répétitions de la même expérience, la variabilité inter-échantillon et inter-expérimentale a été tracée dans Figure 2A et 2B respectivement. Dans chaque expérience, chaque puits de la puce à 96 puits équivaut à un échantillon différent et, par conséquent, la variation de puits à puits révèle la variation inter-échantillons du dispositif. Ici, les cellules TK6 chargées dans 12 puits de la puce à 96 puits ont été traitées avec la même dose de H2O2 et immédiatement lysée après traitement. Toutes les autres étapes expérimentales ont été réalisées en parallèle et les médianes d'au moins 50 comètes de chaque macropuits ont été tracées dans Figure 2A. La moyenne des médianes est de 77,53 % d'ADN dans la queue, avec un écart type de 3,99 %. À partir de ces données, nous calculons que le coefficient de variation entre les échantillons est de 5,2%, ce qui est plusieurs fois inférieur à l'essai traditionnel, démontrant la robustesse améliorée de cet essai 6,16. Pour en savoir plus sur la reproductibilité du test, nous avons exposé des cellules TK6 dans une puce avec 75 μM H2O2 et analyser le niveau immédiat des dommages à l'ADN. Cette expérience a été répétée six fois et les données de chaque expérience ont été tracées dans Figure 2B. Dans des conditions expérimentales identiques, nous avons obtenu des résultats allant de 41,76 % à 57,87 %, représentés par des barres grises sur la figure. La moyenne de six répétitions est de 49,57 %, avec une erreur standard de la moyenne de seulement 2,04 %. La faible variation parmi les répétitions implique que le test de comète effectué sur ce nouveau dispositif est hautement reproductible.

        Pour évaluer la cinétique de réparation, les cellules sont autorisées à réparer leur ADN dans un milieu frais après traitement. La lyse des macropuits à différents moments révèle l'évolution des dommages à l'ADN au fil du temps. Un exemple est montré dans figure 3. Dans cette expérience, les cellules TK6 ont d'abord été encapsulées dans la puce, traitées avec 50 μM H2O2, et autorisé à réparer jusqu'à 60 min post-exposition. Les cellules ont été lysées à 0, 20, 45 et 60 min respectivement. Des images de comètes représentatives à différents moments sont affichées dans Figure 3A, et le changement des niveaux de dommages à l'ADN au fil du temps est tracé dans Figure 3B. Ces données ont révélé que presque tous les dommages sont réparés dans les 45 minutes après H2O2 traitement. De nombreuses variables peuvent affecter le taux de réparation, y compris le type de lignée cellulaire et l'agent chimique utilisé. Par conséquent, les chercheurs peuvent apporter des modifications au protocole (c'est à dire., prolongeant le temps de réparation) pour répondre à des besoins supplémentaires dans leurs enquêtes. Nous fournissons ici un autre exemple d'expérience de réparation utilisant cette puce, dans laquelle les cellules TK6 sont confrontées à un agent génotoxique différent. N-Méthyle-N’-Nitro-N-La nitrosoguanidine (MNNG) est un agent alkylant connu pour induire des lésions basiques dont la 7-méthylguanine et la 3-méthyladénine. Ces lésions sont converties en sites abasiques soit par dépurination spontanée, soit par élimination enzymatique par des ADN glycosylases. Le site abasique résultant peut être clivé dans des conditions alcalines et ainsi détecté sur la puce. L'exposition initiale provoque une augmentation significative des dommages, évidente à partir des longues queues, et au fil du temps, ces queues sont réduites à mesure que les cellules restaurent l'ADN intact pendant la réparation. Bien que l'alkylation et les dommages oxydatifs soient tous deux principalement réparés par la voie de réparation par excision de base, la quantité de lésions générées et les protéines impliquées dans la réparation varient. Ces variations peuvent conduire à différents taux de conversion en sites abasiques, ainsi qu'à différents taux de réparation des sites abasiques résultants. Dans Figure 4, les cinétiques de réparation des cellules TK6 exposées à 0,1, 1 et 3 µg/ml de MNNG sont présentées. Dans cette expérience, nous avons prolongé la durée de l'expérience à 2 heures après l'exposition, car les dommages induits par le MNNG semblent persister plus longtemps et sont éliminés à un rythme plus lent par rapport à H2O2-dommages induits.

        L'analyse des DSB en utilisant des conditions neutres est très similaire au protocole pour l'analyse des lésions simple brin en utilisant les conditions alcalines. Pour montrer les niveaux de dommages initiaux, les cellules TK6 ont été exposées à des niveaux variables de gIR, et les cellules résultantes ont été lysées et soumises à une électrophorèse à un pH neutre (Figure 5A). Il est à noter que la morphologie des queues des comètes est différente des conditions de dosage alcalines. Pour obtenir un ADN fragmenté observable à l'aide de ce test, la dose IR utilisée est significativement plus élevée (0-100 Gy) que la dose requise pour constater des dommages en utilisant les conditions alcalines. En outre, nous avons constaté que la longueur de la queue est le paramètre le plus sensible pour refléter l'étendue des dommages à l'ADN lors de l'utilisation du test de comète neutre 7 . La courbe dose-réponse analysée est illustrée dans Figure 5B. La réparation des cassures double brin de l'ADN dans les cellules peut également être évaluée, et a été démontrée par Weingeist et. Al. 7 . Ensemble, le CometChip neutre offre un outil précieux pour l'analyse à haut débit des DSB d'ADN.


        Figure 1. H2O2 dose-réponse des cellules TK6 à l'aide d'un essai de comète alcaline. (UNE) Comètes de micropuits en réseau de lymphoblastes TK6 non traités (en haut) et de cellules TK6 exposées à 50 μM (milieu) et 100 μM (bas) H2O2 pendant 20 min à 4 °C. La barre d'échelle est de 100 μm. (B) H2O2 dose-réponse des cellules TK6 exposées à divers niveaux de H2O2. Chaque point de données est la moyenne de trois expériences indépendantes, où le pourcentage médian d'ADN de queue d'au moins 50 comètes individuelles a été obtenu dans chaque expérience. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


        Figure 2. Variabilité inter-échantillons et inter-expérimentale. (UNE) Variation d'échantillon à échantillon. Des cellules lymphoblastes humaines TK6 ont été chargées dans 12 puits de la puce à 96 puits. Chaque puits a été exposé à 100 μl de 50 μM H2O2 pendant 20 min à 4 °C. Les cellules ont été immédiatement lysées et testées pour le % d'ADN de queue. Les données de chaque puits sont affichées ici. Chaque case représente la médiane d'au moins 50 comètes individuelles de chaque puits. La moyenne de 12 puits est de 77,53 %, l'écart type est de 3,99 % et le coefficient de variation calculé est de 5,2 %. (B) Variation d'une expérience à l'autre. Des cellules lymphoblastes humaines TK6 ont été chargées dans la puce à 96 puits, exposées à 100 μl de 75 μM H2O2 pendant 20 min à 4 °C. Les cellules ont été immédiatement lysées et testées pour le % d'ADN de queue. La même expérience a été répétée 6 fois et les données de chaque répétition sont représentées par une barre grise. Chaque case représente le % médian d'ADN de queue d'au moins 100 comètes individuelles de chaque répétition. La moyenne de 6 répétitions est de 49,57 %, indiquée ici comme barre arrière. L'écart type de 6 répétitions est de 4,99 % et l'erreur type de la moyenne est calculée à 2,04 %, représentée par la barre d'erreur sur la figure.


        figure 3. Réparation de H2O2-dommages induits dans les lymphoblastes TK6. (UNE) Schéma d'étude de réparation avec des comètes représentatives. Les cellules TK6 sont traitées avec des agents nocifs et autorisées à se réparer dans un milieu à 37 °C avant la lyse. (B) Cinétique de réparation des cellules TK6 après traitement avec 50 μM H2O2 pendant 20 min à 4 °C. Chaque point de données est la moyenne de trois expériences indépendantes, où le pourcentage médian d'ADN de queue d'au moins 50 comètes individuelles a été obtenu dans chaque expérience. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des expériences répétées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


        Figure 4. Réparation des dommages induits par le MNNG dans les lymphoblastes TK6. Les cellules TK6 sont traitées avec 0,1, 1 et 3 µg/ml de MNNG pendant 30 min à 4 °C et laissées à réparer dans un milieu à 37 °C jusqu'à 120 min après l'exposition. Le pourcentage médian d'ADN de queue d'au moins 50 comètes individuelles a été obtenu pour chacune des trois expériences indépendantes. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne de trois expériences indépendantes.


        Figure 5. Réponse à la dose IR des cellules TK6 à l'aide d'un test de comète neutre. (UNE) Comètes de micropuits en réseau de lymphoblastes TK6 non traités (en haut) et de cellules TK6 exposées à une irradiation gamma de 40 Gy (milieu) et 80 Gy (bas). La barre d'échelle est de 100 μm. (B) dose-réponse IR des cellules TK6 exposées à divers niveaux d'irradiation gamma. Chaque point de données représente la longueur médiane de la queue (μm) d'au moins 300 comètes regroupées à partir de six macropuits sur la puce. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

        Discussion

        Les génotoxines omniprésentes dans l'environnement et également dans les cellules humaines exercent un stress et des dommages inévitables sur l'ADN cellulaire. En fait, il a été estimé qu'il y a des milliers de lésions d'ADN présentes dans les cellules humaines à l'état d'équilibre 18 . Comprendre la sensibilité aux dommages et la cinétique de réparation chez l'homme apporte non seulement un aperçu de la recherche fondamentale, mais profite également au développement de médicaments. Ironiquement, malgré la capacité des dommages à l'ADN à favoriser le cancer, les agents endommageant l'ADN sont utilisés à des niveaux très élevés pour traiter le cancer, ce qui rend les connaissances sur les dommages et la réparation de l'ADN pertinentes pour la médecine personnalisée. Le CometChip est un nouveau dispositif de recherche qui utilise des pratiques de microfabrication pour révolutionner un test de dommages à l'ADN existant depuis longtemps. S'appuyant sur les mêmes principes que le test traditionnel des comètes, la puce offre un débit nettement plus élevé et une meilleure reproductibilité. Nous décrivons ici les méthodes d'utilisation de cette puce. Pour clarifier son utilité et sa robustesse, nous montrons les résultats de plusieurs expériences où la puce a été utilisée pour évaluer les dommages induits par plusieurs agents endommageant l'ADN différents, et où elle a été utilisée pour évaluer la réparation de l'ADN. Ensemble, les résultats présentés ici fournissent des informations utiles pour l'utilisation de la puce et démontrent sa large applicabilité à la recherche sur les dommages et la réparation de l'ADN.

        L'une des étapes les plus importantes de ce protocole est d'accomplir un chargement cellulaire efficace. De nombreuses lignées cellulaires ont été testées sur ce système, y compris à la fois des cellules en suspension et des cellules adhérentes. L'efficacité de chargement dépend de nombreuses variables telles que le type de cellule, la taille de cellule, la concentration de chargement et le temps. Les lignées cellulaires en suspension telles que les cellules lymphoblastoïdes sont les plus faciles à travailler. La concentration de la suspension cellulaire peut varier de 10 4 à 10 6 cellules par 96 puits et le chargement se termine généralement en 15 minutes. Une densité cellulaire plus élevée facilite le chargement et raccourcit le temps nécessaire pour que les cellules se déposent dans les micropuits.

        Les paramètres de chargement des cellules adhérentes peuvent différer de ceux des cellules en suspension. Les lignées cellulaires telles que les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) ont une efficacité de charge similaire à celle des cellules en suspension (après trypsinisation) et utilisent donc des conditions de charge similaires. D'autres types de cellules, telles que les cellules tumorales qui forment facilement des agrégats cellulaires en suspension, nécessitent une manipulation supplémentaire. Le passage des suspensions cellulaires à travers un filtre cellulaire unique et l'ajout de trypsine au milieu de suspension peuvent supprimer la formation d'amas cellulaires pendant le chargement. Enfin, en termes de temps de chargement, le temps nécessaire pour capturer les lignées cellulaires adhérentes dans les micropuits peut varier de 20 min à 1 h. En conséquence, il est recommandé aux utilisateurs d'effectuer des expériences pilotes pour déterminer les conditions de charge optimales avant de procéder à d'autres investigations. L'efficacité de chargement peut être visualisée sous un microscope à champ clair ou plus précisément révélée en colorant les cellules encapsulées avec du DAPI ou d'autres colorants d'ADN avant l'évaluation au microscope à fluorescence.

        L'un des principaux avantages de cette méthode et de cette puce est la polyvalence. Premièrement, les chercheurs ne sont pas limités à une concentration de cellules de travail spécifique, car les cellules en excès sont éliminées et le microarray assure une densité de comète uniforme. Deuxièmement, les micropuits peuvent être fabriqués avec des tailles variables pour s'adapter à des types de cellules de différentes tailles. Dans des circonstances où plusieurs cellules sont capturées dans un seul micropuits, les comètes multicellulaires sont auto-calibrées et donnent des résultats cohérents par rapport aux comètes monocellulaires 6,7. Un autre avantage de la structuration des cellules dans un microréseau est que toutes les comètes sont alors au même plan focal avec des positions fixes, ce qui réduit le bruit dû aux comètes non focalisées et facilite l'imagerie et l'analyse automatisées. Les améliorations significatives du débit et de la sensibilité fournies par le CometChip permettent l'application du test pour des études à grande échelle. Ensemble, la puce fournit un outil précieux pour l'évaluation des dommages à l'ADN pour les chercheurs, les toxicologues, les cliniciens et les épidémiologistes.

        Alors que le test des comètes est connu pour son excellente sensibilité dans la détection d'un large éventail de dommages à l'ADN, ce test souffre également d'une faible spécificité. L'utilisation de ce protocole améliore considérablement la reproductibilité et le débit de l'essai, mais ne démontre pas l'avancement de la spécificité. Néanmoins, il a été rapporté que le multiplexage du test avec d'autres méthodologies était efficace pour atteindre une spécificité plus élevée. Un exemple est l'inclusion d'enzymes spécifiques de lésions purifiées. Ces enzymes peuvent convertir des lésions basiques autrement indétectables en ruptures de brins détectables et en sites abasiques 1,19-21. Un exemple largement utilisé est la réparation endonucléase formamidopyrimidine-ADN glycosylase (Fpg), qui révèle des modifications oxydantes de l'ADN 19,22. Parce que l'étape de digestion enzymatique est appliquée après la lyse cellulaire, le système peut être traité de la même manière qu'une lame d'agarose traditionnelle sans altération du protocole. Bien que le protocole détaillé ne soit pas décrit ici, cette approche a été adaptée par de nombreux utilisateurs traditionnels de tests de comètes dans le passé et les protocoles peuvent être facilement trouvés. Dans une publication précédente, nous avons utilisé cette méthode pour identifier les dommages induits par la lumière fluorescente 22 .

        L'avantage majeur de cette méthode est le débit qu'elle offre, ce qui ouvre des portes à des études qui étaient auparavant pratiquement impossibles. La capacité de traiter 96 échantillons sur la même plate-forme réduit non seulement le travail et le temps, mais réduit également les bruits expérimentaux et améliore considérablement la reproductibilité. La variation inter échantillon est significativement inférieure à la variation traditionnelle de diapositive à diapositive, qui peut être 2 fois plus élevée que la variation observée avec cette puce 6,7. La réduction du bruit conduit également à une sensibilité améliorée, permettant la détection de différences plus subtiles entre les échantillons. Étant donné que l'appareil utilise un format standard à 96 puits, il est compatible avec les équipements de recherche généraux et les technologies HTS. Considérons une étude qui nécessite l'évaluation de 100 échantillons, en supposant qu'un chercheur moyen peut traiter

        30 lames de verre sur plusieurs jours. Étant donné que chaque échantillon doit être effectué en triple, il faudrait environ un mois pour terminer une telle étude, qui souffrirait également inévitablement de la variation d'un échantillon à l'autre. En revanche, le traitement de 100 conditions, chacune en triple, avec cette puce ne nécessite que quelques plaques et peut être réalisé en trois jours. Cette amélioration majeure du débit ouvre la porte à des études qui étaient auparavant inaccessibles.

        Le protocole présenté ici décrit à la fois les procédures de base pour effectuer le test de comète standard et les étapes modifiées nécessaires pour utiliser la plate-forme CometChip. Avec la capacité de mesurer à la fois les niveaux de dommages inhérents à l'ADN et la réponse de réparation ultérieure, le test est très pertinent pour une variété d'applications biologiques et cliniques. Les informations sur l'impact d'expositions chimiques spécifiques sur le génome facilitent la prévention et le traitement des maladies. En outre, il existe également un intérêt important pour déterminer les variations de la sensibilité aux dommages à l'ADN et de la capacité de réparation chez les individus 23,24. Cette technique fournit le débit requis pour de telles études à grande échelle. La connaissance des variations interindividuelles est essentielle pour identifier les personnes sensibles et pour concevoir des thérapies individualisées ou des stratégies de prévention. Ensemble, la technologie présentée ici fournit une plate-forme d'analyse des dommages à l'ADN à haut débit, objective et quantitative qui a le potentiel de devenir une méthodologie standard dans un proche avenir.

        Divulgations

        Le CometChip a été concédé sous licence à Trevigen, Inc. sur la base d'une demande de brevet qui inclut Wood, Weingeist, Bhatia et Engelward.

