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Rôle du chlorure de calcium lors de la préparation des cellules compétentes

Rôle du chlorure de calcium lors de la préparation des cellules compétentes


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Je suis conscient du fait que le $CaCl_2$ se dépose sur la paroi cellulaire, la rendant moins négative, peut-être en formant une liaison avec l'acide teichoïque. De plus, en raison de la charge positive, il attire l'ADN (l'ADN est chargé négativement en raison du groupe phosphate). Mais y a-t-il autre chose que le $CaCl_2$ fait ? De plus, si c'est le travail de $CaCl_2$, pourquoi ajoutons-nous d'abord $MgCl_2$ dans le protocole standard de préparation chimique des cellules compétentes ?


Bien que nous n'ayons aucune preuve concluante sur le fonctionnement de $CaCl_2$, le mécanisme suggéré est très similaire à ce que vous avez suggéré. Lorsque $CaCl_2$ se dissocie en solution aqueuse, les ions $Ca^{2+}$ se lient aux groupes phosphate de l'ADN ainsi qu'au noyau interne des lipopolysaccharides dans la membrane cellulaire (Dagert et al, 1979), les neutralisant. Après cela, le choc thermique permet l'absorption de cet ADN dans l'hôte (le fonctionnement du choc thermique n'est pas non plus connu ; il est suggéré qu'une augmentation de la température crée des pores dans la membrane cellulaire, voir cette réponse). Pour une représentation visuelle, voir ce diagramme (à partir d'ici) :

Concernant $MgCl_2$, le rôle de $Mg^{2+}$ n'est pas complètement compris non plus. Cependant, $Mg^{2+}$ est connu pour favoriser la croissance cellulaire (Hanahan et al, 1983). C'est peut-être parce que $Mg^{2+}$ est un facteur important requis pour le fonctionnement des ribosomes (Nierhaus et al, 2014). De toute façon, son rôle dans l'augmentation des compétences semble être moindre que celui de $Ca^{2+}$.

P.S. : pendant l'expérience, $Mn^{2+}$, $Rb^+$ et $K^+$ fonctionnent aussi efficacement avec $Ca^{2+}$ (Hanahan et al, 1983).

Les références:

  1. Dagert, M. ; Ehrlich, S. (1979). « Une incubation prolongée dans du chlorure de calcium améliore la compétence des Escherichia coli cellules". Gène. 6 (1) : 23-28. doi:10.1016/0378-1119(79)90082-9. PMID 383576

  2. Douglas Hanahan, Études sur la transformation de Escherichia coli avec des plasmides, Journal of Molecular Biology, Volume 166, Issue 4, 1983, Pages 557-580, ISSN 0022-2836, http://dx.doi.org/10.1016/S0022-2836(83)80284-8.

  3. Nierhaus K.H. $Mg^{2+}$, $K^+$, et le ribosome J. Bacteriol. 2014 196 3817-3819


Rôle du chlorure de calcium lors de la préparation des cellules compétentes - Biologie

Un système amélioré pour la préparation de cellules compétentes et la transformation de plasmides à haute efficacité utilisant différents Escherichia coli souches

Zhiming Tu
Laboratoire conjoint de génie génétique et de génomique des cultures HUST-Res Chine-Royaume-Uni
École des sciences et technologies de la vie
Université des sciences et technologies de Huazhong
Wuhan, 4300074, Chine
Tél. : 86 27 87556214
Télécopieur : 86 27 87548885
Courriel : [email protected]

Guangyuan He*
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
École des sciences et technologies de la vie
Université des sciences et technologies de Huazhong
Wuhan, 4300074, Chine
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Kexiu X. Li
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
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Mingjie J. Chen
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École des sciences et technologies de la vie
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Wuhan, 4300074, Chine
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Junli Chang
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
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Wuhan, 4300074, Chine
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Ling Chen
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
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Université des sciences et technologies de Huazhong
Wuhan, 4300074, Chine
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Qing Yao
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
École des sciences et technologies de la vie
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Wuhan, 4300074, Chine
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Dongping P. Liu
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
École des sciences et technologies de la vie
Université des sciences et technologies de Huazhong
Wuhan, 4300074, Chine
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Huan Ye
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
École des sciences et technologies de la vie
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Wuhan, 4300074, Chine
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Télécopieur : 86 2787548885

Jiantao Shi
Laboratoire conjoint Chine-Royaume-Uni HUST-RRes de génie génétique des cultures et de génomique
École des sciences et technologies de la vie
Université des sciences et technologies de Huazhong
Wuhan, 4300074, Chine
Tél. : 86 27 87556214
Télécopieur : 86 2787548885

Aide financière: Plan de développement des États de la haute technologie (« Plan "863" ».

Mots clés:
cellules compétentes, E. coli, plasmide, stockage, transformation.

cfu : Unités formant colonie
TB : tampon de transformation de CaCl2 Solution.

