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1.1 : L'ADN comme matériel génétique - Biologie

1.1 : L'ADN comme matériel génétique - Biologie


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Au début des années 1900, beaucoup de gens pensaient que protéine doit être le matériel génétique responsable des caractéristiques héritées. L'une des raisons derrière cette croyance était la connaissance que les protéines étaient des molécules assez complexes et, par conséquent, elles doivent être spécifiées par des molécules de complexité égale ou supérieure (c'est-à-dire d'autres protéines). L'ADN était connu pour être une molécule relativement simple, par rapport aux protéines, et il était donc difficile de comprendre comment une molécule complexe (une protéine) pouvait être déterminée par une molécule plus simple (ADN). Quelles ont été les expériences clés qui ont identifié l'ADN comme le matériel génétique primaire ?

1928 F. Griffith

Fond:

Diplocoque pneumoniae, ou pneumocoque, est une vilaine petite bactérie qui, lorsqu'elle est injectée à des souris, provoque une pneumonie et décès dans la souris. La bactérie contient un polysaccharide capsulaire à sa surface qui protège la bactérie des défenses de l'hôte. Occasionnellement, des variantes (mutants) de la bactérie apparaissent qui présentent un défaut de production du polysaccharide capsulaire. Les mutants ont deux caractéristiques : 1) Ils sont avirulent, ce qui signifie que sans polysaccharide capsulaire approprié, ils sont incapables de développer une infection chez l'hôte (ils sont détruits par les défenses de l'hôte), et 2) En raison du manque de polysaccharide capsulaire, la surface de la bactérie mutante apparaît rugueux au microscope et se distingue des bactéries de type sauvage (dont la surface apparaît lisse).

Graphique 1.1.1 : Pneumocoque de type sauvage contre pneumocoque de type mutant

Le pneumocoque virulent lisse de type sauvage peut être traitement thermique et rendu avirulent (semble toujours lisse au microscope cependant). Enfin, il existe plusieurs sous-types du polysaccharide capsulaire du pneumocoque (sous-types I, II et III). Ces sous-types se distinguent facilement les uns des autres, et chaque peut donner naissance à des mutants dépourvus de polysaccharide capsulaire (c'est-à-dire du type rugueux avirulent).

Les expérimentations :

Les contrôles:

  • poids (lisse) + souris = souris morte
  • mutant (rugueux) + souris = souris vivante
  • w.t. traité thermiquement (lisse) + souris = souris vivante

Combinaisons :

  • w.t. traité thermiquement (lisse) + mutant (rugueux) + souris = souris morte

Dans ce cas, lorsque les bactéries ont été récupérées sur la souris froide et sans vie, il s'agissait de pneumocoques lisses et virulents (c'est-à-dire impossibles à distinguer du type sauvage).

Un examen plus approfondi de ce qui se passe, en continuant à utiliser et à suivre différentes sous-types

  • w.t. traité thermiquement (lisse) type I + mutant (rugueux) type II + souris = souris morte

Dans ce cas, lorsque les bactéries ont été isolées de la souris froide et sans vie, elles étaient lisses et virulentes type I pneumocoque.

Les conclusions générales de ces expériences étaient qu'il y avait un "agent de transformation" dans les bactéries de type I traitées thermiquement qui ont transformé les bactéries mutantes vivantes (rugueuses) de type II pour être capables de produire un polysaccharide de capsule de type I.

Question

L'"agent de transformation" était-il une protéine ou un ADN, ou quoi ?

1944 O.T. Avery

Fond:

L'expérience de Griffith ne pouvait pas être poussée plus loin jusqu'à ce que des méthodes soient développées pour séparer et purifier l'ADN et les composants cellulaires des protéines. Avery a utilisé des méthodes pour extraire l'ADN relativement pur du pneumocoque afin de déterminer s'il s'agissait de "l'agent de transformation" observé dans les expériences de Griffith.

L'expérience:

  • poids (lisse) type I -> extraire le composant ADN
  • mutant (rugueux) de type II + ADN de type I + souris = souris morte

L'isolement des bactéries de la souris morte a montré qu'elles étaient de type I w.t. bactéries (lisses)

Une expérience plus sophistiquée :

L'ADN de type I purifié a été divisé en deux aliquotes. Une aliquote a été traitée avec ADNase - une enzyme qui dégrade de manière non spécifique l'ADN. L'autre aliquote a été traitée avec Trypsine - une protéase qui dégrade (relativement) de manière non spécifique les protéines.

  • ADN de type I + DNAse + mutant (rugueux) de type II + souris = souris vivante
  • ADN de type I + Trypsine + mutant (rugueux) de type II + souris = souris morte

Conclusion:

Les travaux d'Avery ont fourni des preuves solides que "l'agent de transformation" était en fait de l'ADN (et non une protéine). Cependant, tout le monde n'était pas convaincu. Certaines personnes ont estimé qu'une quantité résiduelle de protéine pouvait rester dans l'ADN purifié, même après un traitement à la trypsine, et pourrait être l'"agent de transformation".

1952 A.D. Hershey et M. Chase

Fond:

T2 est un virus qui attaque les bactéries E. coli. Le virus ou phage, ressemble à un petit module d'alunissage :

Graphique 1.1.2 : Phage T2

Les particules virales s'adsorbent à la surface de la E. coli cellules. On savait qu'une partie du matériel quitte ensuite le phage et pénètre dans la cellule. Les particules de phage "vides" sur les cellules de surface peuvent être physiquement éliminées en mettant les cellules dans un mélangeur et en les fouettant. Dans tous les cas, une vingtaine de minutes après l'adsorption du phage à la surface de la bactérie, la bactérie éclate (lyse) et libère une multitude de virus descendants.

Si les milieux dans lesquels les bactéries se sont développées (et ont été infectées) comprenaient 32L'ATP marqué au P, le phage de descendance pourrait être récupéré avec cet isotope incorporé dans son ADN (les protéines normales ne contiennent que des atomes d'hydrogène, d'azote, de carbone, d'oxygène et de soufre). De même, si les médias contenaient 35Méthionine marquée au S, le phage de descendance résultant a pu être récupéré avec cet isotope présent uniquement dans ses composants protéiques (l'ADN normal ne contient que des atomes d'hydrogène, d'azote, de carbone, d'oxygène et de phosphore).

L'expérience:

Les phages ont été cultivés en présence de soit 32P ou 35S étiquettes isotopiques.