        Remerciements

        Ce travail était principalement pris en charge par 5-UO1-ES016045 avec un soutien partiel de 1-R21-ES019498 et R44-ES021116. DMW a été soutenu par la subvention de formation NIEHS en toxicologie environnementale T32-ES007020. L'équipement a été fourni par le Center for Environmental Health Sciences P30-ES002109.


        Introduction

        Le système immunitaire inné - la capacité inhérente à détecter et à réagir rapidement aux infections - et la réponse aux dommages à l'ADN (DDR), qui réagit aux menaces pesant sur notre génome, fonctionnent comme des systèmes de surveillance essentiels pour préserver l'intégrité des organismes. De nouvelles preuves indiquent que ces deux systèmes sont interdépendants (Hartlova et al, 2015 ) et que les défauts de ces deux systèmes sont au cœur de nombreuses maladies telles que les infections, l'auto-immunité, le cancer et les troubles associés au vieillissement, y compris la neurodégénérescence (Hartlova et al, 2015 Erttmann et al, 2016 ). Les facteurs moléculaires impliqués dans la diaphonie entre la DDR et le système immunitaire inné, ainsi que les mécanismes sous-jacents, restent mal définis.

        La GMP-AMP synthase cyclique cGAS est bien connue en tant que capteur immunitaire inné qui surveille le cytosol pour la présence d'ADN microbien (Gao et al, 2013b Soleil et al, 2013 ), ainsi que l'auto-ADN libéré du noyau dans des conditions de stress génomique (Hartlova et al, 2015 ) ou de mitochondries stressées (West et al, 2015 ). Lors de la reconnaissance de l'ADN double brin (ADNds), le cGAS catalyse la cyclisation de l'ATP et du GTP dans le deuxième messager cyclique GMP-AMP (2′3′-cGAMP) (Ablasser et al, 2013 Civril et al, 2013 Dîner et al, 2013 Gao et al, 2013a , 2013b Li et al, 2013 Soleil et al, 2013 Zhang et al, 2013 ). Par la suite, cGAMP se lie à son adaptateur STING (Stimulator of Interferon Genes) (Ishikawa & Barber, 2008), conduisant à l'activation de réponses immunitaires innées en aval. Les dysfonctionnements de la voie cGAS-STING ont été impliqués dans de nombreux troubles, notamment les infections, les maladies inflammatoires, la neurodégénérescence et le cancer (Barber, 2015 Chen et al, 2016 ).

        Le cGAS est généralement considéré comme une protéine cytosolique mais s'accumule transitoirement dans le noyau après la dissolution de la membrane nucléaire mitotique (Yang et al, 2017 Gentili et al, 2019 Zierhut et al, 2019 ). De plus, il a également été rapporté que le cGAS se déplace activement du cytosol vers le noyau lors de dommages à l'ADN (Liu et al, 2018 ) mais se localise également à la membrane plasmique de certains types cellulaires (Barnett et al, 2019 ). Malgré ces rapports, la localisation subcellulaire et la fonction du cGAS dans différentes conditions biologiques restent vivement débattues (Gekara & Jiang, 2019).

        Les cassures d'ADN double brin (DSB) sont des lésions potentiellement très délétères. S'il est mal réparé, le DSB entraîne des délétions ou des translocations chromosomiques aboutissant à des troubles associés à l'instabilité du génome, notamment la tumorigenèse, le vieillissement accéléré et d'autres maladies (Jackson & Bartek, 2009). La réparation du DSB se fait par deux voies principales : la jonction terminale non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) (Chapman et al, 2012 Ceccaldi et al, 2016 ). NHEJ est une voie de réparation sujette aux erreurs active tout au long du cycle cellulaire, et elle implique la ligature des extrémités de l'ADN et conduit souvent à des mutations de délétion ou d'insertion (Chapman et al, 2012 Ceccaldi et al, 2016 ). D'autre part, HR est un processus de réparation précis actif dans les cellules en prolifération et se produit principalement pendant les phases du cycle cellulaire S et G2 au cours desquelles il engage la chromatide sœur non endommagée à réparer la rupture de matrice pour restaurer la séquence d'ADN d'origine (Chapman et al, 2012 Ceccaldi et al, 2016 ). Pour un résultat sain, l'activation de ces voies est soigneusement calibrée pour assurer l'élimination rapide des cassures d'ADN endommagées, mais, si les dommages à l'ADN sont excessifs, pour favoriser l'induction de la mort cellulaire afin d'éradiquer les cellules génétiquement modifiées (Vitale et al, 2011 ). Les molécules régulatrices impliquées dans cet équilibre délicat ne sont pas totalement connues. Dans cette étude, nous identifions un nouveau régulateur de la réparation de l'ADN : le cGAS. Nous démontrons que le cGAS est constamment présent dans le noyau en tant que protéine liée à la chromatine où il agit comme un régulateur négatif de la réparation de l'ADN par recombinaison homologue, accélérant ainsi la génération du micronoyau et la mort des cellules sous stress génomique. Nous montrons que cette fonction cGAS non canonique est indépendante de l'axe STING.


        Discussion

        Les résultats de cette étude indiquent que pendant l'EP des cellules C2C12, des ROS sont générés à la surface des cellules, ce qui n'induit pas de dommages à long terme à l'ADN génomique. L'ADN plasmidique, qui est présent à l'extérieur des cellules pendant l'EP, neutralise les ROS générés et, par conséquent, devient inactivé. La génération de ROS est proportionnelle à l'amplitude des impulsions électriques et peut être piégée par des antioxydants, tels que la vitamine C ou le tempol. Lorsque des antioxydants sont utilisés pendant l'électrotransfert de gènes, l'efficacité de transfection des myoblastes C2C12 est augmentée, en particulier, de 1,6 fois par tempol. Les in vivo, efficacité de transfection de M. tibialis cranialis chez la souris est également augmentée par le tempol, 1,4 fois.

        La génération de ROS après EP de cellules ovariennes de hamster chinois a déjà été rapportée. 38, 39, 42, 43 Gabriel et Teissie 42 ont démontré sur des cellules d'ovaire de hamster chinois que les ROS sont générés sur la couche externe de la membrane cellulaire dans le capuchon, qui est électroperméabilisé. Les ROS générés ont été induits par l'exposition des cellules à 5 impulsions électriques de 500 Vcm 𢄡, une durée de 1 ms, fréquence 1 Hz et ont été détectés par (Pam)-Afluorescéine avec microscopie vidéo à fluorescence au niveau de une seule cellule. Ce phénomène, la génération de ROS après EP des cellules, a également été détecté avec la lucigénine et dépendait des paramètres de l'EP, tels que l'amplitude des impulsions électriques, la durée des impulsions et le nombre d'impulsions. 39 Notre étude utilisant la lucigénine pour la détection des ROS confirme les résultats précédemment publiés, mais sur différentes lignées cellulaires (myoblastes C2C12), avec des paramètres d'impulsion utilisés pour l'électrotransfert de gènes (6 × 500 Vcm 𢄡 , 5 ms, 1&# x02009Hz). 28 Dans ce modèle spécifique de cellules musculaires, nous avons démontré que plus de ROS sont générés avec l'augmentation de l'amplitude des impulsions électriques utilisées. Les complémentarités des résultats entre les deux méthodes de détection différentes (Pam)-Afluorescéine, qui détecte les ROS sur la membrane, et lucigénine, qui détecte les ROS dans la suspension proche de la surface cellulaire, indiquent que les ROS sont également générés dans ou sur la membrane cellulaire pendant le processus EP dans les cellules C2C12. De plus, plusieurs études ont rapporté l'induction de gènes pour des molécules piégeant les radicaux après EP. 35, 36, 37

        Cependant, personne n'a été en mesure de présenter des preuves solides de la génération de ROS à l'intérieur du cytoplasme après EP des cellules. Il y a une indication de Shil, 44 ans, qui a utilisé le diacétate de 2 & # x02032,7 # x02032,-dichlorodihydrofluorescéine pour la détection des ROS et, dans des conditions expérimentales différentes des nôtres, a montré une augmentation de la génération de ROS intracellulaires avec une amplitude croissante des impulsions électriques. Des résultats similaires ont été obtenus après rayonnement ionisant mais à un degré plus élevé.

        Dans notre étude, la présence de ROS intracellulaires a été impliquée indirectement par la mesure des dommages à l'ADN génomique. L'indication que les dommages à l'ADN sont générés par les ROS et non par l'EP directement est étayée par le fait que les dommages à l'ADN génomique n'ont pas pu être détectés immédiatement après l'exposition des cellules à l'EP, comme l'a démontré le test 8-oxoG. Des dommages à l'ADN génomique après un intervalle post-EP plus long ont été détectés à l'aide du test Comet. Les dommages à l'ADN génomique étaient minimes par rapport aux dommages causés par l'hydroperoxyde de tert-butyle, qui a été utilisé comme contrôle positif, et transitoires (détectés uniquement à des intervalles de 15 et 30 min), montrant une réparation efficace de l'ADN dans les 60 min après EP. De plus, nous avons démontré que l'exposition de l'ADN plasmidique à différents paramètres électriques n'entraînait pas de fragmentation de l'ADN plasmidique. Des résultats similaires ont été obtenus par Goldberg, qui a démontré que l'exposition de l'ADN génomique isolé à l'EP des paramètres électriques utilisés pour l'électrotransfert de gènes n'induit pas de dommages/fragmentation directs de l'ADN. 45

        L'ADN plasmidique, qui est présent pendant l'EP, a neutralisé les ROS générés.L'oxydation de l'ADN en présence des ROS qui sont générés au cours du processus métabolique normal dans les cellules est un phénomène bien connu qui se produit naturellement dans chaque cellule. 40 Si la cellule est exposée à un stress oxydatif, l'oxydation de l'ADN est augmentée. Si l'ADN plasmidique utilisé pour l'électrotransfection réagit avec les ROS générés pendant l'EP, la détection des ROS par la lucigénine devrait donc être réduite. Nous avons démontré que la chimiluminescence dérivée des ROS de la lucigénine était réduite lorsque l'ADN plasmidique était présent autour des cellules pendant la PE. L'ajout de 10 μg d'ADN plasmidique aux cellules a complètement empêché la détection des ROS par la lucigénine après EP. Nous avons observé le même effet sur la détection des ROS par l'ajout d'antioxydants tels que la vitamine C et le tempol aux cellules exposées à l'EP. Au vu de ces données, on peut supposer que les ROS générés ont interagi avec l'ADN plasmidique présent lors de la PE des cellules.

        Dans l'étape suivante, nous avons essayé d'améliorer l'efficacité de la transfection par l'utilisation d'antioxydants. L'électrotransfection est un processus à plusieurs étapes 1 qui nécessite la formation de complexes ADN-membrane cellulaire pour une transfection efficace. 46 L'interaction entre les ROS générés lors de l'application d'impulsions électriques et l'ADN plasmidique complexé avec la membrane cellulaire pourrait donc affecter l'efficacité de la transfection. L'ajout de piégeurs de ROS, d'antioxydants, aux cellules avant EP pourrait neutraliser les ROS générés dès qu'ils sont formés et l'ADN plasmidique dans les complexes ADN-membrane cellulaire ne serait pas affecté. L'efficacité de l'électrotransfection pourrait par conséquent être améliorée. En effet, notre in vitro les données indiquent que la transfection de pEGFP-N1 dans la lignée cellulaire C2C12 a été augmentée de 60 & x00025 lorsque le tempol a été ajouté avant EP, ce qui indique qu'en modulant les ROS générés, nous pouvons affecter l'efficacité de la transfection. Les ROS générés en raison de l'EP sur la surface cellulaire doivent affecter l'ADN plasmidique très rapidement, car il n'y avait pas d'augmentation de l'efficacité de la transfection si le tempol était ajouté après l'EP. Un effet positif des antioxydants, tels que l'acide ascorbique, sur les niveaux d'expression après l'électrotransfection a été rapporté dans les cellules végétales, 47 mais à notre connaissance, il n'y a eu aucun rapport sur l'efficacité accrue de l'électrotransfection dans les cellules animales in vitro ou in vivo suite (due à) l'ajout d'antioxydants.

        In vivo, dans le muscle de la souris, tempol a augmenté l'efficacité de la transfection de 40%. L'efficacité de la transfection a été augmentée lorsque le tempol a été mélangé avec de l'ADN plasmidique et injecté ensemble dans le M. tibialis cranialis, qui a été immédiatement après exposé à EP. L'augmentation n'était évidente qu'à une concentration temporelle de 12 m. La zone transfectée était augmentée mais pas la quantité de GFP dans les cellules, indiquant que davantage de fibres musculaires étaient transfectées lorsque l'antioxydant était présent, tandis que la quantité d'ADN plasmidique introduite dans une seule fibre n'était pas modifiée par rapport au témoin. Au total, cela signifie qu'une expression plus élevée de GFP (nombre de protéines exprimées) a été induite. Une dose plus faible n'était probablement pas assez élevée pour éliminer suffisamment de ROS générés pour affecter l'efficacité de la transfection. À une dose plus élevée, l'effet positif du tempol sur l'élimination des ROS générés par l'EP a probablement été contrecarré par la formation supplémentaire de ROS causée par la peroxydation lipidique initiée par le tempol, 48 résultant en un niveau d'efficacité de transfection similaire à celui des muscles témoins exposés à l'EP seul. Nous avons observé le même effet in vitro.

        Tempol est largement utilisé comme promoteur du métabolisme de nombreux ROS. Il a été utilisé dans de nombreuses études différentes in vitro et in vivo. In vitro il a été démontré qu'il peut préserver les mitochondries contre les dommages oxydatifs. In vivo dans de nombreux modèles précliniques, il a été démontré que le tempol améliorait la survie dans plusieurs modèles de choc chez la souris, protégeant de nombreux organes, y compris le cœur et le cerveau, des dommages causés par l'ischémie/reperfusion, réduisant les conséquences du stress oxydatif et de l'inflammation après irradiation, réduisant la pression artérielle etc. Cependant, chez l'homme, le composé n'a été utilisé que comme agent topique pour prévenir l'alopécie radio-induite. 48, 49 À notre connaissance, le tempol n'a pas été utilisé comme agent pour augmenter l'efficacité de la transfection. Les doses de tempol utilisées dans notre étude étaient inférieures aux doses toxiques rapportées pour les souris et les rats 49 et aucun effet secondaire n'a été enregistré.

        Le tempol antioxydant est donc un composé prometteur, qui peut également être utilisé pour améliorer l'efficacité de l'électrotransfection dans les tissus. Le muscle est facile à transfecter, cependant, il existe d'autres tissus, tels que la peau et, en particulier, les tumeurs, dans lesquels une efficacité de transfection plus élevée entraînerait un meilleur effet clinique. Plusieurs approches sont étudiées, en particulier dans les tumeurs, pour augmenter l'efficacité de la transfection, telles que la sélection des paramètres d'impulsion, la modulation de la matrice extracellulaire, l'intervalle de temps entre l'injection d'ADN et l'application d'EP, la préparation de plasmides, etc. 15, 16, 18, 27, 28, 29, 50 Dans la présente étude, nous avons démontré l'importance de la génération de ROS après EP sur l'efficacité de la transfection et avons montré que l'utilisation de tempol peut améliorer considérablement l'électrotransfection dans un tissu modèle—muscle.


        Discussion

        Ici, nous avons montré que cGAS est une protéine liée à la chromatine qui retient les RH et que cette fonction est indépendante de son activité enzymatique ou de la voie canonique STING-IFN-I. Mécaniquement, nous montrons que le cGAS entrave l'invasion de brins d'ADN médiée par RAD51, une étape critique dans la RH, et que cette caractéristique est liée à sa capacité à s'auto-oligomériser, compactant ainsi l'ADNdb lié en complexes d'ordre supérieur résistant à l'invasion par les filaments de RAD51 . Ce mode de régulation des RH est peut-être analogue à celui des protéines telles que l'histone de liaison H1 qui favorise également la compaction de l'ADN et empêche l'invasion de la matrice d'ADNdb homologue par les filaments RAD51 (Downs et al, 2003 Hashimoto et al, 2007 Murga et al, 2007 Machida et al, 2014 ). Ce mécanisme est différent de celui de Liu et al ( 2018 ), impliquant une translocation active de cGAS du cytosol dans le noyau pour entraver la RH via des interactions spécifiques avec des protéines de réparation de l'ADN, notamment PARP1 et H2AX. En revanche, nous constatons que cGAS est une protéine liée à la chromatine et que le co-isolement de cGAS avec ces protéines provient d'associations indirectes via des ponts de chromatine liés. De plus, notre analyse des mutants cGAS, y compris le cGAS ΛDNA-Y215E qui imite la phosphorylation proposée par Liu et al (2018) pour contrôler l'importation nucléaire cGAS démontre que les interactions cGAS-ADN sont le principe de la localisation nucléaire cGAS et de l'inhibition de la réparation HR-ADN.