Cet article décrit un système de transformation bactérienne efficace qui a été établi pour la préparation de cellules compétentes, la préparation de plasmides et pour le stockage dans des stocks bactériens dans notre laboratoire. En utilisant cette méthode, un certain nombre de plasmides différents ont été amplifiés pour d'autres expériences. Des cellules compétentes pour la transformation bactérienne ont été préparées par la méthode au chlorure de calcium avec une concentration optimale de 75 mM. Trois souches différentes de Escherichia coli qui ont été testées sont DH5α, TG1 et XL1 blue, et la souche la plus efficace étant XL1 blue. La densité optique optimale (DO600) pour la préparation des cellules compétentes variait pour chacune des souches étudiées, et pour XL1 blue, il était de 0,15-0,45 pour TG1, il était de 0,2-0,5 et pour DH5α, il était de 0,145-0,45. Le temps de stockage des cellules compétentes et sa corrélation avec l'efficacité de transformation ont été étudiés, et le résultat a montré que les cellules compétentes peuvent être stockées à -20ºC pendant 7 jours et à -70ºC pendant 15 jours. Trois modifications critiques aux méthodes précédentes ont été apportées, qui sont le changement de la normale CaCl2 solution à la solution TB, le changement du milieu de LB à S.O.C., et l'ajout de DMSO ou PEG8000 lors de la transformation de cellules compétentes avec des plasmides. Le changement de milieu de LB à S.O.C. a entraîné une croissance beaucoup plus rapide des transformants et l'efficacité de la transformation a été augmentée. Ajout de DMSO ou PEG8000 a augmenté l'efficacité de transformation de 100 à 300 fois. Notre système de transformation bactérienne amélioré peut augmenter l'efficacité de transformation d'environ 10 3 fois, ce qui en fait un système de transformation bactérienne très efficace.

La transformation du plasmide en cellules bactériennes compétentes est une technique clé du clonage moléculaire. Au début des années 1970, Cohen (Cohen et al. 1973) a réussi à transformer le facteur R et les plasmides recombinants en E. coli cellules en utilisant une méthode au chlorure de calcium. Depuis lors, cette méthode a été largement utilisée en raison de sa commodité. Une autre méthode de transformation utilisée est l'électroporation qui se traduit par une efficacité de transformation plus élevée allant jusqu'à 10 9 - 10 10 transformants/μg d'ADN (Ryu et Hartin, 1990). McCormac (McCormac et al. 1998) a publié une méthode simple pour la production de cellules hautement compétentes de Agrobactérie tunrefaciers/rhizobium pour la transformation par électroporation. Okamoto (Okamoto et al. 1997) a également signalé une transformation à haute efficacité de Bacillus brevis par électroporation, cependant, un équipement spécial est nécessaire pour l'électroporation que de nombreux laboratoires ne peuvent pas fournir. Tsen a trouvé certaines souches de E. coli peuvent incorporer des plasmides extracellulaires dans le cytoplasme « naturellement » à de basses fréquences (Tsen et al. 2002). Kurien et Scofield ont décrit une méthode rapide et modérément efficace de transformation de colonies bactériennes (Kurien et Scofield, 1995). Plus récemment, Chen a proposé une méthode alternative pratique et rapide pour la transformation génétique de E. coli avec des plasmides. En mélangeant les cellules réceptrices et l'ADN plasmidique et en les étalant directement sur des plaques de milieu sélectif contenant du Ca 2+, la soi-disant « transformation sur plaque » pourrait atteindre presque la même efficacité de transformation que la méthode de transformation classique avec du calcium, mais l'ensemble du protocole ne prend que environ 2 minutes (Chen et al 2001). Sur la base de cette méthode, nous avons établi un système efficace utilisant E. coli cellules compétentes pour les plasmides de transformation. Les plasmides peuvent ensuite être stockés sous forme de stocks bactériens dans notre laboratoire commun Chine-Royaume-Uni, ce qui permet l'amplification de plasmides pour de futures expériences.

Les E. coli DH5α et E. coli TG1 étaient de l'Université de Wuhan (Chine) E. coli XL1 blue provenait de l'Université du Hubei (Chine) et de Rothamsted Research (Royaume-Uni).

Les plasmides suivants utilisés dans notre laboratoire ont été obtenus à partir de diverses sources et stockés dans notre laboratoire :

Plasmides de gènes marqueurs. pUC18, pDE4, pDE108, pDE 110, pCal-gus, pCal-neo, pAct1D-gus, pAHC 25, pRT99-gus, PRT99, pAHC20, pUGFP, pCX GFP.

Plasmides de gluténine HMW. p1Ax1, p1Dx5, p1Dy10, p1Dy12, pHMW-gus, pHMW-nos, pGAD2.

Milieu pour la croissance bactérienne

Moyen LB. 10 g/L de Bacto-Tryptone, 5 g/L d'extrait de Bacto-Levure, 5 g/L de NaCl, ajuster le pH à 7,5 avec un autoclave NaOH pour stériliser. Laisser le milieu autoclavé refroidir à 55ºC et ajouter de l'ampicilline (concentration finale 100 µg/ml). Pour les plaques LB, 1,5 % de Bacto-agar (15 g/L) a été ajouté avant l'autoclavage.

S.O.C. moyen. 2% de Tryptone (bacto), 0,5% d'extrait de levure, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4, 20 mM de glucose.