1) E. coli ont été infectés par 35Phage marqué S. Après l'infection, mais avant la lyse cellulaire, les bactéries ont été fouettées dans un mélangeur et les particules de phage ont été séparées des cellules bactériennes. Les cellules bactériennes isolées ont été cultivées davantage jusqu'à ce que la lyse se produise. Les phages descendants libérés ont été isolés.

Où le 35L'étiquette S est passée :

  • Coquilles de phage adsorbées 85%
  • Cellules infectées (avant la lyse) 15 %
  • Débris cellulaires lysés 15%
  • Progéniture phage <1%

2) E. coli ont été infectés par 32Phage marqué au P. Les mêmes étapes qu'en 1) ci-dessus ont été effectuées.

Où le 32L'étiquette P est devenue :

  • Coquilles de phage adsorbées 30%
  • Cellules infectées (avant lyse) 70 %
  • Débris cellulaires lysés 40%
  • Progéniture phage 30%

Conclusion:

Le matériel qui était transféré du phage à la bactérie pendant l'infection semblait être principalement de l'ADN. Même si les résultats n'étaient pas entièrement dénués d'ambiguïté, ils ont fourni un soutien supplémentaire à l'opinion selon laquelle L'ADN était le "truc" de l'héritage génétique.


L'ADN comme matériel génétique

Hershey et Chase ont étudié le bactériophage (phage = mangeur). Les phages sont des virus bactériens qui infectent les bactéries et provoquent la lyse des cellules. Ils ont une structure très simple d'une tête/collier/queue protéinée et d'un noyau d'ADN. On savait que les bactéries infectées par le phage étaient résistantes à une infection supplémentaire. En 1952, Hershey et Chase ont cultivé des bactériophages dans des conditions qui marqueraient spécifiquement l'ADN ou la protéine avec une radioactivité. Ils ont ensuite pris des phages avec de l'ADN radiomarqué et des bactéries infectées. En parallèle, ils ont prélevé un phage avec une protéine radiomarquée et ont infecté un autre ensemble de bactéries. Après juste assez de temps pour l'infection, les cultures bactériennes ont été placées dans un mélangeur pour séparer le bactériophage des bactéries.

Les solutions ont été centrifugées pour isoler les bactéries du phage. Les bactéries n'étaient radioactives que lorsque le phage cultivé dans des conditions permettant de radiomarquer l'ADN a infecté les bactéries pour indiquer que l'ADN pourrait être l'agent de transformation.


Comprendre la génétique : Un guide de New York, Mid-Atlantic pour les patients et les professionnels de la santé.

Presque tous les traits et maladies humains ont une composante génétique, qu'elle soit héritée ou influencée par des facteurs comportementaux tels que l'exercice. Les composants génétiques peuvent également modifier la réponse du corps à des facteurs environnementaux tels que les toxines. Il est important de comprendre les concepts sous-jacents de la génétique humaine et le rôle des gènes, du comportement et de l'environnement pour collecter et appliquer de manière appropriée les informations et les technologies génétiques et génomiques pendant les soins cliniques. Il est également important pour améliorer le diagnostic et le traitement des maladies. Ce chapitre fournit des informations fondamentales sur les concepts de base de la génétique, y compris la structure cellulaire, la base moléculaire et biochimique de la maladie, les principaux types de maladies génétiques, les lois de l'hérédité et l'impact de la variation génétique.


Pourquoi l'ADN est-il considéré comme du matériel génétique ? | Critères du matériel génétique | Caractéristiques de l'ARN

L'ARN (ou acide ribonucléique) est une structure simple brin qui se compose d'uracile comme base azotée au lieu de thymine et de sucre ribose.

L'ARN est également le matériel génétique de certains virus, tels que les virus de la mosaïque du tabac, le bactériophage QB, etc. De plus, dans tous les organismes, l'ARN remplit les fonctions dynamiques de messager et d'adaptateur. La plupart des processus vitaux essentiels (tels que le métabolisme, l'épissage, la traduction, etc.) sont effectués par l'ARN, mais l'ADN est toujours considéré comme le matériel génétique au lieu de l'ARN pour les raisons suivantes.

Pour être du matériel génétique, une molécule doit remplir les critères suivants :

(i) Il devrait être capable de générer (ou fabriquer) sa réplique.

(ii) Il doit toujours être chimiquement et structurellement stable.

(iii) Il devrait permettre des changements lents (ou mutations) essentiels à l'évolution.

(iv) Il devrait être capable de s'exprimer sous la forme de « caractères mendéliens »

En examinant un à un tous ces critères, on constate que :

> Sur la base de la règle de l'appariement des bases et de la complémentarité, l'ADN et l'ARN ont la capacité de fabriquer leur réplique (ou d'effectuer des duplications). Alors que les protéines ne remplissent pas ce critère (ou premier critère).

> Les deux brins d'ADN étant complémentaires l'un de l'autre, s'ils sont dénaturés (ou séparés par chauffage) se rejoignent (ou se renaturent) lorsque les conditions favorables sont rétablies.

> De plus, en raison de la présence d'un groupe 2'-OH à chaque nucléotide de l'ARN, il s'agit d'un groupe réactif, ce qui rend l'ARN labile et facilement dégradable. Pendant ce temps, l'ARN est également connu pour être de nature catalytique, il est donc réactif.

Par conséquent, l'ADN est chimiquement moins réactif et structurellement plus stable que celui de l'ARN. Par conséquent, l'ADN est chimiquement et structurellement plus stable. Ainsi, l'ADN remplit le deuxième critère.

De plus, la présence de thymine à la position de l'uracile dans l'ADN confère une stabilité supplémentaire à l'ADN.

Par conséquent, à l'exception des critères de stabilité, l'ADN et l'ARN peuvent fonctionner comme du matériel génétique, mais l'ADN étant plus stable, il est préférable de stocker des informations génétiques. Mais, pour la transmission de l'information génétique, l'ARN est le plus préférable.

Par conséquent, à l'exception de certains virus, l'ADN plutôt que l'ARN porte le code génétique héréditaire dans toutes les formes de vie biologique sur Terre.

L'ADN est également plus résistant et plus facile à réparer que l'ARN. En conséquence, l'ADN sert de support plus stable de l'information génétique qui est très essentielle pour la survie et la reproduction dans toutes les formes vivantes.

Ainsi, l'ADN est considéré comme un matériel génétique au lieu d'ARN et de protéines.