        Quelle est la pertinence biologique de l'atténuation de la RH induite par le cGAS ? Nous postulons que dans des conditions homéostatiques, le cGAS peut généralement fonctionner comme un régulateur négatif pour supprimer les réarrangements indésirables du génome, y compris la translocation chromosomique, la suppression, l'inversion ou la perte d'hétérozygotie. D'autre part, en inhibant la RH dans les cellules en prolifération, comme nous l'avons montré, le cGAS accélère la déstabilisation du génome et la mort des cellules sous stress génomique aigu. Tout en restreignant la propagation de cellules aux génomes défectueux et donc potentiellement cancéreuses, cette fonction cGAS contribuerait également aux effets délétères des dommages à l'ADN. Par exemple, nous avons montré ici que le cGAS accélère l'ablation de la moelle osseuse induite par l'irradiation in vivo.

        La démonstration ici que le cGAS est lié à la chromatine et est apte à compacter l'ADN dans un état d'ordre supérieur ouvre la porte à d'autres études pour examiner si, en plus de son rôle régulateur des RH, le cGAS nucléaire affecte également d'autres processus sensibles aux changements dans la dynamique de la chromatine . Une question tout aussi importante est de savoir comment l'activité synthase du cGAS lié à la chromatine est bloquée pour éviter l'immunopathologie. De multiples mécanismes concurrents sont probablement en jeu. Un exemple est l'ARN circulaire récemment rapporté cia-cGAS qui lie et bloque le cGAS (Xia et al, 2018 ). De plus, nous postulons que contrairement à l'ADNdb nu, la liaison à l'ADNdb dans le contexte de la matrice de chromatine complexe peut être défavorable à l'activité cGAS synthase. Il est également possible que l'inactivité du cGAS nucléaire soit en partie due à des modifications post-traductionnelles encore à élucider.

        Les dérèglements de la réponse aux dommages à l'ADN et du système immunitaire sont au cœur de nombreuses affections humaines, notamment les infections, l'auto-immunité, la neurodégénérescence, le cancer et les troubles associés au vieillissement. Le cGAS a été impliqué dans bon nombre de ces problèmes de santé. La double fonction du cGAS dans le cytosol en tant que capteur immunitaire inné et régulateur négatif de la réparation de l'ADN dans le noyau souligne la position centrale du cGAS dans les échanges entre le système immunitaire inné et la réponse aux dommages de l'ADN. Ce travail ouvre de nouvelles voies pour de futures recherches sur la façon dont les fonctions cytosoliques et nucléaires du cGAS sont régulées et leur impact sur la santé et la maladie. Par exemple, parce que cGAS favorise à la fois la tumorigenèse (Ahn et al, 2014 Dou et al, 2017 Bakhoum et al, 2018 ) et l'immunité anti-tumorale (Deng et al, 2014 et al, 2014 Harding et al, 2017 Wang et al, 2017 ), en identifiant l'étendue et le contexte biologique dans lesquels les fonctions subcellulaires distinctes de cGAS contribuent à ces processus, et comment ces fonctions de cGAS peuvent être manipulées, seront bénéfiques pour atteindre le résultat souhaité des dommages à l'ADN et anti-immunitaires. thérapies tumorales.


        Contenu

        Coloration in vivo (également appelée coloration vitale ou coloration intravitale) est le processus de teinture des tissus vivants. En faisant en sorte que certaines cellules ou structures prennent des couleurs contrastées, leur forme (morphologie) ou leur position dans une cellule ou un tissu peut être facilement vue et étudiée. Le but habituel est de révéler des détails cytologiques qui pourraient autrement ne pas être apparents. Cependant, la coloration peut également révéler où certains produits chimiques ou réactions chimiques spécifiques se déroulent dans les cellules ou les tissus.

        In vitro la coloration consiste à colorer des cellules ou des structures qui ont été retirées de leur contexte biologique. Certaines teintures sont souvent combinées pour révéler plus de détails et de caractéristiques qu'une seule teinture. Combinées à des protocoles spécifiques pour la fixation et la préparation des échantillons, les scientifiques et les médecins peuvent utiliser ces techniques standard comme outils de diagnostic cohérents et reproductibles. Une contre-coloration est une coloration qui rend les cellules ou les structures plus visibles, lorsqu'elles ne sont pas complètement visibles avec la coloration principale.

        • Le cristal violet colore à la fois les organismes Gram positifs et Gram négatifs. Le traitement à l'alcool élimine la couleur cristalline des germes à Gram négatif uniquement. La safranine en tant que contre-colorant est utilisée pour colorer les organismes à Gram négatif qui ont été décolorés par l'alcool.

        Alors qu'ex vivo, de nombreuses cellules continuent de vivre et de se métaboliser jusqu'à ce qu'elles soient "fixées". Certaines méthodes de coloration sont basées sur cette propriété. Les taches exclues par les cellules vivantes mais absorbées par les cellules déjà mortes sont appelées taches vitales (par exemple, le bleu trypan ou l'iodure de propidium pour les cellules eucaryotes). Ceux qui pénètrent et colorent les cellules vivantes sont appelés colorants supravitaux (par exemple, le nouveau bleu de méthylène et le bleu de crésyl brillant pour la coloration des réticulocytes). Cependant, ces taches sont finalement toxiques pour l'organisme, certaines plus que d'autres. En partie en raison de leur interaction toxique à l'intérieur d'une cellule vivante, lorsque des taches supravitales pénètrent dans une cellule vivante, elles peuvent produire un motif caractéristique de coloration différent de la coloration d'une cellule déjà fixée (par exemple, aspect « réticulocyte » versus « polychromasie » diffuse). Pour obtenir les effets souhaités, les colorants sont utilisés dans des solutions très diluées allant de 1 : 5 000 à 1 : 500 000 (Howey, 2000). Notez que de nombreux colorants peuvent être utilisés dans les cellules vivantes et fixes.

        Un microscope couramment utilisé dans la coloration est le microscope à fond clair. Le microscope à fond clair est classé comme un microscope optique en raison de l'illuminateur qui produit de la lumière pour créer un arrière-plan lumineux. Ces microscopes sont généralement binoculaires, ce qui signifie qu'il y a deux oculaires qui sont généralement à un grossissement de dix fois. Lors de la visualisation d'organismes colorés à un grossissement cent fois, de l'huile est nécessaire pour aider à créer une vue plus claire en raison de la distorsion de la résolution due à la réfraction de la lumière qui devient incroyablement prononcée à un grossissement élevé. [1]

        Les étapes préparatoires impliquées dépendent du type d'analyse prévu. Certaines ou toutes les procédures suivantes peuvent être nécessaires.

        Wet Mounts - les supports humides sont utilisés pour voir des organismes vivants et peuvent être fabriqués à l'aide d'eau et de certaines teintures. Le liquide est ajouté à la lame avant l'ajout de l'organisme et une lamelle est placée sur le spécimen dans l'eau et la tache pour aider à le contenir dans le champ de vision. [1]

        Fixation–qui peut lui-même comporter plusieurs étapes–vise à préserver au maximum la forme des cellules ou des tissus impliqués. Parfois, la fixation thermique est utilisée pour tuer, adhérer et modifier le spécimen afin qu'il accepte les taches. La plupart des fixateurs chimiques (produits chimiques provoquant la fixation) génèrent des liaisons chimiques entre les protéines et d'autres substances au sein de l'échantillon, ce qui augmente leur rigidité. Les fixateurs courants comprennent le formaldéhyde, l'éthanol, le méthanol et/ou l'acide picrique. Des morceaux de tissus peuvent être noyés dans de la cire de paraffine pour augmenter leur résistance mécanique et leur stabilité et pour faciliter leur découpe en fines tranches. [2] Mordant: Ce sont des agents chimiques qui ont le pouvoir de fabriquer des colorants pour tacher des matériaux qui autrement ne seraient pas tachables


        Dommages à l'ADN induits par le peroxyde d'hydrogène et réparation par la différenciation des cellules souches mésenchymateuses dérivées de tissus adipeux humains.

        Avant les années 1980, le tissu adipeux n'était considéré que comme un réservoir passif de stockage d'énergie. Cependant, lorsque sa participation au métabolisme des hormones sexuelles a été confirmée, le tissu adipeux a été reconnu comme un organe endocrinien important [1]. Une percée substantielle s'est produite lorsqu'une nouvelle source de cellules souches adultes, appelées cellules souches dérivées de tissus adipeux, a été décrite pour la première fois par Zuk et al. [2] en tant que cellules multipotentes auto-renouvelables [3]. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (hADMSC) sont isolées des tissus adipeux (graisseux) par lipoaspiration ou biopsie. Les lipoaspirates représentent un mélange hétérogène de types cellulaires, notamment des adipocytes, des cellules endothéliales, des muscles lisses, des péricytes et des cellules progénitrices [2]. De telles propriétés font des hADMSCs un outil potentiel de thérapie en clinique [4] et, en particulier, pour la greffe de cellules autologues. Cependant, le faible taux de survie et l'augmentation de la mort cellulaire après l'implantation dans le tissu lésé suggèrent que les hADMSCs sont endommagés par le microenvironnement local probablement en raison d'un stress oxydatif soutenu avec la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) [5, 6]. Les ROS sont bien connus pour jouer un rôle dans la croissance et l'homéostasie des CSM même lorsqu'elles sont générées en tant que sous-produits du métabolisme énergétique normal. Chimiquement, le peroxyde d'hydrogène ([H.sub.2][O.sub.2]) est un ROS peu réactif en l'absence d'ions de métaux de transition, car dans les systèmes biologiques, il est produit de manière omniprésente et présente une demi-vie relativement longue. life, [H.sub.2][O.sub.2] remplit les conditions préalables pour servir de messager intracellulaire et agir comme molécule de signalisation cellulaire [7]. En termes chimiques, [H.sub.2][O.sub.2] peut agir comme un agent oxydant doux ou comme un agent réducteur doux, mais il n'oxyde pas facilement la plupart des molécules biologiques, y compris les lipides, l'ADN et les protéines, sauf si ces derniers ont des groupes thiols hyperréactifs ou des résidus méthionine [8]. En raison de son mode d'action, [H.sub.2][O.sub.2] peut induire des réponses distinctes selon le type cellulaire. Dans cette étude, nous avons exploré la capacité de [H.sub.2][O.sub.2] à induire des dommages à l'ADN et à réparer les hADMSC lors de la prolifération et à différents stades de la différenciation adipocytaire. Bien que toutes les cellules vivantes soient dotées d'une pléthore de mécanismes de réparation de l'ADN pour traiter différentes lésions de l'ADN et préserver l'intégrité génomique, les cellules souches mésenchymateuses devraient avoir une forte réponse aux dommages de l'ADN en raison de leurs remarquables capacités d'auto-renouvellement et de différenciation en différents types cellulaires fonctionnels. Dans la présente étude, nous avons spécifiquement étudié si la réponse aux dommages à l'ADN générés par oxydation est modulée au cours de la différenciation adipogène des hADMSCs. Nous montrons que les hADMSC réparent très efficacement les cassures de l'ADN et les sites labiles aux alcalis lors de la prolifération, mais que leur capacité de réparation diminue au cours de la différenciation adipocytaire. Fait intéressant, les adipocytes conservent leur capacité à réparer les sites formamidopyrimidine ADN glycosylase (Fpg), y compris la 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoguanine), la 8-oxoadénine, l'aflatoxine B1-fapy-guanine, la 5-hydroxy-cytosine et 5-hydroxy-uracile [9, 10].

        2.1, culture cellulaire hADMSC. Des hADMSC normaux (ATCC[R] PCS-500-011[TM]) ont été cultivés à un passage précoce (passage 4). Les cultures cellulaires ont été réalisées en utilisant le milieu Gibco MesenPRO RS[TM] (numéro de cat. 12746-012) préparé selon les spécifications du fournisseur et incubé à 37[degrés]C et 5% C[O.sub.2]. Des changements de milieu ont été effectués toutes les 48 heures et traités à

        85 % de confluence. Pour la récolte, les cultures ont été traitées avec 0.05% Trypsine-EDTA (Gibco, cat. numéro 25300-054) à 37[degrees]C et 5% C[O.sub.2] pendant 3 minutes (temps suffisant pour obtenir un total suspension de la culture). Ils ont ensuite été transférés dans du PBS et centrifugés à 300 xg pendant 5 minutes. Ils ont ensuite été manipulés en fonction du test à réaliser.

        2.2. Les marqueurs de surface hADMSC, anti-CD45, anti-CD146, anti-CD105 et anti-CD90 (Kit de cytométrie en flux multi-couleurs de cellules souches mésenchymateuses humaines, R&D Systems cat. numéro FMC002) ont été utilisés pour la détermination immunophénotypique des hADMSC avant et après adipocyte différenciation, suivant les recommandations de l'International Society for Cellular Therapy [11]. Le protocole indiqué par le prestataire a été suivi. Les échantillons cellulaires ont été lavés avec du tampon de coloration puis bloqués. L'anticorps ou l'anticorps témoin d'isotype correspondant a ensuite été ajouté. L'incubation a été réalisée pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité, et tout excès d'anticorps a été éliminé par lavage avec du tampon de coloration avant analyse. Les acquisitions ont été réalisées sur un cytomètre en flux Blue/Red Attune (BD Biosystems).

        2.3. Traitement au peroxyde d'hydrogène, les hADMSC ont été traités à une densité de 4000/[cm.sub.2]. Le traitement en bolus [H.sub.2][O.sub.2] (0, 50, 100, 150 et 200 pM) a duré 2 heures, et le temps de récupération en milieu frais était de 24 heures après le traitement. Pour être précis, les doses toxiques naissantes correspondantes de [H.sub.2][O.sub.2] étaient de 0, 152,5, 305, 457,5 et 600 nmol de [H.sub.2][O.sub.2 ]/mg de protéine cellulaire.

        Les cellules à différentes durées de différenciation (jours 6, 12 et 14) ont été traitées pendant 2 heures avec [H.sub.2][O.sub.2] 100 pM (305 nmol/mg de protéine cellulaire), et le temps de récupération était 24 h post-traitement en milieu frais.

        Les cellules ont été récoltées avec de la trypsine-EDTA, la suspension cellulaire obtenue a été utilisée pour effectuer le test d'activité lysosomale, la détermination des dommages à l'ADN (ruptures et lésions oxydatives) et la capacité de réparation de l'ADN.

        2.4. Test d'activité lysosomale, Un test d'activité lysosomale a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire et a été réalisé en utilisant le colorant FDA-Et-Br (diacétate de fluorescéine-bromure d'éthidium). La suspension cellulaire a été mélangée 1:1 avec une solution de coloration, et l'analyse a été réalisée par microscopie à fluorescence (Olympus BMX-60 avec un filtre UM61002). La FDA est absorbée par les cellules qui, grâce à l'activité estérase, transforment la FDA non fluorescente en un métabolite fluorescent vert. Les noyaux des cellules mortes sont ensuite colorés au bromure d'éthidium et visualisés sous forme de fluorescence rouge.

        2.5. Reactive Oxygen Species, Cette technique est basée sur l'oxydation dépendante des ROS de la dihydrorhodamine 123 (DHR123, Calbiochem, numéro de catalogue 309825) en rhodamine 123 (Sigma-Aldrich, numéro de catalogue R-8004). Les hADMSC ou les cellules adipocytaires ont été cultivées dans les conditions requises. Le milieu a ensuite été retiré et lavé avec du PBS. Les cellules ont été récoltées et comptées dans un compteur de cellules automatisé Moxi (ORFLO, Montana, US). Des aliquotes équivalentes à 2 x [10 5] cellules ont été recueillies et centrifugées à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Le surnageant a été versé, et 180 [micro]l de tampon A (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,8 mM MgS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O, 1,8 mM Ca[Cl.sub 0,2], 5 mM de glucose et 15 mM d'HEPES) et 20 [micro]l de dihydrorhodamine 123 (1 mM) ont été ajoutés au culot. Ce mélange a été placé dans une plaque à 96 puits et lu à l'aide d'un lecteur de fluorescence (BioTek FLx8000) à une longueur d'onde de 505 nm. Les résultats ont été interpolés dans une courbe de rhodamine 123 en tampon A à des concentrations de 0-10 [micro]M. Les données ont été exprimées en nmoles de cellules de rhodamine 123/2 x [105].