Tampon et solutions supplémentaires

TB (CaCl2) (Inoue et al. 1990). Tuyaux 10 mM, 55 mM MnCl2, 15 mM de CaCl2, 250 mM de KCl. (TUYAUX 3.021 g/l, CaCl2.2H2O 2,205 g/l, KCl 18,637 g/l, MnCl2.4H20 10,885 g/l). Tous les composants sauf MnCl2 ont été mélangés et le pH a été ajusté à 6,7 avec du KOH. Ensuite, MnCl2 a été dissoute, la solution a été stérilisée par filtration à travers une unité de filtration de 0,45 µm prérincée et stockée à 4°C, tous les sels ont été ajoutés sous forme de solides, toujours conservés et utilisés au froid.

DMSO acheté à ALPHA Biotechnologies Company, LTD (SigmaD5879).

CHEVILLE8000 sont achetés à Sino-American Company (Wuhan, Chine), PEG8000 (40 %) solution stockée à -20ºC.

Préparation de la cellule compétente

Il existe deux méthodes principales de transformation des cellules bactériennes compétentes, la méthode au chlorure de calcium et la méthode d'électroporation (Dargert et al. 1979 Okamoto et al. 1997 Topcu, 2000). Nous choisissons la méthode au chlorure de calcium.

Méthode au chlorure de calcium. Un stock de glycérol de 10 μl d'un E. coli ne contenant aucun plasmide a été laissée à décongeler à température ambiante et ajoutée à 40 ml de liquide S.O.C. médias. Cette culture a été incubée à 37ºC pendant 1 h, puis transférée dans un incubateur-agitateur, à 37ºC, en secouant à 200 tr/min pendant 2-3 h jusqu'à une DO600 de 0,2-0,4 a été atteint. La DO optimale600 pour les différentes souches bactériennes varié. La détermination de leur phase initiale de log est importante. Les cellules ont été sédimentées par centrifugation à 8000 tr/min pendant 1 min à 4°C, puis remises en suspension dans un demi-volume (20 ml) de TB froide stérile (CaCl2) solution, et incubé sur de la glace pendant 25 min. Après une autre étape de centrifugation comme ci-dessus, le culot cellulaire résultant a été remis en suspension dans un dixième de volume (4 ml) de TB froid stérile (CaCl2) solution pour donner la suspension cellulaire compétente finale. Les cellules compétentes peuvent être conservées à 4ºC jusqu'à 3 jours.

Préparation de cellules compétentes pour le stockage en tant que stocks de glycérol. Transférer 1,6 ml de la suspension cellulaire compétente dans des tubes de cryoconservation stériles et ajouter 0,4 ml de glycérol 100 % stérile pour obtenir une concentration finale de 20 % de glycérol, puis mélanger. Les stocks de glycérol sont placés à -4ºC, -20ºC et -70ºC séparément pour une utilisation ultérieure.

Transformation bactérienne

Transformation plasmidique et sélection d'antibiotiques. Le traitement au chlorure de calcium des cellules bactériennes produit des cellules compétentes qui absorberont l'ADN après une étape de choc thermique. molécules d'ADN, c'est à dire. les plasmides, qui sont introduits par cette méthode, seront ensuite répliqués dans les cellules hôtes bactériennes. Pour faciliter la récupération des cellules bactériennes, les cellules sont incubées brièvement avec un milieu de croissance non sélectif après le traitement de choc thermique. Cependant, en raison du faible pourcentage de cellules bactériennes qui ont été transformées avec le plasmide et de la possibilité que le plasmide ne se propage pas dans toutes les cellules filles, il est nécessaire de sélectionner des cellules bactériennes contenant le plasmide. Ceci est généralement effectué en utilisant la sélection d'antibiotiques.

E. coli souches telles que XL1 bleu, DH5α et TG1 sont sensibles aux antibiotiques courants tels que l'ampicilline. Les plasmides utilisés pour le clonage et la manipulation de l'ADN ont donc été conçus pour abriter des gènes de résistance aux antibiotiques, par exemple à l'ampicilline. Ainsi, si après la procédure de transformation, les bactéries sont étalées sur des milieux contenant de l'ampicilline, seules les bactéries qui possèdent l'ADN plasmidique auront la capacité de métaboliser l'ampicilline et de former des colonies. De cette manière, des cellules bactériennes contenant de l'ADN plasmidique peuvent être sélectionnées.

Protocole de transformation bactérienne de notre laboratoire

  1. Préchauffer les plaques de S.O.C. et S.O.C. ampicilline (concentration finale 100 µg/ml) à 37ºC pendant 1 h.
  2. Prendre 100 μl cellules compétentes et ajouter 1 μg/μl ADN plasmidique 0,5 μl.
  3. Ajouter DMSO ou PEG8000 (40%) 1 μl.
  4. Incuber sur glace pendant 30 min.
  5. Choc thermique à 42ºC pendant 90 s. (Pour une méthode de transformation encore plus rapide, cette étape peut être négligée ou omise).
  6. Incuber sur glace pendant 2 min.
  7. Ajouter 400 μl liquide S.O.C. moyen.
  8. Incuber à 37ºC pendant 45 min dans un incubateur-agitateur.
  9. Étaler la moitié du mélange (50 μl) sur une plaque préchauffée avec de l'ampicilline et l'autre moitié sur une plaque témoin sans ampicilline.
  10. Incuber les plaques à 37ºC pendant la nuit pour S.O.C. moyen (12-16 heures).