ADN : comme matériel héréditaire et propriétés du matériel génétique (ADN versus ARN)| La biologie

Les principes d'hérédité donnés par Mendel et la découverte de la nucléine (acides nucléiques) par Meischer (1871) ont presque coïncidé, mais il a fallu beaucoup de temps pour prétendre que l'ADN agit comme un matériel génétique. Des découvertes antérieures faites par Mendel, Walter Sutton, T.H. Morgan et d'autres avaient limité la recherche de matériel génétique aux chromosomes.

Les chromosomes sont constitués d'acides nucléiques et de protéines et sont connus comme des véhicules héréditaires. Dans le premier cas, il est apparu que les protéines seraient du matériel héréditaire, jusqu'à ce que des expériences soient effectuées pour prouver que les acides nucléiques agissent comme du matériel génétique.

L'ADN (acide nucléique désoxyribose) s'est avéré être un matériel génétique dans tous les êtres vivants, à l'exception de quelques virus végétaux où l'ARN est le matériel génétique car l'ADN ne se trouve pas dans de tels virus.

A. Preuves de l'ADN comme matériel héréditaire:

Le concept que l'ADN est le matériel génétique a été soutenu par les preuves suivantes :

1. Transformation bactérienne ou principe de transformation (effet Griffith):

En 1928, Frederick Griffith, un médecin britannique a rencontré un phénomène, maintenant appelé transformation bactérienne. Ses observations concernaient la bactérie Streptococcus pneumoniae (Fig. 6.12) qui est associée à certains types de pneumonie. Au cours de cette expérience, un organisme vivant (une bactérie) s'était transformé en forme vivante.

Cette bactérie se retrouve sous deux formes :

Quelles cellules produisent une capsule de polysaccharides (muqueux), rendant les colonies sur gélose lisses et plutôt brillantes ? Cette souche est virulente (pathogène) et provoque une pneumonie.

Dans ce cas, les cellules manquent de capsule et produisent des colonies rugueuses (R) ternes.

La présence ou l'absence de capsule est connue pour être génétiquement déterminée.

Les souches S et R sont présentes dans plusieurs types et sont appelées respectivement S-I, S-II, S-III etc. et R-I, R-II et R-III etc.

Des mutations de lisse à rugueuse se produisent spontanément avec une fréquence d'environ une cellule sur 10 7 bien que l'inverse soit beaucoup moins fréquent.

Griffith a réalisé son expérience en injectant les bactéries ci-dessus à des souris et a trouvé les résultats suivants :

(a) Des bactéries S-III (virulentes) ont été injectées à des souris, les souris ont développé une pneumonie et sont finalement décédées.

(b) Des bactéries R-II (non virulentes) ont été injectées à des souris, les souris n'ont souffert d'aucune maladie car la souche R-II n'était pas pathogène.

(c) Lorsque Griffith a injecté de la chaleur des bactéries S-III tuées à des souris, celles-ci n'ont pas souffert de pneumonie et ont donc survécu.

(d) Un mélange de bactéries R-II (non virulentes) et S-III tuées par la chaleur a été injecté à des souris, les souris ont développé une pneumonie et sont mortes. En postmortissant les souris mortes, il a été remarqué que leur sang cardiaque contenait à la fois des souches de bactéries R-II et S-III.

Ainsi, un facteur génétique provenant de cellules S-III mortes a converti les cellules R-II vivantes en cellules S-III vivantes et ces dernières ont produit la maladie. En bref, les cellules R-II vivantes ont été transformées d'une manière ou d'une autre. Ainsi, l'effet Griffith est progressivement devenu connu sous le nom de transformation et s'est avéré être la première étape dans l'identification du matériel génétique.

Caractérisation biochimique du principe de transformation:

Identification de la substance génétique transformante:

En 1944, seize ans après l'expérience de Griffith, Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn McCarty (1933-1944) ont rapporté avec succès la répétition de la transformation bactérienne, mais in vitro. Ils ont pu identifier le matériel génétique en transformation. Ils ont testé des fractions de cellules tuées par la chaleur pour la capacité de transformation. Leurs conclusions étaient comme sous.

(i) L'ADN seul des bactéries S a provoqué la transformation des bactéries R.

(ii) Ils ont découvert que les protéases (enzymes de digestion des protéines) et la RNAse (enzymes de digestion de l'ARN) n'affectaient pas la transformation.

(iii) La digestion avec l'ADNase a inhibé la transformation.

Ainsi, ils ont finalement conclu que l'ADN est le matériel héréditaire.

Mélange injecté à des souris saines

1. Cellules vivantes de type R-U + Capsule de type S-III tuée par la chaleur.

Les souris n'ont pas développé de pneumonie.

2. Cellules vivantes de type R-II + Paroi cellulaire de type S-III tués par la chaleur.

3. Cellules vivantes de type R-II + Cytoplasme de type S-III tué par la chaleur (sans ADN)

4. Cellules vivantes de type R-II + ADN de type S-III tué par la chaleur.

Les souris ont développé une pneumonie et sont mortes.

5. Cellules vivantes de type R-II + ADN de type S-III tué par la chaleur + ADNase

Les souris n'ont pas développé de pneumonie.

Par conséquent, il est désormais hors de tout doute raisonnable que l'ADN est le matériel héréditaire.

2. Infection bactériophage:

L'agent infectieux viral est l'ADN. En utilisant des traceurs radioactifs, Alferd Hershey et Maratha Chase (1952) ont mis en évidence que l'ADN est le matériel héréditaire de certains bactériophages (virus bactériens).

Structure de T2 bactériophage :

Ce virus bactérien contient une enveloppe protéique externe non génétique et un noyau interne de matériel génétique (ADN). Le T2 les phages sont en forme de têtard différenciés en région de la tête et de la queue. La tête est une structure allongée, bipyramidale, à six côtés composée de plusieurs protéines.

Dans la tête (Fig. 6.13) se trouve une molécule d'ADN fermée et sans terminaison. Les dimensions de la tête sont telles qu'elle est capable d'y emballer étroitement la molécule d'ADN. La queue est un cylindre creux. La queue porte 24 stries hélicoïdales.

(ii) Certains autres bactériophages ont été cultivés dans des bactéries ayant du 32P. Ce 32P radioactif était limité à l'ADN des particules de phage.