        2.6. Cassures de l'ADN et dommages oxydatifs à l'ADN, les dommages à l'ADN ont été déterminés par un test d'électrophorèse sur gel de cellule unique alcaline pour évaluer la présence de cassures d'ADN produites, qui comprend des cassures simple et double brin, ainsi que des sites labiles aux alcalis dans les cellules hADMSC soit en prolifération soit pendant la différenciation ( contrôle, [H.sub.2][O.sub.2] traitement et 24 h post-traitement) [12, 13]. Pour chaque condition expérimentale, au moins 10 000 cellules ont été mélangées avec 75 [micro] l d'agarose à bas point de fusion (LMP) à 0,5 %. Les cellules ont été chargées sur des lames de microscope pré-couches avec 200 [micro]l d'agarose à point de fusion normal à 0,5% et recouvertes d'une troisième couche d'agarose LMP à 0,5%. Brièvement, après lyse des cellules à 4[degrees]C pendant au moins 1 h dans un tampon constitué de 2,5 M de NaCl, 100 mM d'EDTA et 10 mM de Tris, pH 10, additionné de 10 % de DMSO et de 1 % de Triton X- 100, les lames ont été placées dans une chambre d'électrophorèse horizontale avec une solution tampon courante (300 mM de NaOH, 1 mM de [Na 2 ] EDTA, pH > 13). Les lames sont restées dans le tampon d'électrophorèse pendant 20 minutes pour permettre à l'ADN de se dérouler et de révéler les sites labiles aux alcalis (sites AP). L'électrophorèse a été réalisée pendant 20 min à 300 mA et 25 V,

        0,8V/cm. Toutes les étapes ont été effectuées dans l'obscurité pour éviter la lumière directe. Après électrophorèse, les lames ont été doucement retirées et rincées avec du tampon de neutralisation (0,4 M Tris, pH 7,5) à température ambiante pendant 15 min, déshydratées avec de l'éthanol absolu pendant 15 min et séchées à l'air. Du bromure d'éthidium (20 [micro]l de solution à 20 mg/ml) a été ajouté à chaque lame et une lamelle a été placée sur le gel. Les cellules individuelles ont été visualisées à un grossissement de 20x avec un microscope Olympus BX-60 avec des accessoires de fluorescence (filtre d'excitation 515-560 nm, filtre barrière 590 nm), et les dommages à l'ADN ont été déterminés à l'aide du logiciel Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Pour évaluer la migration de l'ADN, 50 nucléoïdes par lame (300 nucléoïdes au total par condition) ont été notés pour chaque condition expérimentale. Les données ont été divisées en cinq catégories selon le score Olive tail moment (OTM). Le nombre total de nucléoïdes dans chaque catégorie a été compté et multiplié par une valeur assignée de 0 à 4 selon la classe de dommages. La somme de toutes les catégories a été calculée et considérée comme l'indice de dommage. Le score global devait varier entre 0 et 400 unités arbitraires. Alternativement, le score OTM obtenu par le logiciel a été utilisé.

        Les dommages oxydatifs de l'ADN ont été identifiés par incubation avec la formamidopyrimidine ADN glycosylase (Fpg) pour révéler la 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoguanine), la 8-oxoadénine, l'aflatoxine B1-fapy-guanine, la 5-hydroxy-cytosine et 5 -hydroxyuracile [9, 10]. Brièvement, après traitement, les cellules immergées dans de l'agarose LMP 1% ont été déposées sur des lames de microscope pré-enduites d'agarose à point de fusion normal 1% et immergées dans du tampon de lyse pendant au moins 1 h à 4[degrés]C. Les lames ont ensuite été rincées avec une solution tampon (base Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,6) pendant 5 minutes. Les lésions oxydatives ont été digérées par Fpg (Trevigen, CA, USA), dans des conditions idéales de pH et de température suggérées par le prestataire. Des lamelles ont été placées sur les lames et ont été incubées pendant 30 min à 37[degrees]C dans une atmosphère humidifiée. Un ensemble de lames avec des cellules de chaque condition expérimentale dans un tampon (sans enzyme) a été inclus pour confirmer que les cassures des brins d'ADN étaient spécifiques à l'enzyme. Après incubation enzymatique, les lames ont été rincées avec une solution tampon (50 mM Tris-base, 200 mM EDTA, pH 7,6) et soumises à une électrophorèse cométaire conventionnelle (

        0,8V/cm) pendant 20 min sans déroulement de l'incubation. La déshydratation, la coloration et l'analyse ont été effectuées comme décrit précédemment.

        Pour déterminer la capacité de réparation de l'ADN, nous appliquons

        [expression mathématique non reproductible] (1)

        2.7. Différenciation adipocytaire. Cultures de hADMSCs (passe 4) atteintes

        80% de confluence. Ils ont ensuite été passés dans une plaque à une densité de 18 000 cellules/[cm2] dans du MesenPRO RS[TM] Medium Gibco (cat. numéro 12746-012). Les cellules ont été incubées à 37[degrés]C et 5% C[O.sub.2] pendant 48 h avant d'initier la différenciation. Par la suite, un lavage avec du PBS a été effectué pour éliminer les composants du milieu précédent et en ajoutant le kit de différenciation de l'adipogenèse StemPro[R], Gibco (numéro de cat. A10070-01). Les changements de médias ont été établis toutes les 72 h et incubés à 37[degrees]C et 5% C[O.sub.2] jusqu'au jour 14 de la différenciation adipocytaire. Pour la récolte, les cultures aux jours 6, 12 et 14 ont été traitées avec 0,25% de Trypsine-EDTA (Gibco, numéro de catalogue 25200-056) à 37[degrees]C et 5% C[O.sub.2] pendant 3 minutes. A l'aide d'un grattoir en plastique, une suspension de culture a été obtenue, qui a été transférée dans du PBS pour être centrifugée à 300 xg pendant 5 minutes. Ils ont ensuite été manipulés en fonction du test à réaliser.

        2.8. hFATP-1. L'anti-hFATP-1 (human fat acid transporter protein 1) (R&D Systems cat. number IC3304P) a été utilisé comme marqueur de surface de la différenciation adipocytaire [14]. Détermination de hFATP-1 avant et après différenciation adipocytaire. Le protocole indiqué par le prestataire a été suivi. Une solution de saponine (0,1 % p/v de saponine et 0,05 % de Na[N3] dans du PBS) a été utilisée pour la perméabilisation. L'anticorps ou l'anticorps témoin d'isotype correspondant a ensuite été ajouté. L'incubation a été réalisée pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité, et tout excès d'anticorps a été éliminé par lavage avec du tampon de coloration avant analyse. Les acquisitions ont été réalisées sur un cytomètre en flux Blue/Red Attune (BD Biosystems).

        2.9. Analyse du cycle cellulaire. Le cycle cellulaire a été évalué à l'aide d'un agent intercalant d'ADN (iodure de propidium IP) et de la RNase A pour diminuer la non-spécificité (Muse Cell Cycle Kit, référence MCH100106). Après récolte, les cellules ont été lavées avec du PBS puis fixées avec de l'éthanol à 70 % pendant au moins 48 h. Les cellules ont ensuite été centrifugées à 300 xg pendant 5 minutes et lavées avec du PBS. L'IP a été ajouté et incubé pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. Enfin, l'acquisition a été réalisée à l'aide d'un cytomètre FACScan (BD Biosystems) de l'unité de cytofluorométrie de l'Instituto de Investigaciones Biomedicas, UNAM. La phase du cycle cellulaire des populations cellulaires a ensuite été déterminée en fonction du contenu désoxyribonucléique.

        2.10. Teinture à l'huile rouge O. Pour confirmer la différenciation adipocytaire, les hADMSCs ont été ensemencés dans des plaques à 12 puits. La différenciation a été initiée lorsque la confluence était de 80 %. Les colorations correspondantes ont été réalisées au jour 14 de différenciation. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS puis fixées avec du paraformaldéhyde à 10 % pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, deux lavages ont été effectués avec du PBS, et de l'Oil Red O (Trevigen cat. numéro 5010-024-05) préparé selon le fournisseur a été ajouté suivi d'une incubation pendant 30 minutes avec agitation douce et protection de la lumière. Deux lavages supplémentaires ont ensuite été effectués et du PBS a été ajouté pour l'affichage du microscope inversé (Olympus IX50-S8F2). Pour la quantification, le PBS a ensuite été retiré, et le colorant a été extrait avec de l'isopropanol et incubé pendant 10 minutes avec agitation et protection contre la lumière. Le surnageant a finalement été placé dans une cellule en quartz (Quartz Spectrophotometer Cell Semi Micro, 9-Q-10mm, Bio-Rad Laboratories), et l'absorbance de l'échantillon a été mesurée sur un spectrophotomètre (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech) à 500 nm en utilisant isopropanol comme blanc pour obtenir l'accumulation relative de lipides.

        2.11. Analyses statistiques. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide des logiciels SigmaStat 3.5 et SigmaPlot 10.0. Des tests non paramétriques ont été utilisés pour les analyses d'électrophorèse sur gel à cellule unique, Kruskal-Wallis (ANOVA à un facteur sur les rangs) a été utilisé pour toutes les procédures de comparaisons multiples par paires (test de Dunn), et pour les données avec une distribution normale, les tests t de Student ont été effectués pour évaluer l'activité lysosomale, les niveaux de ROS, les marqueurs de surface et le cycle cellulaire.

        3.1. hADMSC Immunophénotype et caractérisation de la différenciation adipocytaire. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont fonctionnellement définies par leur capacité à s'auto-renouveler et leur capacité à se différencier en plusieurs types de cellules (adipocytes, chondrocytes et ostéocytes), qui sont phénotypiquement caractérisées comme positives pour CD105 et CD90 et négatives pour CD146 et CD45 . Le pourcentage de cellules qui présentent ces marqueurs de surface caractéristiques sont indiqués sur la figure 1 (a). Le pourcentage de cellules positives pour la protéine transporteuse d'acides gras humains 1 (hFATP1) est également présenté pour montrer la source tissulaire ainsi que le degré de différenciation adipogène. La distribution des cellules le long du cycle cellulaire confirme en outre qu'une différenciation efficace est obtenue comme le montre l'augmentation du pourcentage de cellules en G1 et une diminution du pourcentage de cellules en phases S et G2/M dans les adipocytes par rapport aux indifférenciés. (hADMSCs) (Figure 1 (b)). De plus, l'accumulation relative de lipides telle que mesurée par la coloration de graisse corporelle avec Oil Red O (Figures 1(e)-1(h)) montre une accumulation de lipides après 14 jours (lorsque la différenciation adipocytaire est terminée) par rapport à celle des hADMSCs (Figure 1 (je)).

        3.2. [H.sub.2][O.sub.2] - Dommages à l'ADN induits et capacité de réparation dans les hADMSC. Les hADMSCs exposés à [H.sub.2][O.sub.2] pendant 2h ont montré une réponse dose-dépendante dans le test de viabilité métabolique ainsi que dans le dosage du niveau de ROS. En particulier, une légère diminution de l'activité estérasique a été observée à des concentrations supérieures à 100 [micro] M et s'est accompagnée d'une augmentation du niveau de ROS (Figure 2 (a)). Les dommages à l'ADN induits par [H.sub.2][O.sub.2] à la fois comme des cassures d'ADN et des sites labiles aux alcalis ainsi que des lésions oxydatives montrent une réponse dose-dépendante claire (Figure 2 (b)). Une induction relativement plus élevée de cassures d'ADN et de sites labiles aux alcalis est observée en ce qui concerne les lésions oxydatives de l'ADN. Les dommages à l'ADN peuvent entraîner une instabilité du génome lorsqu'il n'est pas réparé. Nous avons donc déterminé la capacité de réparation de l'ADN à travers le niveau de dommages persistants à l'ADN, à la fois via des ruptures d'ADN et des lésions oxydatives de l'ADN, après 24 h de post-traitement (figures 3 (a) et 3 (b), images représentatives du matériel supplémentaire 1). L'analyse du taux de réparation est illustrée sur les figures 3(c) et 3(d). Notamment, dans les hADMSC, les cassures d'ADN induites par [H.sub.2][O.sub.2] ont été réparées plus efficacement que les lésions oxydatives (77 % contre 45 % de réparation pour les cassures d'ADN et les lésions d'ADN oxydatives, respectivement, lors de l'exposition à 200 [micro]M [H.sub.2][O.sub.2]) (Figures 3(c) et 3(d)). Notamment, 24 h après le traitement avec 100 [micro]M [H.sub.2][O.sub.2], une concentration qui pouvait être atteinte dans les CSM greffées, la réparation était complète pour les deux types de lésions.

        3.3. Ruptures d'ADN et accumulation de lésions oxydatives par différenciation adipocytaire. Les dommages à l'ADN déterminés comme des ruptures dans la différenciation adipocytaire montrent une augmentation en fonction du temps de différenciation avec une augmentation significative déjà après 6 jours (hADMSC 6D) (figure 4 (a), images dans la figure supplémentaire 2). De même, les lésions oxydatives de l'ADN ont également augmenté, bien que cette augmentation ait été significative dans les derniers stades de la différenciation, depuis le jour 12, et jusqu'à la différenciation complète (14 jours) (figure 4 (b), image dans la figure supplémentaire 2). Comme observé dans le cas des hADMSCs, le niveau de cassures d'ADN est relativement plus élevé que celui des sites sensibles à Fpg. De plus, nous démontrons le contraste entre les dommages à l'ADN basal et les lésions oxydatives selon les catégories montrant des adipocytes indifférenciés (U) et différenciés en phase terminale (D) (Figure 4 (c)) et l'augmentation des niveaux de ROS (Figure 4 (d), images de comètes dans la figure supplémentaire 2).

        3.4. [H.sub.2][O.sub.2] - Dommages à l'ADN et capacité de réparation induits par la différenciation des adipocytes. La pertinence des dommages à l'ADN accumulés par différenciation adipocytaire a été évaluée par la réponse adipocytaire à [H.sub.2][O.sub.2] et la mesure de la capacité de réparation de l'ADN 24 h après le traitement. L'exposition à 100 pM [H.sub.2][O.sub.2] n'affecte pas la viabilité de hADMSC (tableau 1). Par conséquent, cette condition expérimentale a été sélectionnée pour surveiller l'induction et la réparation des dommages à l'ADN (figures 5 (a) et 5 (b), images dans la figure supplémentaire 3). La capacité de [H.sub.2][O.sub.2] à induire des ruptures d'ADN a montré un comportement similaire au cours de la différenciation même si les valeurs étaient plus élevées que dans les hADMSCs indifférenciés (Figure 5 (a)) pendant ce temps, la capacité de [ H2][O2] pour induire des lésions oxydatives de l'ADN n'était plus élevé que dans les derniers stades de la différenciation adipocytaire (hADMSC 12D et adipocytes) (Figure 5 (b)).

        La capacité de réparation de l'ADN indique que tandis que les cassures sont entièrement réparées dans les hADMSCs indifférenciés, les réparations de ce type de dommages dans les adipocytes chutent considérablement à 10 % (Figure 5 (c)). Des changements moins spectaculaires ont été observés pour la réparation des lésions oxydatives avec des taux de réparation de 92 % et 50 % dans les hADMSC et les adipocytes indifférenciés, respectivement (Figure 5 (d)).

        Les hADMSCs représentent une source potentielle de CSM pour la thérapie cellulaire [4]. Comme attendu, ces cellules conservent la capacité de se différencier en chondrocytes, ostéoblastes ou adipocytes, comme le montre l'expression de marqueurs de surface spécifiques [11, 14]. De plus, ils expriment la protéine humaine de transport des acides gras-1 (hFATP-1), qui est stimulée par l'insuline et facilite le transport des acides gras à travers la membrane cellulaire pour favoriser l'accumulation d'acides gras à longue chaîne (LCFA). Ceci explique la formation de vésicules graisseuses lors de la différenciation adipocytaire (Figure 1). Notamment, nous avons trouvé une augmentation de l'expression de [CD146+-] dans les hADMSCs par rapport aux adipocytes, qui est également connue sous le nom de molécule d'adhésion du mélanome et pourrait expliquer les caractéristiques de capacité d'adhésion accrue des adipocytes. Les dommages à l'ADN devraient être efficacement éliminés dans les cellules souches [15, 16], et en effet, les hADMSC réparent efficacement les cassures de l'ADN et les lésions oxydatives de l'ADN. Nos résultats ont été obtenus à l'aide d'un passage cellulaire précoce (4e passage) et sont en accord avec d'autres études utilisant des cellules souches adipeuses obtenues par liposuccion de la moelle osseuse ou fémorale/abdominale [17, 18].