L'utilisation de cellules au début de la phase logarithmique de croissance est un facteur important pour la préparation de cellules compétentes. En étudiant les courbes de croissance, la DO optimale600 la portée peut être déterminée. Les courbes de croissance de trois E. coli sont illustrées à la figure 1. Notre expérience montre que la densité optique optimale (DO600) pour la préparation des cellules compétentes variait pour chacune des souches étudiées (Figure 2), et pour XL1 blue, il était de 0,15-0,45 pour TG1, il était de 0,2-0,5 et pour DH5α, il était de 0,145-0,45. Un autre facteur important est la concentration de CaCl2. Bien que 50-100 mM de chlorure de calcium puissent être utilisés, mais 75 mM de CaCl2 dans la solution TB s'est avérée être la concentration optimale.

Calcul de l'efficacité de transformation (unités formant colonie [cfu])

L'efficacité de transformation est définie comme le nombre de cfu produits par 1 µg d'ADN plasmidique et est mesurée en effectuant une réaction de transformation témoin en utilisant une quantité connue d'ADN, puis en calculant le nombre de cfu formés par microgramme d'ADN.

Équation pour l'efficacité de la transformation (cfu/µg)

Transformant cfu = nombre de colonies de bactéries & fois le rapport de dilution & fois le volume de transformation d'origine/volume plaqué

Exemple : Si 21 colonies sont observées sur la plaque, avant l'étalement, les cellules compétentes transformées ont été diluées 10 000 fois et le volume de transformation d'origine était de 100 microl, 50 microl ont été utilisés pour la plaque, alors le cfu du transformant est :

21 &fois 10000 &fois 100/50 = 4,2 &fois 10 5

Efficacité de transformation = cfu transformant/ADN plasmidique (µg).

Si l'ADN plasmidique a été ajouté 0,5 µl (1µg/µl), l'efficacité de transformation = 4,2 × 10 5 /0,5 = 8,4 × 10 5 cfu/µg.

L'efficacité de transformation par microgramme d'ADN plasmidique en différentes souches bactériennes est indiquée dans le tableau 1. Ce sont les données moyennes de 6 répétitions, qui montrent que la souche la plus efficace est XL1 blue. Notre méthode améliorée peut augmenter l'efficacité de la transformation environ 1000 fois plus que la méthode normale (Sambrook et al. 1989), mais la méthode rapide (Chen et al. 2001) diminue l'efficacité de la transformation environ 60-150 fois moins que la méthode normale (Sambrook et al. 1989). ).

L'efficacité de transformation de différents plasmides en utilisant différentes méthodes pour différentes souches bactériennes est illustrée à la figure 3. Nous avons utilisé pUC18 pour configurer notre système et utilisé pUGFP, pAHC25, p1Ax1, p1Dx5, p1Dy10 pour tester notre système, puis calculé la transformation moyenne efficacité, et obtenu la figure 3. Ensuite, nous utilisons cette méthode améliorée pour amplifier d'autres plasmides tels que pDE 110, pRT99, pAHC20, pABPIgus, pRT101, pRTL2, pCX GFP, p1Dy12, pJD2, pHMW-gus, pHMW-nos, pGAD2, pGAD12 et ainsi de suite, ce qui montre que notre méthode améliorée peut augmenter l'efficacité de la transformation beaucoup plus que la méthode normale (Sambrook et al. 1989), mais la méthode rapide (Chen et al. 2001) diminue évidemment l'efficacité de la transformation par rapport à la méthode normale (Sambrook et al. . 1989).

Effet du temps de stockage des cellules compétentes à différentes températures sur l'efficacité de la transformation

L'effet du temps de stockage des cellules compétentes à différentes températures sur les efficacités de transformation a été étudié. Nous utilisons le plasmide pAHC25 pour transformer les cellules compétentes XL1 blue, qui ont été stockées à -4ºC, -20ºC et -70ºC séparément pendant 1 h, 1 nuit, 1 jour, 2 jours, 3 jours, 5 jours, 7 jours, 10 jours , 15 jours et 20 jours. La méthode de transformation normale a été utilisée. Le résultat final est illustré à la figure 4. L'effet du temps de stockage des cellules compétentes à -20ºC sur l'efficacité de la transformation montre que les cellules compétentes XL1 blue peuvent être stockées à -20ºC et utilisées en 1 h à 7 jours sans diminution évidente de l'efficacité de transformation, sur le au contraire, l'efficacité de transformation a augmenté de 3 jours à 7 jours, puis a diminué progressivement. La figure 4 montre l'effet du temps de stockage des cellules compétentes à différentes températures sur l'efficacité de la transformation, ce qui montre que les cellules compétentes peuvent être stockées à -20 °C pendant 7 jours et à -70 °C pendant 15 jours sans perdre leur compétence apparemment.