Six fibres de queue apparaissent à partir d'une plaque hexagonale à l'extrémité distale de la plaque. La queue est formée uniquement de protéines. L'enveloppe externe protéinée contient du soufre (S) mais pas de phosphore (P), tandis que l'ADN contient du phosphore mais pas de soufre.

Hershey et Chase (1952) ont mené leur expérience sur T2 phage qui attaque la bactérie Escherichia coli.

Les particules de phage ont été préparées en utilisant des radio-isotopes de 35 S et 32 ​​P dans les étapes suivantes :

(i) Peu de bactériophages ont été cultivés dans des bactéries contenant du 35 S. Ce radioactif était du 35 S incorporé dans les acides aminés cystéine et méthionine des protéines et ainsi ces acides aminés avec du 35 S formaient les protéines du phage.

(ii) Certains autres bactériophages ont été cultivés dans des bactéries ayant du 32P. Ce 32P radioactif était limité à l'ADN des particules de phage.

Ces deux préparations de phages radioactifs (une avec des protéines radioactives et une autre avec de l'ADN radioactif) ont été autorisées à infecter la culture d'E. coli. Les enveloppes protéiques ont été séparées des parois cellulaires bactériennes par agitation et centrifugation.

Les cellules bactériennes infectées les plus lourdes pendant la centrifugation se sont accumulées au fond (Fig. 6.14). Le surnageant contenait les particules de phage plus légères et d'autres composants qui n'ont pas réussi à infecter les bactéries.

Il a été observé que les bactériophages à ADN radioactif donnaient naissance à des pastilles radioactives avec 32 P dans l'ADN. Cependant, dans les particules de phage contenant des protéines radioactives (avec 35 S), les culots bactériens ont des radioactivités presque nulles, ce qui indique que les protéines n'ont pas réussi à migrer dans la cellule bactérienne.

Ainsi, on peut conclure sans risque que pendant l'infection par le bactériophage T2, c'est l'ADN qui est entré dans la bactérie. Elle a été suivie d'une période d'éclipse au cours de laquelle l'ADN du phage se réplique de nombreuses fois dans la cellule bactérienne (Fig. 6.15).

Vers la fin de la période d'éclipse, l'ADN du phage dirige la production de l'assemblage des enveloppes protéiques des particules de phage nouvellement formées. Le lysozyme (une enzyme) provoque la lyse de la cellule hôte et libère les bactériophages nouvellement formés.

L'expérience ci-dessus suggère clairement que c'est l'ADN du phage et non la protéine qui contient l'information génétique pour la production de nouveaux bactériophages. Cependant, dans certains virus végétaux (comme le TMV), l'ARN agit comme matériel héréditaire (étant l'ADN absent).

B. Propriétés du matériel génétique (ADN versus ARN):

L'ADN est le matériel génétique L'ARN s'est avéré être le matériel génétique du TMV (virus de la mosaïque du tabac), du bactériophage β, etc. L'ADN est le matériel héréditaire majeur de la plupart des organismes. L'ARN remplit principalement les fonctions de messager et d'adaptateur. Ceci est principalement dû aux différences entre la structure chimique de l'ADN et de l'ARN.

Propriétés requises du matériel génétique:

Cela fait référence à la duplication de son matériel génétique par une réplication fidèle qui est montrée à la fois par l'ADN et l'ARN. Les protéines et autres molécules présentes dans l'être vivant ne présentent pas cette propriété.

La stabilité du matériel génétique doit exister. Il ne devrait pas changer sa structure facilement avec les étapes de la vie modifiées, l'âge de la physiologie des êtres vivants. Même dans l'expérience de Griffith sur le principe de transformation, l'ADN a survécu dans des bactéries tuées par la chaleur. Les deux brins d'ADN qui sont complémentaires peuvent être séparés.

L'ARN est responsable et facilement dégradable en raison de la présence d'un groupe 2’-OH présent dans chaque nucléotide. L'ARN étant catalytique, il est devenu réactif. Parce que l'ADN est plus stable que l'ARN, on dit qu'il est un meilleur matériel génétique. La présence de thymine au lieu d'uracile est une autre raison qui conduit à la stabilité de l'ADN.

Le matériel génétique devrait pouvoir subir une mutation et un tel changement devrait être hérité de manière stable. Les acides nucléiques ADN et ARN ont la capacité de muter. L'ARN mute plus rapidement que l'ADN. Les virus avec un génome à ARN présentent une mutation et une évolution plus rapides et ont donc une durée de vie plus courte.

Tableau 6.6. Types d'acides nucléiques :

Macromolécule en forme de double hélice avec plusieurs milliers de sous-unités.

Principalement dans le noyau, également dans les mitochondries et les chloroplastes.

Agit comme réserve d'instructions codées pour la synthèse de toutes les protéines requises par la cellule.

Acide ribonucléique messager.

Polymère simple brin avec des centaines de sous-unités.

Dans le noyau et le cytoplasme, en particulier les ribosomes.

Fabriqué sur la matrice d'ADN, il porte des instructions codées pour la synthèse d'une ou plusieurs protéines du noyau aux ribosomes.

Acide ribonucléique ribosomique.

Molécule très étroitement liée à la fraction protéique.

Fait partie de la structure du ribosome. Aide à localiser correctement l'ARNm sur la surface du ribosome.

Transférer l'acide ribonucléique.

Polymère simple brin de moins de cent sous-unités.

De nombreux types d'ARNt agissent comme transporteurs d'acides aminés. Prenez l'acide aminé spécifique du cytoplasme au modèle d'ARNm sur le ribosome.

4. Expression génétique :

L'ARN exprime facilement les caractères sous forme de protéines. L'ADN a besoin d'ARN pour la formation de protéines. L'ADN étant plus stable est considéré comme meilleur que l'ARN pour le stockage de l'information génétique. Cependant, pour la transmission des caractères génétiques, l'ARN donne de meilleurs résultats.