        Pour fournir de nouvelles informations sur l'utilisation de hADMSC en thérapie cellulaire, nous avons étudié sa réponse aux dommages oxydatifs générés dans l'ADN induits par un flux physiologique de peroxyde d'hydrogène. Expérimentalement in vitro, la reproduction du flux de peroxyde d'hydrogène est complexe cependant, elle est plus proche de ce que les cellules in vivo sont susceptibles de vivre. Dans ce travail, nous n'avons étudié que l'effet déclenché par une dose unique de 100 f M. Ces cellules, ainsi que leur contrepartie différenciée, semblent être relativement résistantes à [H.sub.2][O.sub.2] car aucune cytotoxicité n'a été observée jusqu'à 100 [micro]M (tableau 1 et figure 2(a)), une dose qui est cytotoxique dans une grande variété d'animaux, de plantes et de cellules bactériennes en culture [8, 13]. En termes de capacité de réparation de l'ADN, les hADMSC sont parfaitement compétents dans la réparation des cassures et des lésions oxydatives induites par des niveaux de peroxyde d'hydrogène jusqu'à 100 [micro]M. Au-dessus de cette dose (> 100 [micro]M), une inhibition significative de la réparation de l'ADN est observée (Figure 3), suggérant que le contrôle de l'environnement ROS est un facteur clé pour la survie des cellules souches. Certaines études rapportent que les cellules souches et les CSM nécessitent une réparation DSB (rupture double brin) pour traiter les dommages à l'ADN [13, 15, 18]. Khan et al. ont récemment suggéré que seules les cellules ayant une réponse efficace aux dommages à l'ADN sont autorisées à entrer dans la différenciation adipocytaire. peroxyde [17]. Une communication croisée entre DDR et différenciation fournirait donc aux cellules souches un contrôle rigoureux de la stabilité génétique avant de subir un auto-renouvellement et une différenciation [18, 19]. Ici, nous avons examiné comment les hADMSC répondent à une agression oxydative ([H.sub.2][O.sub.2] 100 [micro]M) lors de la prolifération et au cours de la différenciation adipocytaire. La réponse aux dommages endogènes à l'ADN ainsi qu'aux dommages à l'ADN induits par [H.sub.2][O.sub.2] reflète une diminution progressive de la capacité de réparation au cours du programme de différenciation. Cette diminution de la capacité de réparation est plus marquée que les changements des niveaux de ROS intracellulaires, qui ne sont que légèrement modifiés. De même, une diminution de la capacité de réparation des dommages oxydatifs a déjà été rapportée au cours de la myogenèse ainsi que lors de la différenciation neuronale [13, 20]. De plus, nous tenons à souligner que notre protocole ne reflète que les sites sensibles au Fpg, puisque nous ne faisons la digestion enzymatique qu'immédiatement après la lyse cellulaire et effectuons le décalage électrophorétique c'est-à-dire que nous n'effectuons pas d'incubation alcaline pour le déroulement cela évite la génération des sites AP ainsi que les lésions oxydatives digérées par le Fpg. Lorsque la capacité de réparation le long de l'adipogenèse est analysée en fonction du type de lésion de l'ADN, un scénario intéressant émerge : alors que la réparation des cassures de l'ADN est totalement altérée, l'élimination des sites sensibles à Fpg est diminuée mais reste active (réduction de 50 %) dans les adipocytes. Diverses lésions de la base de l'ADN sont éliminées par des enzymes de réparation spécifiques pour éviter des conséquences néfastes.Les sites abasiques sont réparés par APE1 pour éviter le contournement mutagène, le blocage de la fourche de réplication ou la conversion en cassures double brin. La 7-méthylguanine et la 3-méthyladénine sont réparées par la N-méthylpurine ADN glycosylase pour générer une formation de site abasique, une ouverture de cycle en FaPy-G, un blocage de la réplication ou une instabilité chromosomique. Les SSB sont réparés par les machines de réparation de rupture de brin simple (SSBR) pour éviter l'effondrement de la fourche de réplication ou la conversion en DSB. La 8-oxoguanine est la lésion d'ADN oxydé la plus courante et la plus mutagène et est réparée par OGG1 pour éviter les erreurs d'appariement des bases mutagènes. Cependant, les lésions de l'ADN générées par oxydation ne sont pas seulement un facteur de risque mutagène mais aussi un marqueur régulateur (pour une revue, voir [21]). Par conséquent, l'accumulation de lésions oxydatives de l'ADN peut également être très préoccupante pour les cellules qui ne se répliquent pas, telles que les adipocytes différenciés en phase terminale qui doivent maintenir l'intégrité des gènes essentiels à leur fonction. Cela peut expliquer pourquoi la réparation des lésions d'ADN générées par oxydation reste active (bien que réduite) dans les adipocytes. La question de savoir si la réparation couplée à la transcription des lésions des bases oxydées [22, 23] est impliquée mérite une enquête plus approfondie.

        En médecine régénérative, l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses dérivées de tissus adipeux humains est étendue, mais on sait peu de choses sur leur réponse aux dommages à l'ADN et en particulier aux espèces réactives de l'oxygène (ROS) présentes dans le microenvironnement d'implantation. Le rôle de ces ROS dans le microenvironnement peut être en partie abordé expérimentalement par le traitement d'un bolus de peroxyde d'hydrogène. La présente étude est la première preuve de ruptures d'ADN et de dommages oxydatifs à l'ADN accumulés par l'adipogenèse, en concordance avec l'augmentation des biomarqueurs adipogènes tels que hFATP-1, CD 146 et la formation de gouttelettes lipidiques. De plus, nous montrons la vulnérabilité accrue au peroxyde d'hydrogène dans la différenciation adipogène et quelques particularités intéressantes dans la capacité de réparation de l'ADN qui émergent en fonction des lésions spécifiques de l'ADN. Alors que la réparation des cassures d'ADN est totalement altérée, l'élimination des sites sensibles à Fpg est diminuée mais reste active (réduction de 50 %) dans les adipocytes. L'élimination des lésions oxydatives de l'ADN a une fonction principalement protectrice. Cependant, notre proposition est que tous les sites sensibles aux Fpg restants réalisent les fonctions régulatrices de la transduction du signal et de la régulation transcriptionnelle requises par les cellules spécialisées, telles que les adipocytes différenciés en phase terminale.

        Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflit d'intérêt concernant la publication de ce manuscrit.

        Ce travail est dérivé du séjour sabbatique de Mahara Valverde à l'Istituto Superiore di Sanita, Rome et a été réalisé avec le soutien de PASPA-DGAPA-UNAM. Jonathan Lozano-Salgado a reçu une bourse CONACyT. Les auteurs remercient le Dr Carlos Castellanos pour le soutien à l'acquisition de la cytométrie.

        Figure supplémentaire 1 : Dommages à l'ADN induits par [H.sub.2][O.sub.2] et capacité de réparation dans les hADMSC. Traitement au peroxyde d'hydrogène de 2 h utilisant 0 à 200 [micro]M et capacité de réparation présentée comme des dommages à l'ADN après 24 h de post-traitement. Images de comètes à un grossissement de 4x acquises par Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Les détails méthodologiques sont présentés dans la section Matériel et méthodes. Figure supplémentaire 2 : accumulation de dommages à l'ADN par différenciation adipocytaire des hADMSCs. Suivi de différenciation au jour 0 = hADMSC, jour 6 = hADMSC 6D, jour 12 = hADMSC 12D et jour 14 = adipocytes. Images de comètes à un grossissement de 4x acquises par Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Les détails méthodologiques sont présentés dans la section Matériel et méthodes. Figure supplémentaire 3 : Dommages à l'ADN induits par [H.sub.2][O.sub.2] et capacité de réparation par le biais de la différenciation adipocytaire. Traitement au peroxyde d'hydrogène utilisant 100 pM pendant 2 h et capacité de réparation présentée comme des dommages à l'ADN après 24 h de post-traitement. Suivi de différenciation au jour 0 = hADMSC, jour 6 = hADMSC 6D, jour 12 = hADMSC 12D et jour 14 = adipocytes. Images de comètes à un grossissement de 4x acquises par Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Les détails méthodologiques sont présentés dans la section Matériel et méthodes.

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        Mahara Valverde [ID], (1,2) Jonathan Lozano-Salgado, (1) Paola Fortini, (2) Maria Alexandra Rodriguez-Sastre, (1) Emilio Rojas, (1) et Eugenia Dogliotti (2)

        (1) Instituto de Investigaciones Biomedicas, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, C.U. 04510, Mexique

        (2) Département de l'Environnement et de la Santé, Istituto Superiore di Sanita, Viale Regina Elena 299, 00161 Roma, Italie

        La correspondance doit être adressée à Mahara Valverde [email protected]

        Reçu le 9 décembre 2017 Révisé le 19 juin 2018 Accepté le 26 juillet 2018 Publié le 10 octobre 2018

        Rédacteur académique : Heinrich Sauer

        Légende : Figure 3 : Capacité de réparation de l'ADN du traitement [H.sub.2][O.sub.2] dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées de tissus adipeux (hADMSCs). Dommages à l'ADN induits et résiduels après 24 h de post-traitement (PT), exprimés en moment de queue d'olive (OTM) correspondant aux cassures de l'ADN et aux sites labiles aux alcalis dans (a) (moyenne [+ ou -] SD). Sites ADN-Fpg (7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoguanine), 8-oxoadénine, aflatoxine B1-fapy-guanine, 5-hydroxycytosine et 5-hydroxy-uracile) en (b) (moyenne [+ ou -] SD). Pourcentage de capacité de réparation de l'ADN des cassures de l'ADN et des sites labiles aux alcalis en (c) (pourcentage [+ ou -] SD) et pourcentage de capacité de réparation des sites ADN-Fpg en (d) (pourcentage [+ ou -] SD). 0 PT = contrôle PT 50 PT = 50 [micro]M [H.sub.2][O.sub.2] PT 100 PT = 100 [micro]M [H.sub.2][O.sub.2] PT 150 PT = 150 [micro]M [H.sub.2][O.sub.2] PT et 200 PT = 200 [micro]M [H.sub.2][O.sub.2] PT. Toutes les données ont été obtenues dans 3 expériences en double indépendantes (N = 3). Kruskal-Wallis a été réalisée avec une ANOVA à un facteur sur les rangs, et toutes les procédures de comparaisons multiples par paires ont été réalisées avec le test de Dunn. Les différences entre les dommages induits et les dommages résiduels ont été obtenues pour (a) et (b), * p <0.05 et ** p <0.01. Le test t de Student versus contrôle a été appliqué pour les données en (c) et (d), * p <0.05 et ** p <0.01. Images dans la figure supplémentaire 3.

        Légende : Figure 4 : Accumulation de dommages à l'ADN par différenciation adipocytaire des hADMSC. Les dommages à l'ADN correspondant aux cassures de l'ADN et aux sites labiles alcalins accumulés pendant 14 jours de différenciation adipocytaire ont été exprimés en tant que moment de la queue olive (OTM), (a) (moyenne [+ ou -] SD). Accumulation de dommages oxydatifs de l'ADN, correspondant aux sites ADN-Fpg (7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoguanine), 8-oxoadénine, aflatoxine B1fapy-guanine, 5-hydroxy-cytosine et 5-hydroxy-uracile) exprimés comme OTM, est représenté en (b) (moyenne [+ ou -] SD). Les dommages basaux de l'ADN (ruptures + sites labiles aux alcalis) et les dommages oxydatifs basaux de l'ADN (sites sensibles au Fpg) des hADMSC (U = indifférenciés) et des adipocytes (D = différenciés) sont représentés dans des catégories de dommages (0, sans dommage à 4, le plus élevé dommages) en (c). Les niveaux intracellulaires de ROS dans les hADMSC et les adipocytes sont indiqués en (d) (moyenne [+ ou -] SD). Les données représentent 3 ou 4 expériences indépendantes avec des doublons. Des tests non paramétriques ont été utilisés pour les analyses d'électrophorèse sur gel à cellule unique, Kruskal-Wallis (ANOVA unidirectionnelle sur les rangs) et toutes les procédures de comparaisons multiples par paires (test de Dunn). Différences par rapport aux hADMSC (non différenciées), *p < 0.05. Images dans la figure supplémentaire 4.


        La plante médicinale indienne Giloe (Tinospora cordifolia) induit des effets cytotoxiques en endommageant l'ADN cellulaire dans les cellules HeLa : une étude de test de comète

        La science de l'environnement traverse une crise redoutée et drastique. Tinospora cordifolia ou giloe est utilisé dans le système de médecine ayurvédique pour le traitement de nombreuses maladies. Nos études antérieures ont montré que giloe exerce un effet cytotoxique in vitro et in vivo, ce qui nous a incités à comprendre le mécanisme de la mort cellulaire dans les cellules HeLa recevant diverses concentrations de giloe. Par conséquent, l'induction de dommages moléculaires à l'ADN par différentes concentrations d'extrait de dichlorométhane de giloe, Tinospora cordifolia (TCE) a été étudiée dans des cellules HeLa par dosage de comète alcaline et les dommages à l'ADN induits par le TCE ont été exprimés en tant que moment de la queue d'olive (OTM). L'incubation des cellules HeLa avec du TCE pendant 4 h a causé des dommages plus importants à l'ADN, comme l'indique l'augmentation de l'OTM par rapport au traitement de 2 h. Par conséquent, un temps d'exposition de 4 h a été considéré comme une durée optimale pour le traitement au TCE. L'exposition des cellules HeLa à 0, 1, 2, 4, 6 ou 8 µg/ml de TCE a entraîné une élévation dépendante de la concentration des dommages à l'ADN et la plus faible concentration de 1 µg/ ml de TCE a augmenté les dommages à l'ADN de base d'environ 10 fois. alors que 8 µg/ml de TCE, la concentration la plus élevée testée a provoqué une élévation d'environ 68 fois des dommages à l'ADN, par rapport au témoin non traité.

        Introduction

        Les phytoceutiques sont utilisés dans les systèmes médicinaux traditionnels pour les soins de santé en Inde et en Chine depuis l'avènement de leurs civilisations. Les phytoceutiques et autres produits naturels continuent de jouer un rôle crucial dans les soins de santé humains dans les pays en développement et développés. Les estimations de l'Organisation mondiale de la santé indiquent qu'environ 80% des humains dans le monde utilisent principalement des médicaments traditionnels pour leurs soins de santé primaires [1]. Les produits naturels et botaniques sont facilement accessibles et économiquement moins chers que les composés synthétiques. Ils ont également été considérés comme toxiques car leur utilisation l'a été depuis l'avènement de l'histoire humaine [2,3]. Cela a été la principale raison de leur popularité parmi la population humaine. Malgré le fait que les plantes ont une longue histoire d'utilisation dans le traitement du cancer, beaucoup, sinon la totalité, des allégations concernant l'efficacité d'un tel traitement sont considérées avec scepticisme car le cancer, en tant qu'entité pathologique spécifique, est mal défini en termes du folklore et des systèmes médicinaux traditionnels. Il est également bien connu que certains des médicaments modernes les plus connus pour le traitement du cancer, notamment les alcaloïdes de la vinca, la vinblastine, la vincristine, le taxol, les phodophyllotoxines et le topotocan, etc. . Les phytoceutiques offrent une alternative aux composés synthétiques et une grande promesse dans le traitement du cancer car ils sont pratiquement non toxiques ou ont des implications moins toxiques que les molécules synthétiques [4]. Les extraits bruts de plantes comme Alstonia savants, et Aegle marmelos ont été rapportés pour montrer une activité inhibitrice de tumeur marquée in vitro et in vivo [5-7]. De même, il a été rapporté que l'extrait d'Aphanamixis polystachya présentait une activité antitumorale marquée et augmentait plus tôt l'effet des radiations chez les souris porteuses de tumeurs [8,9].

        Les produits à base de plantes sont utilisés sous différentes formes pour la santé humaine. Les herbes sont utilisées sous forme d'extraits bruts ou de mélange d'extraits bruts tels que pratiqués par les guérisseurs traditionnels ou alternativement, les molécules actives de diverses plantes sont isolées et utilisées pour le traitement de diverses maladies humaines, y compris le cancer, qui est couramment pratiqué par les modernes système de médecine [4,10]. Tinospora cordifolia Miers, appartenant à la famille Menispermaceae, est communément connu sous le nom de guduchi ou giloe est une préparation à base de plantes non toxique, qui a été largement utilisée dans le système de médecine ayurvédique pour son tonique général, anti-inflammatoire, antibactérien, antiviral, antipaludéen, antileprotique, hypoglycémiant, propriétés immunomodulatrices et aphrodisiaques [11-17]. Différents extraits de giloe se sont avérés protéger contre l'hépatotoxicité induite par le tétrachlorure de carbone chez le rat [18]. Il a été trouvé qu'il atténue la néphrotoxicité induite par le cisplatine in vivo [19,20]. Giloe a également été signalé comme étant antimutagène et actif contre le virus VIH [21,22]. Il a été utilisé cliniquement dans le traitement du cancer de la gorge chez l'homme [23]. Giloe s'est avéré être un pharmacophore non toxique et des études antérieures de ce laboratoire ont rapporté que l'extrait de dichlorométhane de giloe est non toxique jusqu'à une dose de 1,2 g/kg chez la souris [24,25]. De même, l'extrait méthanolique de giloe s'est également avéré non toxique jusqu'à une dose de 3,5 g chez la souris et le rat [26]. Il a été rapporté que l'extrait alcoolique de giloe atténue l'urotoxicité induite par le cyclophosphamide in vivo [27]. Il a été rapporté que l'utilisation de différents extraits de giloe tue les cellules cancéreuses du col d'une manière dépendante de la concentration [28,29]. Il a été rapporté que Giloe augmente l'effet destructeur cellulaire des radiations in vivo et in vitro plus tôt [25,30]. Une étude récente a montré que l'extrait de dichlorométhane de giloe augmentait l'effet du rayonnement en augmentant les dommages à l'ADN induits par le rayonnement, évalués par le test des comètes [31]. L'extrait brut d'une autre espèce de giloe, Tinosposa crispa s'est également avéré exercer un effet cytotoxique sur les cellules HeLa, MCF-7, MDAMB-231 et 3T3. in vitro [32].