L'efficacité de la transformation est très importante dans les expériences de clonage moléculaire et peut être affectée par de nombreux facteurs. Takahashi ont rapporté une méthode simple de transformation plasmidique de E. coli par congélation rapide (Takahashi et al. 1992). Le plus important étant que les cellules bactériennes doivent avoir leur période de croissance logarithmique précoce, Ryu et d'autres auteurs ont souligné l'importance de la phase logarithmique précoce pour la transformation (Ryu et Hartin, 1990). Les bactéries capables d'absorber l'ADN sont appelées « compétentes » et la compétence peut être induite par un traitement au chlorure de calcium au début de la phase logarithmique de croissance. La membrane cellulaire bactérienne est perméable aux ions chlorure, mais non perméable aux ions calcium. Lorsque les ions chlorure pénètrent dans la cellule, les molécules d'eau accompagnent la particule chargée. Cet afflux d'eau fait gonfler les cellules et est nécessaire à l'absorption d'ADN, le mécanisme exact de cette absorption est inconnu. Nos expériences ont montré que différentes souches de E. coli ont des caractéristiques de croissance différentes, telles que E. coli : XL1 bleu, TG1 et DH5α, donc, le OD optimal600 la plage à utiliser pour la préparation des cellules compétentes varie : pour XL1 blue, c'est 0,15-0,45 pour TG1 0,2-0,5 et pour DH5α 0,145-0,45. Cellules compétentes préparées à partir de cultures bactériennes en surcroissance ou en sous-croissance en dehors de ces DO optimales600 gamme aura une capacité de transformation réduite ou inexistante. Dans notre laboratoire, le bleu XL1 s'est avéré avoir l'efficacité de transformation la plus élevée, il est donc plus couramment utilisé. Les bactéries pour la préparation des cellules compétentes seraient systématiquement cultivées à OD600 = 0.2-0.4.

Un deuxième facteur, qui peut avoir un impact sur l'efficacité de la transformation, est que les cellules compétentes doivent être maintenues en environnement froid, à la fois pendant le stockage et l'utilisation. Dargert (Dargert et Ehrlich, 1979) a signalé que les cellules compétentes pouvaient être conservées à 4°C dans du chlorure de calcium pendant 24 à 48 heures. Dans les premières 12-24 heures, l'efficacité de transformation augmente de 3 à 5 fois, puis se réduit à un niveau moyen. Nos expériences montrent que les cellules compétentes peuvent être stockées à -70°C pendant 15 jours sans évidemment réduire leur capacité de transformation. Cependant, si les cellules compétentes sont stockées à -20 °C, les efficacités de transformation les plus élevées apparaissent à 2-7 jours. Mais si le temps de stockage était supérieur à 7 jours, l'efficacité de la transformation était considérablement réduite. Si des cellules compétentes étaient stockées au 4ºC, elles perdraient leur compétence en seulement 3 jours. La cellule compétente ne peut pas être stockée à long terme sous N liquide2 et ne peut pas être décongelé plus d'une fois.

Un autre facteur important est la concentration de CaCl2. Bien que 50-100 mM de chlorure de calcium puissent être utilisés, mais 75 mM de CaCl2 dans la solution TB s'est avérée être la concentration optimale. Brian et Heler (Brian et Heler, 1996) ont d'abord utilisé le TFB comme substitut du CaCl traditionnel2 Solution. Nous avons utilisé la solution TB, qui a multiplié par plus de 100 l'efficacité de la transformation. Utilisation du CaCl traditionnel2 méthode à 37ºC, le no. de transformants/μg d'ADN plasmidique était de 1 &fois 10 5

10 & fois 10 5 . L'utilisation de la tuberculose dans les mêmes conditions a entraîné le non. transformants/μg ADN plasmidique de 1 &fois 10 7

L'ajout de DMSO ou de PEG8000 pendant la transformation bactérienne peut également affecter l'efficacité de la transformation. Hanahan (Hanahan et al. 1991) a découvert que l'ajout de DMSO augmentait considérablement l'efficacité de la transformation. De même, l'incubation de cellules compétentes et d'ADN plasmidique dans une solution de polyéthylène glycol/chlorure de calcium (PEG/CaCl2) suivi d'une brève incubation et d'un choc thermique a entraîné une absorption efficace de l'ADN (Kurien et Scofield, 1995). Nos expériences montrent que l'ajout de DMSO ou de PEG8000 pendant le processus de transformation peut donner une efficacité de transformation de 100 à 300 fois supérieure à celle de la méthode Cohen&rsquos.

Le milieu de culture bactérien peut également affecter l'efficacité de la transformation. Jessee (Fierro, 2004 Maeda et al. 2004) a suggéré S.O.C. milieu de croissance de bactéries pour la préparation de cellules compétentes. S.O.C. est un milieu plus riche que le milieu LB, ce qui entraîne donc une croissance plus rapide des bactéries, non seulement les transformants peuvent être observés plus tôt dans S.O.C. milieu après 12 h au lieu de 24 h en milieu LB, mais l'efficacité de transformation est beaucoup plus élevée S.O.C. donnant une efficacité 10 à 30 fois supérieure à celle de LB.