Contenu

Stahl, comme ses deux sœurs aînées, est diplômé des écoles publiques de Needham, une banlieue de Boston. En 1951, il a obtenu un baccalauréat en biologie du Harvard College et s'est inscrit au département de biologie de l'Université de Rochester. Son intérêt pour la génétique a été cimenté en 1952 par son introduction aux virus bactériens (phages) dans un cours enseigné par A. H. (Gus) Doermann au laboratoire biologique de Cold Spring Harbor. En 1956, il obtient un doctorat en biologie pour ses travaux avec Doermann sur la génétique du phage T4. En 1955, il entreprend des études postdoctorales avec Giuseppe Bertani (dans le groupe Phage) à Caltech (Pasadena) dans le but d'apprendre une certaine génétique bactérienne. Il s'est ensuite tourné vers des collaborations avec Charley Steinberg et Matt Meselson. Avec Steinberg, il a entrepris des analyses mathématiques de la croissance, de la mutation et de la recombinaison génétique de T4. Avec Meselson, il a étudié la réplication de l'ADN dans Escherichia coli. Cette étude a fortement soutenu le modèle semi-conservateur proposé par Jim Watson et Francis Crick. [2]

Pendant un an, Stahl a fait partie de la faculté de zoologie de l'Université du Missouri à Columbia, Missouri, avant d'accepter, en 1959, un poste au nouvel Institut de biologie moléculaire de l'Université de l'Oregon à Eugene. Au cours des années suivantes, ses recherches ont porté sur les phages T4 et Lambda et la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, en se concentrant principalement sur la recombinaison génétique. Il a enseigné divers cours de génétique à l'Oregon et a présenté des cours sur les phages en Amérique, en Italie et en Inde. Il a entrepris des études sabbatiques à Cambridge, au Royaume-Uni, à Édimbourg, à Jérusalem et à Cambridge, dans le Massachusetts. [2]

Les recherches de Stahl ont été entreprises en association avec de nombreux collègues, en particulier ses associés de longue date Jean M. Crasemann (1921-1992), Mary M. Stahl (1935-1996) et Henriette (Jette) M. Foss (1937-date). [2] Depuis sa retraite en 2001, il vit avec Jette et quatre lamas à Eugene, où il continue de soumettre des articles de recherche et participe à la gouvernance de l'Université d'Oregon.

Stahl et sa femme Mary (mariée en 1955) ont élevé deux garçons et une fille. Les survivants sont Andy Stahl, forestier et militant politique, et Emily Morgan, coiffeuse et propriétaire de magasin. Avec sa compagne Jette, il partage cinq enfants (plus les conjoints) et huit petits-enfants, dont cinq adoptés. [2]


Contexte historique et fondements scientifiques

L'étude de l'hérédité a commencé comme une réponse à la théorie des caractéristiques acquises de Jean-Baptiste Lamarck (1744-1829). Cela a proposé que les traits acquis par un individu au cours de sa vie, que ce soit en réponse aux conditions environnementales ou causés par ses propres habitudes, seraient hérités par sa progéniture. En 1856, un moine autrichien nommé Gregor Mendel (1822-1884) a commencé à tester les théories de Lamarck avec des expériences d'hybridation de plants de pois.

Contrairement aux prédictions lamarckiennes, il a découvert que des caractéristiques particulières, telles que la couleur des fleurs ou la forme des graines, étaient transmises à la progéniture par des cellules spéciales, qu'il appelait des « facteurs », qui déterminaient comment ces traits étaient exprimés. Grâce à son travail, Mendel a pu lier le phénotype d'un organisme (son apparence externe) à son génotype hérité (son héritage génétique) et illustrer les effets des gènes dominants et récessifs. Il a montré que ces facteurs étaient hérités dans des rapports mathématiques prévisibles.

Parce que Mendel a travaillé en marge de la communauté scientifique, ses découvertes sont restées inconnues jusqu'en 1900, lorsque le botaniste et généticien allemand Carl Correns (1864-1933), le botaniste néerlandais Hugo de Vries (1848-1935) et le botaniste autrichien Erich von Tschermak-Seysenegg (1871-1962) a découvert indépendamment les réalisations de Mendel. Tout en créditant de Vries, Correns a relié les découvertes antérieures sur la méiose (le processus par lequel les cellules sexuelles - ovule et sperme - se reproduisent) et les lois de l'hérédité de Mendel pour proposer la théorie chromosomique de l'hérédité, concluant que « chaque cellule germinale doit recevoir l'un ou l'autre des les facteurs que Mendel tenait pour responsables des traits dominants ou récessifs. À l'intérieur de la cellule, les gènes étaient enchaînés sur les chromosomes comme des perles dans un collier, se copiant pendant la méiose et se séparant au fur et à mesure de la division de la cellule.

La découverte de l'ADN : Johann Friedrich Miescher et Nuclein

Cependant, les scientifiques ne comprenaient toujours pas comment l'information génétique de l'ancien chromosome était transférée vers le nouveau. En 1871, Johann Friedrich Miescher, professeur suisse de pathologie à l'Université de Bâle, a identifié l'ADN comme l'un des composants biochimiques des chromosomes. Miescher a extrait des noyaux cellulaires de globules blancs ou de lymphocytes qu'il a obtenus à partir de pansements hospitaliers usagés, car ils étaient remplis de pus. En poursuivant ses recherches, Miescher s'est rendu compte que les noyaux des cellules contenaient autre chose que des protéines. Ce matériau étrange n'a pas réagi avec l'enzyme digestive pepsine, montrant qu'il n'était pas de nature protéique. Cette substance, qu'il appela « nucléine », rebaptisée acide nucléique par le pathologiste allemand Richard Altmann (1852-1900) en 1889, était présente dans une grande variété de cellules. Il a découvert qu'il contenait du phosphore en plus du carbone, de l'hydrogène, de l'azote et de l'oxygène. Cette substance s'est avérée être de l'ADN. Bien que Miescher ait émis l'hypothèse que sa « nucléine » pourrait être impliquée d'une manière ou d'une autre dans la fécondation, il n'a pas poussé ses hypothèses plus loin.

Malgré la découverte de la nucléine, de nombreux biologistes ont continué à croire que le matériel génétique était de nature protéique. Les chromosomes contiennent beaucoup de protéines, et les protéines semblaient de bons candidats pour être la molécule qui contenait le code génétique car elles étaient composées de 20 acides aminés différents. L'ADN, en revanche, ne contenait que quatre nucléotides, il était donc considéré comme trop simple pour contenir le code génétique.

Le travail d'Oswald Avery, Colin Macleod et Maclyn McCarty dans les années 40

Les travaux de Miescher ont été largement ignorés jusqu'aux années 1940, les protéines étant considérées comme la source du matériel génétique. Comme l'a commenté Bentley Glass, professeur de biologie à Johns Hopkins,

« L'aveuglement lamentable des scientifiques quant à la signification d'une substance chimique [acide nucléique] si uniquement limitée au noyau, et même aux chromosomes eux-mêmes, a duré jusqu'en 1944, lorsque les travaux d'Avery, Macleod et McCarty sur le phénomène de transformation dans Pneumocoque enfin réveillé les généticiens à l'importance de l'ADN.