        La prédiction de la réponse au traitement est de la plus haute importance pour le traitement du cancer et la détection précoce de la réponse au traitement permet aux médecins de concevoir des schémas thérapeutiques appropriés pour une meilleure guérison des tumeurs. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour prédire la réponse de la tumeur, notamment l'imagerie et l'expression des gènes [33,34]. Cependant, la méthode la plus efficace sera celle qui peut détecter les dommages à l'ADN dans les cellules cancéreuses individuelles. Il est également bien reconnu que les médicaments anticancéreux les plus actifs et les plus efficaces sont ceux qui endommagent l'ADN cellulaire et réduisent par la suite le potentiel clonogénique des cellules. Par conséquent, il semble prudent d'estimer l'effet endommageant l'ADN des agents antinéoplasiques sur les cellules normales et cancéreuses [35]. Le test des comètes est une technique simple qui permet de déterminer la quantité de dommages à l'ADN (cassures simple et double brin et changements de conformation) dans une seule cellule exposée à des agents endommageant l'ADN après élimination de la majeure partie du matériel non ADN et application d'un faible courant électrique à l'ADN restant inclus dans une matrice de gel d'agarose [36]. Habituellement, les cellules entières sont imprégnées dans un gel d'agarose, lysées et traitées in situ avec un alcali pour rendre l'ADN simple brin avant de soumettre le gel à un courant électrique. L'application d'un champ électrique approprié provoque la migration de l'ADN génomique hors du noyau vers l'agarose. Par la suite, l'ADN est coloré avec le colorant fluorescent intercalant bromure d'éthidium, qui permet la visualisation de l'ADN sous un microscope équipé d'une fixation par fluorescence. Au microscope à fluorescence, la combinaison de l'ADN qui est resté dans le noyau (tête) et de l'ADN qui a migré (queue) hors du noyau fait que les cellules individuelles ressemblent à une comète et d'où le nom de test de comète [36]. Les dommages à l'ADN sont estimés quantitativement au microscope en mesurant la longueur et l'intensité de la comète par rapport au signal de l'ADN nucléaire non migrant par rapport aux standards [36,37].

        L'extrait de Giloe a été rapporté pour induire des aberrations micronoyaux et chromosomiques d'une manière dépendante de la concentration dans les cellules HeLa dans nos études précédentes [28,38]. Cependant, le mécanisme d'action de l'extrait de giloe sur la destruction cellulaire reste à élucider. Le test des comètes alcalines peut détecter des cassures double et simple brin, des sites alcalino-labiles qui sont exprimés sous forme de cassures simple brin et des cassures simple brin associées à une réparation par excision incomplète [36]. Par conséquent, une tentative a été faite pour élucider les dommages à l'ADN moléculaire causés par l'extrait de giloe dans les cellules HeLa par un test de comète alcaline et les corréler avec la survie des cellules.

        Matériaux et méthodes

        Médicaments et produits chimiques

        L'extrait de tige au chlorure de méthylène de Giloe, Tinospora cordifolia (TCE) a été fourni par Krüumlger Pharmaceuticals (Bombay, Inde). Milieu essentiel minimum (MEM), L-glutamine, sulfate de gentamycine, sérum de veau fœtal, agarose à point de fusion normal et bas (LMA, Cat No. A-4718), acide éthylènediamine tertra acétique (EDTA), Triton-X et base Trizma , ont été fournis par Sigma Aldrich Chemical Co., Bangalore, Inde. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) et d'autres produits chimiques courants ont été obtenus auprès de Ranbaxy fine Chemicals, Mumbai, Inde.

        Préparation de la solution médicamenteuse

        La solution de TCE a été préparée en dissolvant 5 mg/ml de TCE dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et diluée dans du MEM de manière à obtenir des concentrations de 1, 2, 4, 6 ou 8 &mug/ml, respectivement immédiatement avant son utilisation. . La concentration de DMSO n'a jamais dépassé 0,2 %. Toutes les solutions médicamenteuses ont été préparées à nouveau immédiatement avant utilisation.

        Lignée cellulaire et culture

        Les cellules HeLa S3 ont été obtenues auprès du National Center for Cell Science, Pune, Inde, et ont été utilisées tout au long de l'étude. Le temps de doublement des cellules HeLa S3 est de 20 ± 2 h. Les cellules ont été cultivées en routine dans des flacons de culture de 25 cm 2 (Cellstar, Greiner, Allemagne) avec des bouchons desserrés contenant du milieu essentiel minimum d'Eagle (MEM) complété avec 10 % de sérum de veau foetal, 1 % de L-glutamine et 50 µg/ml de sulfate de gentamicine à 37°C dans une atmosphère de 5% CO2 dans l'air humidifié dans un CO2 incubateur (NuAir, Plymouth, USA).

        Conception expérimentale

        Habituellement, 5 x 105 cellules HeLa à croissance exponentielle ont été inoculées dans plusieurs flacons de culture (Techno Plastic Products, Trasading & eumln, Suisse). On a laissé les cellules atteindre la phase de plateau. Les cultures cellulaires ou cellules imprégnées d'agarose (détails donnés dans la section test des comètes) ont été réparties dans les groupes suivants en fonction du traitement :

        Groupe MEM : Les cellules de ce groupe ont été traitées avec 2 µl/ml de DMSO.

        Groupe TCE : Ce groupe de cellules a été traité avec 1, 2, 4, 6 ou 8 µg/ml de TCE.

        Sélection du moment optimal

        Une expérience distincte a été menée pour déterminer la durée de traitement optimale du traitement au TCE, où les cellules HeLa incorporées dans l'agarose de l'un ou l'autre groupe ont été traitées avec du DMSO ou 1, 2, 4, 6 ou 8 &mug/ml de TCE pendant deux ou quatre heures pour évaluer les dommages à l'ADN.

        Cinétique de réparation de l'ADN

        Une expérience distincte a été réalisée pour évaluer les dommages à l'ADN induits par diverses doses de TCE à 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 10, 12, 16, 18 ou 24 h après le traitement au TCE. La conception expérimentale était essentiellement similaire à celle décrite ci-dessus, sauf que les cellules HeLa ont été exposées au TCE pendant 4 h.

        Dosage clonogénique

        Un test clonogénique a été réalisé pour corréler la survie cellulaire avec les dommages à l'ADN [39]. En bref, 200 cellules HeLa ont été inoculées dans plusieurs boîtes de culture individuelles (Cellstar, Greiner, Allemagne) contenant 5 ml de milieu sans médicament en triple pour chaque concentration de TCE. Les cellules ont été exposées à 0, 1, 2, 4, 6 ou 8 pg/ml de TCE pendant 4 h et laissées croître pendant 11 jours après le traitement. Les colonies obtenues après 11 jours ont été colorées avec du violet cristallisé à 1 % dans du méthanol et les grappes contenant 50 cellules ou plus ont été notées en tant que colonie. L'efficacité de placage des cellules a été déterminée et la fraction survivante a été ajustée sur un modèle quadratique linéaire SF=exp&ndash(&alphaD+&betaD2).

        Essai de comète alcaline

        Les dommages à l'ADN pour les deux expériences ont été évalués par un test de comète alcaline comme décrit précédemment [36,40]. Le dosage des comètes a été réalisé en enrobant les cellules dans de l'agarose, suivi d'une lyse dans un tampon alcalin et enfin en soumettant le gel à un courant électrique. L'application de courant électrique a retiré l'ADN chargé du noyau, entraînant la migration des fragments d'ADN détendus et brisés loin du noyau par rapport à l'ADN intact, qui reste dans le noyau. Les images résultantes ressemblaient à des comètes stellaires, et l'intensité de fluorescence de chaque comète a été mesurée pour déterminer l'étendue des dommages à l'ADN [36,41]. Les dommages à l'ADN dans les cellules HeLa ont été déterminés en imprégnant les cellules dans de l'agarose sur des lames de microscope et en les traitant avec du DMSO (groupe MEM) ou du TCE pendant 2 ou 4 h (étude du temps optimal) ou 4 h (cinétique de réparation de l'ADN). Brièvement, les lames givrées d'un côté ont été recouvertes de 100 µl d'agarose à bas point de fusion à 0,6 % (préparé dans du PBS sans Ca2+ et Mg2+ à 37°C). Les lames recouvertes d'agarose ont été recouvertes d'une lamelle et placées sur de la glace pour permettre la solidification de l'agarose, après quoi les lamelles ont été retirées. Les aliquotes de 1 ml contenant 1 x 10 5 cellules HeLa récoltées dans le milieu de culture ont été centrifugées à 1500 rpm pendant 5 min. Les cellules culottées ont été remises en suspension dans 80 µl d'agarose à bas point de fusion à 0,6 % qui a été déposée sur la première couche et laissée se solidifier sous une lamelle sur de la glace. Pour les lames de réparation, des volumes égaux de suspension cellulaire (en MEM) et 1,2% de LMA (dissous dans MEM) ont été mélangés, superposés et laissés se solidifier sous une lamelle fraîche sur de la glace. Toutes les étapes ont été menées sous lumière diffuse pour éviter des dommages supplémentaires à l'ADN.

        Les lames givrées imprégnées de cellules, ont été conservées 2 h dans le tampon de lyse froid contenant 2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, base Trizma 10 mM (pH 10) et 1% Triton X-100 (ajouté à nouveau) pour solubiliser les protéines cellulaires laissant l'ADN sous forme de nucléoïdes. Après la lyse cellulaire, les lames ont été vidées du tampon de lyse et placées dans un réservoir d'électrophorèse sur gel horizontal rempli de tampon d'électrophorèse frais contenant 300 mM de NaOH, 1 mM de Na2EDTA (pH 13) à un niveau de

        0,25 cm au-dessus des toboggans. Les lames ont été laissées dans le tampon pendant 20 min afin de permettre le déroulement de l'ADN. L'électrophorèse a été réalisée pendant 20 min à 1,25 V cm-1 et 300 mA à froid. Les lames ont été égouttées et inondées lentement avec trois changements de tampon de neutralisation (base Trizma 0,4 M, pH 7,5) pendant 5 min chacun. Les cellules ont ensuite été colorées avec 50 pmul de bromure d'éthidium (2 mg/ml) et recouvertes d'une lamelle pour analyse immédiate sous un microscope à fluorescence.

        L'ADN coloré au bromure d'éthidium sur chaque lame a été visualisé à un grossissement de 40 fois à l'aide d'un microscope à fluorescence sous forme de &ldquocomets&rdquo avec une tête et une queue fluorescentes distinctes (Figure 1). Les images des comètes ont été acquises à l'aide d'un microscope à épifluorescence (Olympus BX51, Olympus Microscopes, Tokyo, Japon) équipé d'un filtre d'excitation 515-535 nm, d'un filtre barrière 590 nm et d'une caméra CCD (charged coulped device) (CoolSNAP-Provoir Kit d'appareil photo numérique couleur Ver 4.1, Media Cybergenetics, Silver Spring, Maryland, États-Unis). Habituellement, les données d'un total de 100 cellules par lame ont été collectées pour donner un résultat représentatif de la population cellulaire [42]. Les images de comètes ainsi capturées ont été analysées à l'aide du logiciel Komet (Version 5.5, Kinetic Imaging Ltd, Bromborough, UK). Le moment moyen de la queue d'olive (OTM) a été sélectionné comme le paramètre qui reflète le mieux les dommages à l'ADN et il a été calculé en tant que Tail DNA% x Tail Moment Length. La longueur du moment de la queue a été mesurée du centre de la tête au centre de la queue. L'OTM a été mesurée à partir de trois expériences indépendantes, chacune contenant des mesures en quintuple et présentée sous la forme Moyenne & plus SEM (Erreur standard de la moyenne).

        Figure 1: Image de comète représentative d'une cellule HeLa traitée au TCE. A gauche : non traitées et à droite : cellules HeLa traitées au TCE.

        analyses statistiques

        Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel statistique GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). La signification parmi tous les groupes a été déterminée par ANOVA à un facteur et le test post-hoc de Bonferroni a été appliqué pour des comparaisons multiples. Les expériences ont été répétées pour confirmer les résultats. Les résultats sont la moyenne de cinq expériences individuelles. Le test d'homogénéité a été appliqué pour découvrir la variation entre chaque expérience. Les données de chaque expérience ne différaient pas significativement les unes des autres et, par conséquent, toutes les données ont été combinées et les moyennes calculées. Une valeur p de <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

        Résultats

        Les résultats sont exprimés en moyenne Olive Tail Moment (OTM) ± SEM en Tableaux 1 et 2 et la survie cellulaire dans Chiffres 2-4.

        Concentration (µg/ml) Moment de queue d'olive (moyenne et plus SEM)
        Durée d'incubation
        2 heures 4 heures
        DMSO 0,761 &plus 0,061 0,84 + 0,045
        TCE (µg/ml) 1 5,24 + 0,052 8,61 &plus 0,024
        2 8,64 + 0,041 11,55 + 0,061
        4 13,51 &plus 0,082 17,57 + 0,044
        6 25,11 + 0,04 29,39 + 0,031
        8 43,23 &plus 0,074 58,92 &plus 0,064

        Tableau 1: Effet de différents temps de traitement sur les dommages à l'ADN mesurés en tant que moment de la queue d'olive (OTM) dans les cellules HeLa exposées à diverses concentrations d'extrait de giloe (TCE).

        Temps de traitement
        (h)
        Moment de queue d'olive (moyenne et plus SEM)
        DMSO TCE (µg/ml)
        1 2 4 6 8
        0 0,86 + 0,051 8,63 ± 0,023 a 11,58 &plus 0,061 un 17,64 &plus 0,044 un 28,91 + 0,031 un 59,02 ± 0,064 a
        0.25 0,88 + 0,041 8,69 + 0,024 un 11,81 &plus 0,047 un 18,06 ± 0,033 a§e 29,22 + 0,051 un 60,31 ± 0,066 a*
        0.5 0,91 + 0,056 9,42 ± 0,052 a* 12.27 ± 0.025 a* 19,37 + 0,035 a* 31,38 ± 0,054 a* 66,44 &plus 0,062 a*
        1 0,92 + 0,052 9,66 ± 0,0524 a* 13,37 ± 0,047 a* 20,22 ± 0,036 a* 33.55 ± 0.053 a* 69,12 ± 0,063 a*
        2 0,92 + 0,041 10,33 ± 0,054 a* 14,40 ± 0,048 a* 21,47 + 0,047 a* 35,14 ± 0,051 a* 73,30 ± 0,074 a*
        4 0,92 + 0,035 12.45 ± 0.025 a* 16,55 + 0,046 a* 23,28 ± 0,052 a* 38,20 ± 0,051 a* 75,92 ± 0,064 a*
        6 0,92 + 0,035 12.54 ± 0.056 a* 17,24 ± 0,051 a* 25,24 ± 0,042 a* 39,72 + 0,057 a* 81,32 ± 0,062 a*
        10 0,93 + 0,042 11,98 ± 0,054 a* 17,56 ± 0,052 a* 25,81 &plus 0,045 a* 40,38 ± 0,048 a* 81,64 ± 0,063 a*
        12 0,90 &plus 0,035 11,82 ± 0,054 a* 17,21 &plus 0,052 a* 24,73 ± 0,035 a* 41,12 ± 0,049 a* 81,02 &plus 0,061 a*
        16 0,89 + 0,056 10,8 + 0,056 a* 17,13 &plus 0,045 a* 24,12 ± 0,025 a* 41,34 + 0,047 a* 80,22 ± 0,061 a*
        18 0,89 + 0,054 10,21 &plus 0,047 a* 16,57 + 0,048 a* 23,91 ± 0,027 a* 40,57 ± 0,048 a* 79,13 ± 0,059 a*
        24 0,88 &plus 0,013 10,07 ± 0,054 a* 16,02 ± 0,049 a* 22,57 ± 0,034 a* 39,67 + 0,043 a* 78,04 ± 0,057 a*

        Tableau 2: Altération des dommages à l'ADN dans les cellules HeLa exposées à diverses concentrations d'extrait de giloe (TCE) à différents moments de post-traitement.

        Figure 2: Effet de diverses concentrations d'extrait dichlorométhane de giloe (TCE) sur la survie des cellules HeLa. Cercles ouverts : MEM et Cercles fermés : TCE.

        Figure 3: Corrélation des dommages à l'ADN (10 h) avec la survie cellulaire des cellules HeLa traitées avec différentes concentrations d'extrait dichlorométhane de giloe (TCE).

        Figure 4 : Spectre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) de la berbérine isolée à partir d'extrait de dichlorométhane de giloe (TCE).

        Sélection de la durée de traitement optimale

        Le traitement des cellules HeLa avec du DMSO pendant 2 ou 4 h n'a pas induit de dommages à l'ADN de base de manière significative. Cependant, le traitement des cellules HeLa avec différentes concentrations de TCE a augmenté significativement les dommages à l'ADN (p<0,0001) à 2 h après le traitement au TCE, comme indiqué par l'augmentation de l'OTM. L'augmentation de la durée du traitement au TCE des cellules HeLa jusqu'à 4 h a augmenté davantage les dommages à l'ADN par rapport à 2 h (Tableau 1). Étant donné qu'un plus grand dommage à l'ADN a été observé pour un traitement de 4 h, d'autres études ont été menées en utilisant ce temps d'exposition au TCE.

        Cinétique de réparation de l'ADN

        Le traitement au DMSO n'a pas modifié de manière significative les dommages à l'ADN de base dans les cellules HeLa à différents moments de post-traitement (Tableau 2). Les cellules HeLa traitées avec une concentration la plus faible de 1 µg/ml de TCE ont accentué les dommages à l'ADN de base d'environ 10 fois, ce qui était significativement plus élevé par rapport au traitement au DMSO seul à tous les temps de post-traitement (Tableau 2). Une augmentation supplémentaire de la concentration de TCE a entraîné une élévation dépendante de la concentration des dommages à l'ADN et l'augmentation maximale des dommages à l'ADN a été observée pour un traitement de 8 pg/ml de TCE. Les dommages à l'ADN étaient significativement élevés dans les cellules HeLa avec chaque concentration de TCE lorsque des comparaisons ont été faites entre diverses concentrations de TCE (p<0,001).