Il est connu que l'effet du traitement au chlorure de calcium peut être amélioré s'il est suivi d'une étape de chauffage, bien qu'il y ait un débat quant à savoir si l'étape de choc thermique est critique pour l'absorption de l'ADN (Chen et al. 2001 Kimoto et Taketo, 2003) . Lorsque E. coli est soumis à une température de 42°C, un ensemble de gènes appelés gènes de choc thermique sont exprimés, qui permettent aux bactéries de survivre à de telles températures. Cependant, à des températures supérieures à 42°C, la capacité des bactéries à absorber l'ADN est réduite et à des températures plus extrêmes, les bactéries mourront. Bien qu'il ne soit pas indispensable, un choc thermique peut augmenter l'efficacité de la transformation. Van der Rest (Van der Rest et al. 1999) a décrit l'utilisation d'un choc thermique après électroporation pour induire une transformation très efficace de Corynebacterium glutamicum avec de l'ADN plasmidique xénogénique. Bien que Chen (Chen et al. 2001) ait proposé une méthode pratique et rapide pour la transformation génétique de Escherichia coli avec les plasmides, l'étape de choc thermique a été omise et l'efficacité de transformation résultante est environ 100 fois inférieure.

Les auteurs tiennent à remercier le professeur Peter Shewry de Rothamsted Research (Royaume-Uni), pour ses discussions utiles et le professeur Caroline Sparks de Rothamsted Research (Royaume-Uni), pour sa lecture critique et sa correction du manuscrit. Nous remercions nos familles, nos collègues et nos étudiants pour leur soutien dans ce travail.

BRIAN, P. et HELER, M.K. Haute efficacité 5 min de transformation de E. coli. Recherche sur les acides nucléiques, 1996, vol. 24, non. 3, p. 536-537. [ Liens ]

COHEN, S.N. CHANG, AC BOYER, H.W. et HELLING, R.B. Construction d'un plasmide bactérien biologiquement fonctionnel in vitro. Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, 1973, vol. 70, non. 11, p. 3240-3244. [ Liens ]

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Quelle fonction du chlorure de magnésium dans la fabrication de cellules compétentes ?

Étant donné qu'E. coli n'est pas naturellement transformable, la capacité de capter l'ADN ou la compétence doit être induite par des méthodes chimiques utilisant des cations divalents et multivalents (calcium, magnésium, manganèse, rubidium ou hexamine cobalt) . L'altération de la perméabilité des membranes permet à l'ADN de traverser l'enveloppe cellulaire d'E. coli qui est composée d'une membrane externe, d'une membrane interne et d'une paroi cellulaire. La membrane externe d'E. coli peut être comprise par l'application du modèle de mosaïque fluide pour les membranes et est composée de phospholipides, de protéines et de lipopolysaccharides. De nombreux canaux ou zones d'adhérences sont formés par la fusion de la membrane externe et de la membrane interne à travers la couche de paroi cellulaire. Bien que le mécanisme de transformation ne soit pas connu, des études antérieures indiquent que ces canaux permettent le transport de molécules d'ADN à travers la membrane cellulaire. Les charges négatives de l'ADN entrant, cependant, sont repoussées par les parties chargées négativement des macromolécules sur la surface externe de la bactérie. L'ajout de CaCl2 sert à neutraliser les interactions défavorables entre l'ADN et les polyanions de la couche externe. L'ADN et les cellules compétentes sont ensuite incubés sur de la glace pendant trente minutes pour stabiliser la membrane lipidique et permettre des interactions accrues entre les ions calcium et les composants négatifs de la cellule. Le mélange réactionnel est ensuite exposé à une brève période de choc thermique à 42oC. Le changement de température altère la fluidité de l'état de membrane semi-cristalline atteint à 0oC permettant ainsi à la molécule d'ADN d'entrer dans la cellule à travers la zone d'adhésion.

Des études antérieures ont montré que certaines souches d'E. coli sont plus sensibles à la transformation que d'autres en raison de différences dans la composition du lipopolysaccharide. E. coli avec un long polysaccharide lié à l'O bloque ou empêche l'ADN d'entrer dans la cellule. L'ajout de magnésium au milieu augmente le rendement de transformation en améliorant l'interaction ionique des molécules à la surface et modifie donc la souplesse de la membrane pour une transformation plus efficace.


Rôle du chlorure de calcium lors de la préparation des cellules compétentes - Biologie

Préparation des cellules compétentes

Plusieurs méthodes super efficaces pour préparer E. coli des cellules compétentes pour la transformation ont été décrites (par exemple. méthode de Hanahan et méthode d'Inoue). Ils donnent généralement de bons résultats dans la transformation de routine. Cependant, lorsque les protocoles sont appliqués à divers E. coli souches utilisées pour les études génétiques, un certain nombre de souches ont tendance à donner peu de transformants, probablement parce que ces protocoles sont optimisés pour des E. coli souches aptes à la transformation, e. g. DH1, DH5, JM109 et leurs dérivés. La méthode au chlorure de calcium décrite ci-dessous donne généralement de bons résultats (par exemple 10 6 transformants/microgramme de pBR322) pour tout E. coli souches, bien que l'efficacité de transformation soit relativement inférieure aux méthodes super-efficaces appliquées aux souches optimales.