Quelles ont été leurs expériences ? Le microbiologiste britannique Frederick Griffith (1881-1941), travaillant avec deux types de pneumocoques, a découvert que la bactérie pouvait être amenée à modifier la spécificité immunologique. L'une était la souche S virulente, qui avait une membrane cellulaire lisse ou « revêtement polysaccharidique lisse ». L'autre était la souche R considérablement plus douce et à revêtement rugueux dont les colonies de boîtes de Pétri avaient en fait des bords déchiquetés.

Lorsque Griffith a injecté des souris avec la bactérie de type S, elles sont mortes rapidement en injectant la souche R à un autre groupe n'a pas affecté leur santé. Il a ensuite pris la bactérie S virulente et l'a soumise à une chaleur intense, qui a semblé détruire sa capacité à infecter les souris. Mais lorsqu'il a mélangé le type S traité thermiquement avec la souche à revêtement rugueux plus doux et a injecté ce mélange à des souris, les souris sont mortes en quelques jours. Des échantillons de sang des souris mortes ont montré des niveaux élevés de pneumocoque virulent, ce qui l'a amené à conclure que quelque chose avait poussé la souche bénigne à adopter une nouvelle couche de polysaccharide lisse et à devenir mortelle. La source de cette transformation génétique était cependant inconnue.

En 1943, alors qu'il était sur le point de prendre sa retraite, le bactériologiste américain d'origine canadienne Oswald Avery (1877-1955), médecin et chercheur à l'Institut Rockefeller, a décidé de rechercher quel agent a causé cette transformation bactérienne. En utilisant la centrifugation, lui et ses collègues Maclyn McCarty (1911-) et Colin MacLeod (1909-1972) ont utilisé la centrifugation pour éliminer les grandes structures cellulaires des bactéries de type S, qu'ils ont traitées avec des protéases, des enzymes qui ont éliminé les protéines des cellules, puis mélangé les souches S et R ensemble.

Les bactéries R ont été transformées en une souche virulente, de sorte que les protéines ne pouvaient pas porter les gènes. Le reste des bactéries S a été traité avec une enzyme qui a éliminé l'ADN lorsqu'il a été mélangé avec les bactéries R, il n'y a eu aucun changement. Cela signifiait que l'ADN contenait des informations héréditaires cellulaires. Avery, McCarty et MacLeod ont ainsi démontré que l'ADN, et non les protéines, contenait les gènes d'une cellule. La structure physique de l'ADN, cependant, était encore un mystère.

Détermination de la structure de l'ADN

Avant la Seconde Guerre mondiale (1939-1945), deux chromatographistes, le cristallographe irlandais John Desmond Bernal (1901-1971) à Cambridge et le physicien anglais William Astbury (1898-1961) à Leeds, ont utilisé la diffraction des rayons X pour déterminer la structure moléculaire des cristaux. Les plans atomiques du cristal ont provoqué des interférences entre les faisceaux de rayons X entrants lorsqu'ils ont quitté le cristal. Les motifs d'interférence ont révélé la structure de la molécule.

À l'aide de centaines d'images de diffraction des rayons X, Astbury a construit un modèle d'ADN pour voir comment ses bases de sucre et de phosphate s'emboîtent. Les résultats l'ont convaincu que les bases de la molécule étaient empilées les unes sur les autres comme un tas de pièces de un cent, espacées de 3,4 Angströms (un Angström [Å], équivaut à un dix-milliardième de mètre).

La question restante de la structure de l'ADN serait partiellement répondue par Erwin Chargaff (1905-2002), un biochimiste autrichien et réfugié de guerre travaillant à l'Université de Colombie. Après avoir lu l'article d'Avery sur la transformation bactérienne en 1944, il s'est tourné vers l'étude de l'ADN et de ses quatre bases chimiques, ou nucléotides : adénine (A), cytosine (C), guanine (G) et thymine (T). En utilisant la chromatographie pour analyser les tissus végétaux et animaux, Chargaff s'est rendu compte que les proportions de A et T étaient presque les mêmes que celles de C et G.

La quantité totale des molécules de pyrimidines (T et C) était également égale à la quantité totale des purines (A et G). Bien que Chargaff ait senti que ce rapport 1:1 était important, il ne comprenait pas comment il était lié à la structure globale de l'ADN.

La question de Rosalind Franklin

Rosalind Franklin (1920–1958) was an x-ray crystallographer who until 1951 was known primarily for her groundbreaking work with the crystalline structure of coal and other carbons. Educated at Cambridge, she received her doctorate in 1945, and worked at the Laboratoire Central des Services Chimique de L'Etat in Paris. In 1951 Franklin left coal research to go to King's College, London, to study the structure of DNA with Maurice Wilkins (1916–2004).

Franklin discovered that there were two different forms of DNA, A and B, which had to be separated to get clear x-ray diffraction images of each. Franklin even developed a special camera to improve the DNA-fiber orientation in the x-ray beam to photograph the B form. One picture from this apparatus, photograph 51, verified Astbury's work, showing that each helical curve in B-form DNA was 34Å long and contained 10 base pairs.

From her data, Franklin proposed a double-helix structure for the DNA molecule, with sugar phosphates composing its external backbone, and hydrophobic (water-hating) base pairs of purines and pyrimidines on the inside. In 1951, James Watson attended a talk she gave on her work. The following year, he was also given a copy of a report of Franklin's work in this area by one of Franklin' co-workers. This proved instrumental to his and Crick's later discovery of DNA's structure.

James Watson and Francis Crick

Watson and Crick, based at Cambridge University, were also working on the DNA problem. Crick, trained as a physicist, had designed circuits for acoustic and magnetic mines for the British Admiralty during World War II. Watson, 12 years younger, had studied zoology and microbiology at Indiana University. After meeting Maurice Wilkins at a symposium and seeing the x-ray diffraction pattern of crystalline DNA, Watson changed research directions. In October 1951 he took a fellowship to work on DNA with Crick at the Cavendish laboratory at Cambridge.