        L'évaluation des dommages à l'ADN après traitement avec diverses concentrations de TCE a montré une élévation continue des dommages à l'ADN jusqu'à 6 h, ensuite une baisse significative a été observée pour 1 µg/ml indiquant la réparation de l'ADN endommagé. L'augmentation de la concentration de TCE jusqu'à 2 & ndash8 &mug/ml a entraîné une plus grande élévation des dommages à l'ADN à 10 h, sauf pour 6 &mug/ml de TCE, où les dommages à l'ADN étaient maximum à 16 h après le traitement au TCE. Malgré cette augmentation, les différences entre 10 et 16 h après le traitement étaient statistiquement non significatives. Par la suite, une diminution non significative des dommages à l'ADN a été observée jusqu'à 24 h après le traitement.

        Dosage clonogénique

        L'intégrité reproductive des cellules HeLa n'a pas été affectée par le traitement au DMSO, comme en témoignent les changements non significatifs dans la survie des cellules HeLa (Figure 2). L'utilisation de diverses concentrations de TCE a entraîné une baisse dépendante de la concentration de la clonogénicité des cellules HeLa, comme en témoigne une baisse continue de la survie cellulaire et une fraction survivante (SF) la plus faible de 0,25 a été obtenue pour 8 &mug/ml (Figure 2). L'effet du TCE était supérieur à celui du traitement au DMSO à toutes les concentrations. Le CI50 s'est avéré être d'environ 5,2 &mug/ml.

        Réponse biologique

        Pour découvrir la relation entre la survie cellulaire et les dommages à l'ADN, la survie cellulaire a été tracée sur X-tandis que les dommages à l'ADN sur les axes Y, respectivement. L'augmentation des dommages à l'ADN a entraîné une réduction correspondante de la survie cellulaire indiquant une relation inverse entre la survie des cellules et les dommages à l'ADN. Cette relation entre la survie cellulaire et les dommages à l'ADN était linéaire quadratique (figure 3).

        Discussion

        Les plantes médicinales et les produits naturels ont été traditionnellement acceptés comme remèdes en raison de la croyance populaire selon laquelle ils produisent moins d'effets secondaires indésirables [2,38]. Par conséquent, la compréhension des effets bénéfiques ou indésirables potentiels des plantes médicinales et des produits naturels largement utilisés par la population humaine est très importante en tant que mesure de sécurité de la santé publique. Malgré le fait que la résistance aux médicaments soit un obstacle courant et majeur au succès du traitement du cancer par chimiothérapie, il n'est généralement pas possible de prédire le degré ou le moment de l'apparition de la résistance tumorale dans la plupart des schémas de chimiothérapie. Le test des comètes ou électrophorèse sur gel monocellulaire (SCGE) est devenu l'une des méthodes standard d'évaluation des dommages à l'ADN, avec des applications dans les tests de génotoxicité, la biosurveillance humaine, l'épidémiologie moléculaire ainsi que la recherche fondamentale sur les dommages et la réparation de l'ADN [36]. Des développements récents dans l'évaluation des dommages à l'ADN par essai de comète au niveau d'une cellule unique suggèrent que cette technique pourrait fournir une méthode pour identifier le potentiel de surveiller la réactivité des cellules tumorales à de nombreux agents anticancéreux in situ [43]. En principe, ce test pourrait être appliqué à toute tumeur accessible traitée avec des agents chimiothérapeutiques qui causent des dommages manifestes à l'ADN [44]. Le test des comètes ou SCGE a été utilisé pour la détection rapide et la quantification des dommages à l'ADN dans des cellules individuelles [36,45]. Ce test est basé sur la lyse alcaline de l'ADN labile sur les sites d'endommagement de l'ADN, où les cellules sont immobilisées dans une fine matrice de gel d'agarose sur des lames, une lyse douce et l'application d'un courant électrique sur la matrice d'agarose pendant l'électrophorèse. L'application de courant électrique provoque la migration de l'ADN détendu déroulé hors des limites du noyau cellulaire, ce qui peut être visualisé après coloration avec un fluorochrome d'acide nucléique. Les cellules qui ont subi des dommages à l'ADN apparaissent comme des comètes fluorescentes, avec des queues de fragmentation ou de déroulement de l'ADN [36]. Dans la présente étude, le potentiel de l'extrait de dichlorométhane de giloe (T. cordifolia) pour induire des dommages à l'ADN a été étudiée dans des cellules HeLa en culture.

        L'estimation des dommages à l'ADN a révélé une augmentation dépendante de la concentration des dommages à l'ADN et un dommage maximal à l'ADN a pu être discerné dans les cellules traitées avec du TCE pendant 4 heures par rapport à celles traitées seulement pendant deux heures. Par conséquent, ce temps de traitement a été choisi pour d'autres études. L'augmentation de la migration d'ADN dans les cellules HeLa observée après 4 h de traitement au TCE peut être probablement une somme de la génotoxicité ou de la cytotoxicité induite par le TCE. Des études antérieures ont montré que le traitement au TCE entraînait une augmentation de la fréquence des micronoyaux et des aberrations chromosomiques dans les cellules HeLa d'une manière dépendante de la concentration et les présents résultats sont conformes à nos conclusions antérieures selon lesquelles l'effet cytotoxique du TCE peut être dû aux dommages causés au génome cellulaire. au niveau moléculaire [25,28,38]. La berbérine, un alcaloïde isoquinoléique isolé du TCE, s'est avérée augmenter les dommages à l'ADN moléculaire jusqu'à 4 h après le traitement dans les cellules HeLa plus tôt [46]. De même, Agaricus blazei, un champignon, a été signalé comme augmentant les dommages à l'ADN jusqu'à 4 h après le traitement plus tôt chez le rat [47]. Le traitement au TCE a entraîné une élévation dépendante de la concentration des dommages à l'ADN dans les cellules HeLa et la concentration la plus faible de 1 µg/ml de TCE a augmenté les dommages à l'ADN de base d'environ 10 fois. Cette augmentation des dommages à l'ADN est directement liée au déclin de la survie cellulaire dans la présente étude.L'augmentation des dommages à l'ADN par le TCE dans les cellules HeLa a entraîné une réduction correspondante de la survie cellulaire et une réduction maximale de la survie a été observée pour 8 µg/ml de TCE, ce qui a induit la plus grande quantité de dommages à l'ADN. L'induction dépendante de la concentration des dommages à l'ADN par le TCE a par la suite entraîné une baisse correspondante de la survie cellulaire des cellules HeLa dans la présente étude. Une observation identique a été rapportée précédemment où l'augmentation de l'OTM (dommages à l'ADN) s'accompagnait d'une baisse correspondante de la survie cellulaire [48-51]. Il a également été rapporté que la berbérine accentue les dommages à l'ADN d'une manière dépendante de la concentration dans les cellules HeLa [46]. L'évaluation des dommages à l'ADN dans les cellules HeLa à divers moments de traitement post-TCE a révélé une élévation dépendante du temps des dommages à l'ADN jusqu'à 10 h après le traitement et un déclin marginal mais non significatif par la suite jusqu'à 24 h après le traitement, le dernier post-traitement. temps de traitement évalué. Cela indique que les cellules HeLa traitées avec diverses concentrations de TCE ont tenté en vain de réparer les dommages à l'ADN 10 h après le traitement, car les différences entre 10 et 24 h après le traitement étaient statistiquement non significatives. Un effet identique a été rapporté avec l'alcaloïde berbérine présent dans le TCE [46]. Le traitement à la bléomycine a également augmenté de manière continue l'OTM sans signe de réparation de l'ADN endommagé dans les cellules V79 jusqu'à 6 h après le traitement [41]. Dans la présente étude, les cellules avec un ADN endommagé présentaient une migration accrue de fragments d'ADN (queue de comète) à partir du noyau (tête de comète), ce qui peut également être une caractéristique de la fragmentation de l'ADN associée à la mort cellulaire nécrotique/apoptotique [45,49]. En revanche, des études antérieures ont rapporté la réparation des dommages à l'ADN après 1 h après le traitement chez des rats traités avec Agaricus blazei et des lignées cellulaires de cancer de la vessie après irradiation [44,47-49].

        L'évaluation de la réponse biologique donne une indication directe de l'association des dommages à l'ADN avec la cytotoxicité et une corrélation directe entre les dommages à l'ADN et la mort cellulaire a été observée dans la présente étude [28,30,31,40]. Il a été rapporté que le traitement au TCE augmentait les dommages à l'ADN moléculaire induits par le rayonnement et réduisait par la suite la survie des cellules HeLa plus tôt [31]. Il a été démontré que la berbérine présente une relation identique entre les dommages à l'ADN et la survie cellulaire [46]. De même, la survie cellulaire et les dommages à l'ADN ont été rapportés comme étant inversement corrélés dans les cellules V79 traitées avec la belomycine [40]. Un effet similaire a été rapporté pour l'induction de micronoyaux (un biomarqueur des dommages à l'ADN) et la mort cellulaire plus tôt [25,28,52-55].

        Le mécanisme exact d'induction des dommages à l'ADN par le TCE n'est pas connu. Les dommages accrus à l'ADN peuvent ne pas être attribués à un seul mécanisme, cependant, plusieurs mécanismes putatifs peuvent avoir été responsables de l'induction de dommages à l'ADN par le TCE. Le TCE peut avoir induit des radicaux libres et réduit le statut antioxydant des cellules en générant des espèces réactives de l'oxygène (ROS) causant des dommages à l'ADN cellulaire. Ces radicaux libres pourraient avoir causé des dommages à l'ADN par hydrolyse, oxydation et attaque électrophile. Il a été rapporté que Giloe augmente les radicaux superoxydes, le peroxyde d'hydrogène et le TNF&alpha [15]. L'induction de la peroxydation lipidique dans les cellules HeLa exposées au TCE peut être un autre mécanisme d'induction de dommages à l'ADN, où les peroxydes lipidiques ainsi produits auraient attaqué l'ADN moléculaire entraînant des dommages plus importants à l'ADN cellulaire [56,57]. Il a été démontré que le TCE augmentait plus tôt la peroxydation lipidique dans les cellules HeLa cultivées [29]. La berbérine, un alcaloïde est un constituant majeur du TCE et il a été rapporté qu'elle provoque une fragmentation de l'ADN internucléosomique, qui peut avoir conduit à la formation d'un complexe avec l'ADN et inhibe l'activité de l'enzyme topoisomérase II in vitro [58,59]. L'importance de la topoisomérase II réside dans le fait qu'elle agit en faisant passer un segment intact d'ADN duplex à travers une cassure double brin transitoire, qu'elle génère dans une double hélice séparée et l'inhibition de la topoisomérase II conduit à la stabilisation des cassures double brin de l'ADN et peut induisent ensuite un effet cytotoxique [60-62]. Le TCE peut avoir supprimé l'activité de la topoisomérase II provoquant la stabilisation des cassures transitoires des brins d'ADN, ce qui pourrait avoir augmenté les dommages à l'ADN et atténué la survie des cellules HeLa dans la présente étude. Il a été rapporté que le téniposide, un puissant inhibiteur de l'ADN topoisomérase II, stabilise les cassures double brin de l'ADN sans leur permettre de se rejoindre, entraînant la mort cellulaire et induit également des micronoyaux d'une manière dépendante de la concentration [52,63]. L'activation transcriptionnelle de NF-&kappaB et COX-II a été indiquée dans la réduction de l'apoptose et l'augmentation de la survie cellulaire [64,65]. Le TCE peut avoir supprimé l'expression de NF-&kappaB et COX-II dans HeLa, entraînant une survie cellulaire réduite. Récemment, il a été rapporté que la berbérine, un alcaloïde isoquinoléique et d'autres composés phytochimiques présents dans l'extrait de giloe suppriment la transactivation de NF-&kappaB et STAT3 [66,67]. L'inhibition de l'expression de COX-II par giloe [68] soutient cette affirmation.

        Il ressort clairement de notre étude que les effets cytotoxiques de giloe sont dus à sa capacité à induire des dommages à l'ADN, comme en témoigne l'augmentation de l'OTM. Cela peut être dû à la présence d'alcaloïde isoquinoléine berbérine, qui a été isolé de l'extrait au chlorure de méthylène de giloe (Figure 4). La berbérine a également été isolée de giloe plus tôt [69]. Il a été rapporté que la berbérine cause des dommages à l'ADN dans les cellules HeLa [46].

        Conclusion

        Le traitement des cellules HeLa avec différentes concentrations de giloe a entraîné une augmentation dépendante de la concentration des dommages à l'ADN moléculaire et de la mort des cellules HeLa. La destruction efficace des cellules par le TCE peut être due à l'induction de dommages à l'ADN et à la perte de la capacité de réparation de l'ADN des cellules HeLa. Le giloe peut avoir produit un stress oxydatif par la formation accrue de radicaux libres, la génération de ROS, l'induction de peroxydes lipidiques et son intercalation avec l'ADN nucléosomique. Giloe peut avoir inhibé l'action de la topoisomérase II, entraînant une escalade des dommages à l'ADN. L'inhibition de STAT3, NF-&kappaB et COX-II peut également avoir contribué à l'augmentation des dommages à l'ADN. Cette augmentation des dommages à l'ADN pourrait avoir été la principale cause de l'effet cytotoxique de giloe. La présence d'alcaloïdes isoquinoléiques berbérine en tant que composant actif peut avoir contribué à l'augmentation des dommages à l'ADN et aux effets cytotoxiques ultérieurs de la giole dans la présente étude.


        N-benzènesulfonamide

        Espèce : rat Souche : Wistar Sexe : mâle Détails sur les animaux d'essai ou le système d'essai et les conditions environnementales : ANIMAUX D'ESSAI
        - Source : TOXI-COOP ZRT., Cserkesz u. 90., H-1103 Budapest, Hongrie
        - Âge au début de l'étude : 56 - 61 jours au début du traitement
        - Poids au début de l'étude : 247,6 - 263,2 g
        - Affectés aux groupes de test de manière aléatoire : oui, tous les animaux ont été triés selon le poids corporel par ordinateur et regroupés selon les plages de poids.
        - Logement : 3 animaux/cage au groupe témoin positif 2 animaux/cages
        - Alimentation : ssniff® SM R/M-Z+H alimentation complète pour rats et souris (ssniff Spezialdiäten GmbH, D-59494 Soest Allemagne), ad libitum.
        - Eau : eau du robinet, ad libitum.
        - Période d'acclimatation : 6 jours

        CONDITIONS ENVIRONNEMENTALES
        - Température (°C) : 21,1 - 23,6
        - Humidité (%) : 35 - 64
        - Changements d'air (par h) : > 10
        - Photopériode (h obscurité / h lumière) : 12/12

        Administration / exposition

        Doses/concentrations ouvrir toutfermer tout

        Doses/concentrations 1

        Doses/concentrations 2

        Doses/concentrations 3

        Examens

        Tissus et types de cellules examinés : foie et estomac glandulaire Détails de la préparation des tissus et des lames : CRITÈRES DE SÉLECTION DE LA DOSE :
        Pour la sélection de la dose, la proposition de directive et les informations obtenues à partir d'une étude de toxicité orale aiguë précédemment réalisée sur l'élément d'essai chez le rat (DL50 > 2000 mg/kg pc) et d'une étude de toxicité à dose répétée ont été prises en considération. Sur la base de ces informations, la dose maximale sera de 2000 mg/kg pc/jour, et en plus de la dose maximale, deux doses supplémentaires, c'est-à-dire 1000 et 500 mg/kg pc/jour seront sélectionnées.
        Pour l'identification correcte de la dose maximale tolérée (DMT) en l'absence de décès, de signe de douleur, de souffrance ou de détresse, un test de détermination de la plage a été effectué dans le laboratoire d'essai, en utilisant les mêmes espèces, souche, sexe et schéma thérapeutique à utiliser dans l'étude principale.
        Dans le test de détermination des limites (sur la base des informations disponibles), deux animaux (rats mâles, CRL (WI) BR d'origine Wistar) ont été traités avec l'élément d'essai par administration orale à un volume de traitement de 10 ml/kg de poids corporel à la concentration de 2000 mg/kg pc/jour. Le traitement a été réalisé sur deux jours consécutifs à 24h d'intervalle. Au niveau de concentration choisi, ni mortalité ni signe clinique, aucune souffrance des animaux n'a été observée. Par conséquent, 2000 mg/kg de poids corporel/jour est choisi comme niveau de dose le plus élevé dans la présente étude.

        TEMPS D'ÉCHANTILLONNAGE :
        Dans ce test particulier, l'échantillonnage a été effectué 3 à 4 heures après le deuxième traitement (les animaux ont été euthanasiés conformément à la législation en vigueur sur le bien-être animal et aux principes des 3R et les cellules des tissus cibles ont été isolées) et on a pris soin d'autopsier tous les animaux à en même temps après la dernière dose.

        DÉTAILS DE LA PRÉPARATION DE LA DIAPOSITIVE :
        - Préparation de cellules uniques du foie :
        Une partie du lobe latéral gauche du foie a été prélevée et lavée dans le tampon de hachage froid jusqu'à ce qu'autant de sang que possible soit éliminé, puis placé dans du tampon de hachage (solution saline équilibrée de Hank's glacée (HBSS) contenant 20 mM d'EDTA et 10 % de DMSO ), émincé avec une paire de ciseaux fins pour libérer les cellules. La suspension cellulaire a été conservée sur de la glace pendant environ 30 secondes pour permettre aux gros amas de se déposer. Le surnageant a été pipeté dans un tube Eppendorf et utilisé pour les lames de comète.