1. Agiter E. coli à 37 °C pendant une nuit dans 3 ml de LB.

2. Ajouter 0,5 ml de la culture d'une nuit dans 50 ml de LB dans un flacon de 200 ml. Le bouillon doit être préchauffé à 37 °C. Agiter la culture à 37 °C.

3. Surveiller la DO 600 . Lorsque la DO 600 de 0,35 à 0,4 est atteinte, refroidir la culture sur de la glace. Lorsque l'efficacité de transformation la plus élevée n'est pas requise, je récolte simplement les cellules 100 à 120 minutes après l'inoculation sans surveiller la DO600.

4. Transférer la culture dans un tube à centrifuger stérile et recueillir les cellules par centrifugation à 6 000 tr/min pendant 8 minutes à 4 °C. Jeter le surnageant.

5. Remettre en suspension les cellules dans 20 ml de CaCl 2 glacé 50 mM. Incuber les cellules remises en suspension sur de la glace pendant 20 minutes. Recueillir les cellules par centrifugation comme à l'étape 4.

6. Remettre en suspension les cellules dans 2,5 ml de CaCl 2 50 mM glacé, ou, si vous stockez les cellules compétentes pendant une longue période sous forme de stock congelé, remettre les cellules en suspension dans 2,5 ml de CaCl 2 glacé 50 mM contenant 10 % de glycérol .

7. Utiliser 100-200 microlitres de cellules compétentes pour la transformation, ou distribuer les cellules compétentes en aliquotes de 100-200 microlitres et congeler dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure.

Cette méthode peut être facilement agrandie et réduite. Quand je veux transformer un E. coli souche rapidement, j'ensemence 0,05 ml d'une culture d'une nuit dans 3 ml de LB, et, après agitation 100-120 min à 37 C, les cellules sont lavées avec une solution de calcium glacée. Les cellules remises en suspension dans 100-150 microlitres de la solution de calcium sont utilisées pour la transformation.

1. Décongeler les cellules compétentes sur de la glace si elles sont conservées congelées. Ajouter à 100 microlitres de cellules compétentes quantité appropriée de solutions de plasmide dans TE. La solution de plasmide doit être inférieure à 5 microlitres.

2. Keep the cells on ice for 30 minutes.

3. Quickly transfer the tube to 42 C water bath. Incubate for 1 minute, then transfer onto ice.

4. Add 1 ml of LB. Incubate at 37 C for 30 minutes. Spread the cells on agar plate(s) containing appropriate antibiotics.


OPINION article

Azka Asif 1 , Hareem Mohsin 1 , Rabia Tanvir 2 and Yasir Rehman 1 *
  • 1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of the Punjab, Lahore, Pakistan
  • 2 University Diagnostic Lab, Department of Microbiology, University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore, Pakistan

Bacterial transformation is a crucial part of cloning process and has been widely used in many studies (Swords, 2003 Gigova et al., 2006). The mechanism is marked by two phases, the first phase involves the uptake of the DNA across the cellular envelope and the second phase involves the setting up of the DNA in the cell as a stable genetic material (Hanahan, 1983). The procedure of transformation is of physicochemical nature rather than strictly being a chemical or a physical procedure, since the cells are manipulated with cations (or a combination of cations) and temperature imbalances to render them competent to uptake foreign DNA. It is a common understanding that the chemical manipulation is linked to the induction of competency while the physical manipulation is linked to the uptake of foreign DNA. The two methods act together to bring about the act of 𠇊rtificial DNA internalization.”