Their first attempts in November 1951 were not successful, based as they were on the ideas of American biochemist Linus Pauling (1901–1994), who was also close to solving the structure. Pauling had discovered in 1948 that a large number of proteins were shaped like a spring coil, termed the alpha-helix. Watson and Crick, taking Pauling's idea of a helix but misinterpreting Franklin's data, initially proposed a model in which the nucleotide bases were on the outside of the helix. So unpromising was their initial model that laboratory chiefs told Watson and Crick to abandon their efforts. Pauling incorrectly proposed a triple-helical structure in January 1952, and Watson persuaded his bosses to let the model building resume at Cambridge before Pauling saw his error and corrected it.

The data from Franklin's 1951 lecture had convinced Watson and Crick that the nucleotide bases belonged on the inside of the DNA molecule. Chargaff, who consulted with the duo, later recalled in his work Heraclitean Fire: Sketches from a Life before Nature.

So far as I could make out, they wanted, unencumbered by any knowledge of the chemistry involved, to fit DNA into a helix. The main reason seemed to be Pauling's alpha-helix model of a protein. I told them all I knew. If they had heard before about the pairing rules, they concealed it. But as they did not seem to know much about anything, I was not unduly surprised. I mentioned our early attempts to explain the complementarity relationships by the assumption that, in the nucleic acid chain, adenylic was always next to thymidylic acid and cytidylic next to guanylic acid. I believe that the double-stranded model of DNA came about as a consequence of our conversation but such things are only susceptible of a later judgment.

In 1953, Watson visited King's College, London, where Franklin and Wilkins worked. Without her knowledge, Wilkins showed Franklin's photograph 51 to Watson. Franklin's colleague and member of a research oversight committee, Austrian-born chemist Max Perutz (1914–2002), also gave Watson a copy of Franklin's 1952 MRC Report. Watson later admitted, “Rosy [Franklin], of course, did not directly give us her data. For that matter, no one at King's realized they were in our hands.”

After seeing photograph 51 and the MRC report and consulting with Chargaff, Watson and Crick had all the pieces of the DNA puzzle. Crick realized, as Franklin did not, that while the molecule consisted of two spiral chains in a helix, the strands ran parallel to each other—in opposite directions. Watson, now knowing

the base pairs were inside the molecule, made cardboard cutouts of the four DNA bases, and put them together in various ways. When he noticed that an A—T pair matched the shape of a G—C pair, he realized that in the DNA double helix, a base on one side is matched by its opposite on the other. When separated, each half of the chain becomes the template for a new, identical sequence.

Watson, Crick, and Wilkins shared the 1962 Nobel Prize for medicine or physiology for their discovery. Like Marie Curie before her, however, Rosalind Franklin's work had exposed her to high doses of radiation before its dangers were known she died of ovarian cancer in 1958. Despite her enormous contributions to the research, she was not mentioned by the prize committee, as the Nobel is not awarded posthumously. Cambridge University later named a building in Newnham College in her honor.

After DNA: Deciphering the Genetic Code

Once the structure of DNA had been determined, the challenge in the late 1950s and early 1960s was to determine how its information expressed genetic traits. How do the four nucleic acids code for specific proteins that comprise the cell's working parts? As Crick noted in his Nobel lecture,

It now seems certain that the amino acid sequence of any protein is determined by the sequence of bases in some region of a particular nucleic acid molecule. Twenty different kinds of amino acid are commonly found in protein, and four main kinds of base occur in nucleic acid. The genetic code describes the way in which a sequence of twenty or more things is determined by a sequence of four things of a different type.

The main issue in cracking the genetic code was 1) to determine how many base pairs would code for the 20 amino acids that composed proteins, and 2) discover what series of bases specified which amino acids. Simple mathematics indicated that because there were 20 possible amino acids, and there were four bases (A, T, C, G), there had to be at least three bases, a codon, to code for each protein. As Crick again noted,

This can hardly be done by a pair of bases, as from four different things we can only form 4 × 4 = 16 different pairs, whereas we need at least twenty and probably one or two more to act as spaces or for other purposes. However, triplets of bases would give us 64 possibilities. It is convenient to have a word for a set of bases which codes one amino acid and I shall use the word “codon” for this.

But could this theoretical supposition be proven in the laboratory? In a 1961 experiment, Crick and his colleague, South African-born biologist Sydney Brenner (1927–), created genetic mutations in the DNA of a bacteriophage, a virus that infects bacteria. Crick and Brenner induced the mutations using a chemical called proflavine to change individual bases in the DNA, destroying the function of a particular and crucial phage gene. They found that if there were two or four mutations together, the gene was still inactive, but if three mutations were put together in the same gene, the gene started working. In other experiments, Crick and Brenner used proflavine to delete bases one by one in the DNA, demonstrating that only after three bases next to each other were eliminated did the DNA transcribing system come back to its correct phase, and the gene would begin to work again.

Their results indicated that the genetic code was one in which three bases coded for an amino acid. As DNA unwinds during replication, it is read by a molecule called RNA polymerase this, in turn, makes a template for protein synthesis called messenger RNA (mRNA), a process called transcription. An organelle called a ribosome then “reads” each codon in the mRNA and another carrier molecule called transfer RNA (tRNA) brings the appropriate amino acid called for by the

codon. The amino acids are then linked together to make the protein by the ribosome. This process is called translation.

After Crick and Brenner's discovery, a key question remained: Which particular triplet of nucleotides (codon) coded for which particular amino acid? In 1961 American zoologist Marshall Nirenberg (1927–) and German biochemist Heinrich Matthaei, working at the National Institutes of Health in Bethesda, Maryland, finally cracked the genetic code. Nirenberg took Escherichia coli (E. coli) bacteria and ground them up with a mortar and pestle to release their cytoplasm, which contained all the organelles, such as ribosomes, needed for protein synthesis.

Nirenberg then made a synthetic RNA made of just the base uracil and combined it with the E. coli cytoplasm to see which amino acid would be created. This created a protein chain made only of phenyalanine, so Nirenberg realized the codon coded for phenylalaline. Similar experiments revealed which codons coded for the nineteen other amino acids. By 1965, Nirenberg understood the language of DNA.