        - Préparation monocellulaire de l'estomac glandulaire :
        L'estomac a été ouvert et lavé rapidement de la nourriture en utilisant une solution saline froide tamponnée au phosphate. Le préestomac a été retiré et jeté. L'estomac glandulaire a ensuite été placé dans un tampon de hachage froid et incubé sur de la glace pendant 15 à 30 minutes. Après l'incubation, l'épithélium de surface a été doucement gratté environ deux fois à l'aide d'une lame de scalpel. Cette couche a été jetée et la muqueuse gastrique a été rincée avec du tampon de hachage froid. Ensuite, l'épithélium de l'estomac a été soigneusement gratté 4 à 5 fois avec une lame de scalpel. La suspension cellulaire obtenue a été conservée sur de la glace pendant environ 30 secondes pour permettre aux gros amas de se déposer. Le surnageant a été pipeté dans un tube Eppendorf et utilisé pour les lames de comète.

        - Préparation des lames Comet Assay :
        La préparation des lames a été effectuée dans l'heure suivant la préparation des cellules individuelles. Au moins trois lames ont été préparées pour chaque animal pour chaque échantillon de tissu, avec au moins 5 animaux par groupe de dose. En résumé, au moins 15 lames par traitement et par tissu pour les groupes de traitement et le témoin véhicule et au moins 12 lames par tissu pour les témoins positifs. Les diapositives étaient correctement codées.

        Pré-traitement des lames :
        Des lames conventionnelles (superfrost) ont été plongées dans de l'agarose chaude à 0,5 % de point de fusion normal dans de l'eau. Après avoir retiré délicatement le dessous des lames, on a essuyé afin d'éliminer l'excès d'agarose. Les lames ont ensuite été posées sur une surface plane et ont été laissées sécher.

        Encastrement des cellules :
        Avant l'utilisation, un volume de 130 L d'agarose à point de fusion normal (NMA) à 0,5 % a été ajouté sur une lame de microscope pré-couche avec 0,5 % de NMA et recouverte d'une lamelle de verre. Les lames ont été placées sur un plateau jusqu'à ce que l'agarose durcisse (environ 5 minutes). Après les isolements cellulaires, chaque suspension cellulaire a été mélangée avec 0,5 % ou 1,0 % d'agarose à bas point de fusion (LMPA). Ensuite, 75 ul (environ 3 x 10^4 cellules) de ce mélange ont été ajoutés sur la lame de microscope après avoir glissé doucement la lamelle.
        Les lames de microscope ont été recouvertes d'une nouvelle lamelle. Après le durcissement du mélange LMPA-cellules, 70 L supplémentaires de NMA ont été déposés sur la lame de microscope après un glissement doux de la (deuxième) lamelle et une nouvelle lamelle supplémentaire a été posée sur la lame. Après le durcissement de la couche de NMA répétée, la lamelle a été retirée.

        - Lyse :
        Après que la couche supérieure d'agarose se soit solidifiée et que la dernière lamelle de verre ait été retirée, les lames ont été immergées dans une solution de lyse réfrigérée pendant au moins 1 heure (mais de préférence toute la nuit) à 2-8 ° C (au réfrigérateur) dans l'obscurité. Après la période d'incubation, les lames ont été rincées pour éliminer les détergents et les sels résiduels avant l'étape de déroulement alcalin. Cette procédure de rinçage a été réalisée dans du tampon d'électrophorèse.

        MÉTHODE D'ANALYSE :
        - Déroulage et électrophorèse :
        Les lames ont été retirées de la solution de lyse et placées au hasard sur une unité d'électrophorèse sur gel horizontale. L'unité a été remplie avec une solution d'électrophorèse fraîchement préparée jusqu'à ce que les surfaces des lames soient complètement recouvertes de la solution (à environ 1-2 mm au-dessus des lames).
        Pendant le déroulement et l'électrophorèse, une conception équilibrée a été utilisée pour placer des lames dans le réservoir d'électrophorèse afin d'atténuer les effets de toute tendance ou effet de bord dans le réservoir et de minimiser la variabilité d'un lot à l'autre.
        Les lames ont été laissées pendant 30 min. pour que l'ADN se déroule. Ensuite, l'électrophorèse a été réalisée pendant 30 min. en appliquant une tension constante de 25 V et un courant électrique d'environ 300 mA. Le courant a été enregistré au début et à la fin de la période d'électrophorèse. Toutes ces étapes ont été à l'abri de la lumière du jour pour éviter l'apparition de dommages supplémentaires à l'ADN. La température de la solution d'électrophorèse lors du déroulement et de l'électrophorèse a été maintenue à basse température, c'est-à-dire 2 à 10 °C à l'aide d'un refroidisseur spécial, et enregistrée une fois au cours de la procédure.

        - Neutralisation et conservation des lames :
        Après l'électrophorèse, les lames ont été retirées de l'unité d'électrophorèse, ont été recouvertes d'une solution de neutralisation, laissées au repos couvertes pendant environ 5 minutes, puis tamponnées et recouvertes à nouveau de solution de neutralisation. Cette procédure a été répétée deux fois. Par la suite, les lames ont été exposées pendant 5 minutes supplémentaires à de l'éthanol absolu afin de préserver toutes les lames.

        - Coloration :
        Les lames ont été séchées à l'air puis stockées à température ambiante jusqu'à ce qu'elles soient notées pour les comètes. Juste avant la notation de l'ADN, les lames ont été colorées en utilisant 50 L de 2 g/mL de bromure d'éthidium.

        - Évaluation des diapositives :
        Les lames codées ont été colorées et notées en aveugle. Les comètes ont été mesurées via une caméra numérique reliée à un système d'analyse d'images à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'un filtre d'excitation approprié à un grossissement de 200X. Pour l'analyse des images, le Komet 6.0 F (Andor Technology) a été utilisé.
        Pour chaque échantillon de tissu, cinquante cellules par lame ont été notées au hasard, c'est-à-dire 150 cellules par animal (750 cellules analysées par traitement d'élément de test, par témoin véhicule et 600 par témoins positifs).
        Les cassures de brins d'ADN dans le test des comètes ont été mesurées par des critères indépendants tels que le % d'ADN de la queue, le moment de la queue et la longueur de la queue.
        Olive Tail Moment (OTM), exprimé en unités arbitraires, est calculé en multipliant le pourcentage d'ADN (fluorescence) dans la queue par la longueur de la queue en m. La longueur de la queue est mesurée entre le centre de la tête de la comète et l'extrémité de la queue de la comète.
        Le % d'ADN de la queue est déterminé par l'intensité du fragment d'ADN dans la queue exprimée en pourcentage de l'intensité totale de la cellule.
        De plus, chaque lame a été examinée pour la présence de cellules fantômes. Les cellules fantômes ont été exclues de la collecte de données d'analyse d'images, mais la détermination de leur fréquence est utile pour l'interprétation des données. Les cellules fantômes ont été enregistrées pour chaque lame par animal, par type de traitement et par tissu.
        Critères d'évaluation : Le produit chimique d'essai est clairement négatif si :
        - aucune des concentrations testées ne présente d'augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant
        - il n'y a pas d'augmentation liée à la concentration lorsqu'elle est évaluée avec un test de tendance approprié
        - tous les résultats se trouvent à l'intérieur de la distribution des données historiques de contrôle négatif pour une espèce, un véhicule, une voie, un tissu et un nombre d'administration donnés
        - des preuves directes ou indirectes d'une exposition ou d'une toxicité au(x) tissu(s) cible(s) sont démontrées.

        Le produit chimique d'essai est clairement positif si :
        - au moins une des concentrations d'essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant
        - l'augmentation est liée à la dose lorsqu'elle est évaluée avec un test de tendance approprié
        - aucun des résultats n'est compris dans la distribution des données historiques de contrôle négatif pour une espèce, un véhicule, une voie, un tissu et un nombre d'administrations donnés. Statistiques : Les données ont été vérifiées pour la normalité et l'homogénéité de la variance avec les méthodes de test statistique adéquates.

        Résultats et discussion

        Résultats de test

        Informations complémentaires sur les résultats : RÉSULTATS DE L'ÉTUDE DE PORTÉE
        - Dose : 2000 mg/kg pc/jour.
        - Signes cliniques de toxicité chez les animaux de laboratoire : Au niveau de concentration choisi, ni mortalité ni signe clinique, aucune souffrance des animaux n'a été observée.

        RÉSULTATS DE L'ÉTUDE DÉFINITIVE
        - Adéquation des niveaux de dose et de la voie : La dose la plus élevée (2000 mg/kg pc/jour) est choisie selon les critères requis par la directive 489 de l'OCDE. L'exposition par voie orale a été choisie car cette voie était considérée comme la voie d'exposition la plus pertinente.
        - Évaluation statistique : La signification statistique des valeurs d'ADN de la queue, de la longueur de la queue, des valeurs OTM et du nombre de cellules fantômes a été réalisée en utilisant la méthode statistique appropriée, en utilisant le logiciel SPSS PC+. L'hétérogénéité de la variance entre les groupes a été vérifiée par le test d'homogénéité de la variance de Bartlett. Lorsqu'aucune hétérogénéité significative n'a été détectée, une analyse de variance à un facteur a été réalisée. En cas d'analyse positive, le test de gamme multiple de Duncan a été utilisé pour évaluer la signification des différences intergroupes. Lorsqu'une hétérogénéité significative a été trouvée, la distribution normale des données a été examinée par le test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données n'étaient pas distribuées normalement, la méthode non paramétrique de l'analyse de variance à un facteur de Kruskal-Wallis a été utilisée. En cas de résultat d'analyse positif, les comparaisons intergroupes ont été effectuées à l'aide du test U de Mann-Whitney.

        Toute autre information sur les résultats incl. les tables

        Résultats des mesures analytiques :

        L'analyse des formulations (pour le contrôle de chaque concentration et homogénéité) a été réalisée par une méthode HPLC avec détection UV en utilisant une méthode analytique préalablement validée. Sur la base des résultats de l'étude de validation disponible, l'élément de test s'est avéré suffisamment stable dans des formulations à 1 % de méthylcellulose à des concentrations de 50 et 200 mg/mL au moins pendant 1 jour au réfrigérateur (5 ± 3 °C). L'élément d'essai dans les formulations à 1 % de méthylcellulose a été considéré comme homogène. Les valeurs de concentration mesurées sont restées dans les ± 10 % de la plage nominale à toutes les concentrations.

        Résumé et conclusion du demandeur

        Le but du test des comètes (test d'électrophorèse sur gel unique) était d'évaluer le potentiel mutagène de l'élément de test en mesurant sa capacité à induire des dommages à l'ADN dans les organes cibles, les tissus comme spécifié et demandé par l'ECHA.Les formulations ont été préparées avant chaque traitement. L'élément d'essai a été formulé dans le véhicule à des concentrations nominales de 200, 100 et 50 mg/mL (doses correspondantes : 2000, 1000 et 500 mg/kg de poids corporel) a été appliqué et référé tout au long de l'étude. L'analyse des formulations (pour le contrôle de chaque concentration et de l'homogénéité) a été réalisée à l'aide d'une méthode analytique préalablement validée. Les valeurs de concentration mesurées sont restées dans les ±10 % de la plage nominale à tous les niveaux de concentration examinés.

        La substance d'essai a été administrée par voie orale par gavage deux fois : une fois le jour 0 et 24 heures par la suite aux doses des éléments d'essai et aux témoins négatifs. Les animaux témoins positifs ont été traités par gavage oral une fois au cours de l'expérience au jour 1. Les tissus cibles étaient l'estomac, le duodénum et le foie. Le temps d'échantillonnage était de 3 à 4 heures après le deuxième traitement (doses et témoin véhicule) et de 3 à 4 heures après le traitement (témoin positif). Les animaux ont été euthanasiés et les cellules des tissus cibles ont été isolées. La cytotoxicité a été déterminée sur un petit échantillon de chaque suspension cellulaire isolée suivant la technique d'exclusion au bleu Trypan, directement après l'échantillonnage. Avant la notation, l'ADN a été coloré avec 50 L de 20 μg/mL de bromure d'éthidium. Pour l'analyse des images, le Komet 6.0 F (Andor Technology) a été utilisé. De plus, chaque lame a été examinée pour la présence de cellules fantômes (indicateur possible de toxicité et/ou d'apoptose). Les cellules fantômes ont été exclues de la collecte de données d'analyse d'image. Le nombre d'animaux traités était de 6 animaux dans les groupes de dose et de 4 animaux du groupe témoin négatif dans le groupe témoin positif. Les cellules de 5 animaux ont été analysées dans les groupes de dose et le groupe témoin négatif et les cellules de 3 animaux ont été analysées dans le groupe témoin positif. Pour chaque échantillon de tissu, cinquante cellules par lame ont été notées au hasard, c'est-à-dire 150 cellules par animal (750 cellules analysées par traitement d'élément de test, par témoin véhicule et 450 par témoin positif).

        Tous les critères de validité concernant les traitements témoins négatifs et positifs ainsi que le nombre de cellules analysées et les niveaux de dose étudiés ont été respectés. Aucune mortalité n'a été observée pendant les traitements et la période d'expression dans aucun des groupes de dose jusqu'à la dose limite de 2 000 / 160 mg/kg de poids corporel/jour et chez les témoins. Aucun symptôme toxique ni aucun signe clinique n'a été observé pendant les traitements, quelle que soit la dose ou le groupe témoin. Lors de l'isolement des tissus, une apparence et une anatomie normales des organes cibles (estomac, duodénum et foie) ont été observées chez tous les animaux des groupes de dose et de contrôle. Cependant, à la dose examinée la plus élevée de 2000 mg/kg pc/jour chez trois animaux, de légères tympanites ont été observées dans le tractus gastro-intestinal. Le poids corporel moyen a augmenté dans tous les groupes de dose ainsi que dans les groupes témoins négatifs et positifs. Les augmentations de poids corporel étaient de l'ordre de 0,98 à 4,09 à 160 % par rapport aux valeurs de poids juste avant le premier traitement et juste avant le sacrifice. Lors des mesures de dépistage de la cytotoxicité (en utilisant la méthode d'exclusion du colorant bleu Trypan), aucune cytotoxicité n'a été observée dans les traitements des éléments de test et des éléments de contrôle sur aucun tissu cible. Dans les groupes traités avec l'élément de test examiné, le nombre de cellules fantômes dans les échantillons d'estomac, de duodénum et de foie est resté presque dans la même plage et ne différait pas de manière statistiquement significative de celui du véhicule témoin. Une augmentation statistiquement significative des cellules fantômes a été observée dans tous les tissus après le traitement EMS. Les cellules fantômes sont un indicateur possible de cytotoxicité et/ou d'apoptose. Selon la littérature, une fréquence accrue de cellules fantômes peut également indiquer des cellules présentant de graves dommages à l'ADN (génotoxicité). Pour être conscient des résultats de mutagénicité et de l'expérience antérieure du laboratoire, le nombre relativement plus élevé de cellules fantômes au niveau du contrôle positif, le traitement EMS est considéré comme un indicateur possible de génotoxicité. Les cassures de brins d'ADN dans le test des comètes ont été mesurées par des paramètres indépendants tels que le % d'ADN de la queue, la longueur de la queue et le moment de la queue olive (OTM). Les valeurs médianes (et les valeurs médianes moyennes) ont été calculées pour tous les paramètres examinés et évalués. Les valeurs médianes en % d'ADN de queue de chaque dose sont restées dans la plage de contrôle du véhicule dans les tissus examinés. Dans les échantillons d'estomac et de foie, les valeurs légèrement différentes (supérieures ou inférieures) ne différaient pas de manière statistiquement significative de celles du véhicule témoin jusqu'à la dose limite de 2000 mg/kg pc/jour. Dans l'échantillon de duodénum à 1000 mg/kg pc/jour, une valeur médiane du % d'ADN de la queue légèrement inférieure a été observée, qui différait de manière statistiquement significative de celle du véhicule témoin. La signification statistique obtenue a été considérée comme non pertinente pour l'évaluation de la mutagénicité puisque la signification est lié à une valeur inférieure qui se situe dans la plage des données de contrôle historiques. Les valeurs de longueur de queue déterminées dans les échantillons de duodénum et de foie n'ont montré aucune différence statistiquement significative. Dans les échantillons d'estomac, les valeurs de longueur de queue aux doses d'item d'essai de 500 et 1 000 mg/kg pc/jour étaient statistiquement significativement inférieures à la valeur de longueur de queue du véhicule témoin. Les significations statistiques obtenues aux valeurs de longueur de queue des échantillons d'estomac ont été considérées comme non pertinentes pour l'évaluation de la mutagénicité, car la signification est liée à une valeur inférieure qui se situe bien dans la plage des données de contrôle historiques. Les valeurs du moment de la queue d'olive déterminées dans les cellules de l'estomac, du duodénum et du foie des groupes traités avec l'élément de test ne différaient pas de manière statistiquement significative de celles du témoin du véhicule.

        L'élément de test étudié est négatif et n'a pas montré d'activité génotoxique dans les tissus examinés.

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