Molecular markers used in forensic genetics

Forensic genetics is a field that has become subject to increasing interest in recent years. Both the technology and the markers used for forensic purposes have changed since the 1980s. The minisatellite sequences used in the famous Pitchfork case introduced genetics to the forensic sciences. Minisatellite sequences have now been replaced by more sensitive microsatellite markers, which have become the basis for the creation of genetic profile databases. Modern molecular methods also exploit single nucleotide polymorphisms, which are often the only way to identify degraded DNA samples. The same type of variation is taken into consideration in attempting to establish the ethnicity of a perpetrator and to determine phenotypic traits such as the eye or hair colour of the individual who is the source of the genetic material. This paper contains a review of the techniques and molecular markers used in human and animal forensic genetics, and also presents the potential trends in forensic genetics such as phenotyping.

Mots clés: Forensic genetics SNP STR forensic DNA phenotyping.


Dad’s DNA butts in

It’s not clear why mtDNA prefers being exclusively maternal, but a higher rate of mutation in paternal mtDNA may have something to do with it. With the huge array of mechanisms that different species have evolved to prevent interloping paternal contributions, it seems that evolution is holding males' contribution at arm’s length. And while some species have been found to have “leaking” paternal DNA, including mice and sheep, reports in humans have been very limited. Aside from the case in Denmark, a review of other reports argued that they could all be “ascribed solely to contamination and sample mix-up.”

Taosheng Huang and his colleagues were keen to avoid that kind of problem, so when they found weird patterns in a patient’s mitochondrial DNA, they sent fresh samples to be resequenced. The results came back the same: the four-year-old boy had both paternal and maternal mtDNA, and so did his two sisters.

The detective work was just beginning. Huang and his colleagues sequenced the mtDNA of 11 people in the family, finding a pattern of paternal contributions. When they looked at two other families, both with a family member with suspected mitochondrial disease, they found similar results. Altogether, they found 17 people across the three families with mixed mtDNA. In all cases, there was a backup check: the whole procedure was “repeated independently in at least two different laboratories by different laboratory technicians with newly obtained blood samples,” the researchers write.

Because the researchers explored the genomes of whole families, they were able to work out the pattern of transmission across generations. Some people in the families weren’t affected they just had typical maternal mtDNA. It seemed that if a mother had mixed mtDNA, she passed that mixture directly to the kids—the kids would inherit the same mixture she had, essentially getting male mtDNA from further up in the family tree. But if a father had mixed mtDNA, he passed some of his own mtDNA on to his kids.

All of this pointed to the males in the family as the likely source of the escape hatch to the normal paternal dead-end. The pattern suggests that there could be a gene running in the families that allows paternal mtDNA to hitch a ride into the egg with their sperm, and then persist there—and that gene is probably in the normal, nuclear genome rather than the mtDNA itself. That genetic trait could then get passed down, giving every male that inherits it the capacity to pass their mtDNA to their offspring.


Plus de femmes que d'hommes ont ajouté leur ADN au pool génétique humain

Plus de femmes que d'hommes ont contribué au pool génétique de l'humanité depuis que les premiers humains modernes ont quitté l'Afrique il y a environ 70 000 ans, selon une étude.

Bien que les lois de la biologie stipulent que l'ADN masculin et féminin devrait contribuer à peu près à parts égales à la prochaine génération, elles ne disent pas combien de personnes de chaque sexe doivent être impliquées dans l'entreprise.

Des chercheurs allemands ont découvert que tout au long de l'histoire de l'humanité, les mères étaient régulièrement plus nombreuses que les pères, ce qui signifie que plus de femmes ont transmis leur ADN que les hommes.

Il y avait peut-être plus de femmes que d'hommes dans le passé, un déséquilibre qui pourrait aider à expliquer les résultats. Mais les chercheurs soulignent les préjugés culturels, selon lesquels relativement peu d'hommes se sont accouplés avec plusieurs femmes et les femmes ont tendance à déménager chez elles pour vivre avec leurs partenaires.

"Imaginez une population de 100 femmes et 100 hommes", a déclaré Mark Stoneking, qui a dirigé l'étude à l'Institut Max Planck d'anthropologie évolutive. "Si toutes les femelles mais un seul des mâles se reproduisaient, alors que les mâles et les femelles contribuent à 50:50 à la génération suivante, la contribution des mâles provient entièrement d'un seul mâle." La génération suivante aurait tous le même chromosome Y, mais 100 ensembles différents d'ADN mitochondrial, transmis uniquement par la lignée maternelle.

L'équipe de Stoneking a rassemblé les génomes de 623 hommes de 51 populations à travers le monde. Ils ont ensuite comparé la diversité génétique des chromosomes Y mâles avec la diversité de l'ADN mitochondrial des hommes.

Ils ont découvert que les différences génétiques entre les populations humaines étaient presque toujours plus importantes pour le chromosome Y que pour l'ADN mitochondrial. La seule exception était l'Asie de l'Est.

À l'aide de modèles informatiques, les chercheurs ont montré que les différences de diversité génétique survenaient si plus de femmes que d'hommes se reproduisaient au cours de l'histoire humaine. Selon leur simulation, une population ancestrale de 60 femmes et 30 hommes se reproduisaient en Afrique avant que les humains ne quittent le continent. Le nombre est tombé à environ 25 femmes et 15 hommes reproducteurs au moment de la première migration de Homo sapiens, il y a environ 70 000 ans. La population entière aurait été plus nombreuse, mais les extras ne contribuaient pas au pool génétique.

Alors que les humains modernes se sont installés en Europe il y a plus de 45 000 ans, le nombre de mères pourrait avoir dépassé le nombre de pères d'environ 100 à 30, selon Stoneking. Son étude est publiée dans la revue Investigative Genetics.

Dans les populations statiques, la diversité génétique diminue avec le temps parce que certaines personnes n'ont pas d'enfants, de sorte que leurs caprices génétiques disparaissent. Mais la tradition des femmes qui déménagent pour être avec leurs partenaires a aidé à contrer le déclin génétique en important de l'ADN frais.

"Ce que nous avons découvert, c'est qu'il existe des différences significatives dans l'histoire des hommes et des femmes humains dans différentes parties du monde. Comprendre pourquoi c'est le cas et quels sont les processus historiques sociaux qui ont conduit à ces différences sont ce que nous voulons étudier maintenant », a déclaré Stoneking.


Voir la vidéo: Biology: Cell Structure I Nucleus Medical Media (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Cameron

    Une pensée très intéressante

  2. Yozshujas

    À mon avis, c'est évident. Je m'abstiendrai de commenter.

  3. Faekree

    Oui en effet. Je m'abonne à tout ce qui précède.Discutons de cette question.

  4. Gabrielo

    C'est oui!



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