Over time various methods have been used to make cells competent such as by using dimethyl sulfoxide (DMSO), divalent cations, or polyehtylene glycol (PEG) (Klebe et al., 1983 Chan et al., 2013). Other than these chemical methods, electroporation has also been tested and used to induce competency (Dower et al., 1988 Yoshida and Sato, 2009 Liu et al., 2013). The use of divalent cations has been the most effective chemical treatment to bring about transformation (Day, 2004). Among various cations, divalent calcium cation (Ca 2+ ) has proven to be the most effective one (Weston et al., 1981) both alone (Dagert and Ehrlich, 1979) and in various combinations. A combination of divalent and monovalent ions, such as calcium and magnesium (Taketo, 1974 Wensink et al., 1974), calcium and manganese (Enea et al., 1975), calcium, rubidium, and dimethyl sulfoxide (Kushner, 1978) and other alkali metals with a prolonged incubation at 0ଌ (Taketo, 1972 Dagert and Ehrlich, 1979) has also been reported to be effective (Roychoudhury et al., 2009). Generally, all divalent cations enhance the transformation process. Hanahan (1983) found that the presence of magnesium in bacterial culture media increases the transformation efficiency by 15- to 20-folds as compared to the cells grown in the absence of magnesium. He also observed that the addition of magnesium in the media 30 min before the time of collection of cells also enhances the transformation up to 繠%. However, addition of magnesium as the cells are harvested and incubated on ice enhances transformation up to 繀%. The addition of calcium or manganese ions has also shown almost the same stimulatory effect as that of the magnesium ions (Hanahan, 1983). However, incubation time with calcium chloride or any other divalent cation for that matter, should be optimized. It was observed that a period of 24 h incubation in cold calcium chloride makes the bacterial cells 20� times more competent and 4𠄶 times more efficient for transformation as compared to the cells that are obtained immediately after CaCl2 treatment (Blattner et al., 1977 Dagert and Ehrlich, 1979). Curtiss et al. (1977) experimented on E. coli strain X1776 and observed the effect of various set of conditions on the efficiency of transformation. He treated the bacterial culture with a combination of manganese, calcium, rubidium, and potassium ions along with DMSO and sucrose at 0ଌ followed by a heat pulse at 42ଌ. However, these conditions did not give successful results when other strains of E. coli were used (Hanahan, 1983). Meselson and Yuan (1968) found these conditions promising for successful transformation in case of a strain of E. coli MM294 than the standard �lcium chloride” protocol. Bolivar et al. (1977) reported 10 6 transformants when the cells were treated with calcium alone while Kushner (1978) reported to obtain 10 7 transformants after treating the cells with rubidium along with calcium chloride. Norgard et al. (1978) was also able to obtain 10 7 transformants with the method followed by Kushner (1978) in case of K-12 strain X1776 of E. coli. However, transformants yield varied from specie to specie and strain to strain (Mercer and Loutit, 1979). It was reported by Sjöström et al. (1972) that the optimum concentration of calcium chloride for the uptake of DNA by S. aureus is 0.1 M CaCl2. The repulsion between foreign DNA and the bacterial cell, owing to negative charges on them both, are overcome by these divalent cations. This is applicable for linear DNA fragments as well as circular DNA molecules such as plasmids (Mandel and Higa, 1970 Tsen et al., 2002). It is thought that the divalent cations bind both to the cell and the DNA, thus neutralizing the charge altogether. The calcium bound to the DNA further helps the DNA to adsorb to the competent cell (Panja et al., 2008b). Moreover, DNA binding proteins present in the cell membrane could also aid in this interaction. The anchorage of the DNA to the membrane eliminates the risk of detachment or expulsion of DNA (Clark et al., 2002). Further, the low temperatures used in transformation protocols congeals the lipid moiety and consequently restricts the fluidity of the cell membrane which strengthens calcium-cell surface interaction. In this way calcium ions, bound with cell surface as well as the foreign DNA, brings the DNA to the cell. Clark et al. (2002) showed that the relative association of divalent cations (e.g., Ca 2+ ) is more with the cell membrane as compared to its association with foreign DNA, whereas certain trivalent cations (e.g., spermidine) interact more readily with the DNA (Li et al., 2004). It was also reported in this study that Ca 2+ has more pronounced role to play in development of competency as compared to spermidine or trivalent cations (Clark et al., 2002). Membranes absorb calcium very readily and once inside the cell the calcium ions are neutralized by membrane phosphates present on the cytosolic side (Melcrová et al., 2016). The binding of calcium ions to the membrane also cause changes in the membrane permeability (Li et al., 2004).

Treatment with divalents or trivalents on ice is followed by treatment with elevated temperature as a heat-shock, which produces a temperature imbalance. Molecules with increased Brownian motion outside the cell are likely to push the DNA molecule inside the cell. However, it is unclear if this kinetic force is sufficient enough to push the adsorbed DNA molecules inside. Panja et al. (2008a) studied the efficacy of cooling and heating cycles by increasing the number of cycles until maximum transformation efficiency was achieved. It was inferred that lowering of temperature actually contributes to protein loss, while heating contributes to lipid loss, and thus together these cycles increase transformation efficiency (Panja et al., 2008a) as it enlarges the pore size on the cell surface. Moreover, due to loss of lipids and proteins, the membrane is depolarized, further reducing the repulsion between the DNA molecule and the membrane. Moreover, cell density can also affect the efficiency of transformation and it has been reported that maximum competency is observed at cell density ranging from 10 7 to 10 8 cells ml in the log phase (Taketo, 1974 Norgard et al., 1978).

However, the question remains whether the pores (through which foreign DNA enters a cell) are formed by the calcium treatment or are they naturally present. There exist natural channels, often called Bayer's bridges, in the membrane that can serve as potential pathway for DNA uptake (Dreiseikelmann, 1994 Sperandeo et al., 2007 Srivastava, 2013). Hanahan (1983) stated that the competent cells have many sites or channels and all these sites and channels have an independent chance of taking part in the uptake of DNA moving toward the process of transformation. All the cells, whether competent or not, compete for the uptake of plasmid but if only competent cells are used for the transformation, the efficiency will be increased up to 50-folds as discussed by Hanahan (1983). The DNA uptake factor is the sum of all the probabilities of DNA uptake through each channel. It was reported that the chances of transformation are not increased by increasing the concentration of DNA but by the increase in the number of channels through which the uptake of DNA takes place (Hanahan, 1983 Nikaido and Vaara, 1985). Moreover, calcium has a dual role in this process it not only neutralizes the charge but also weakens the cell membrane to produce invaginations (Stein, 1990 Thomas and Rice, 2014).

While it was known that the divalent cations help neutralize the charge, the complex ions can also serve to produce static force of attraction within the DNA molecule. This leads to the folding of DNA into a compact ball-like structure that facilitates its entry into the cell (Clark et al., 2002). A supercoiled ball like structure of the plasmid will have more chances of entering the competent cell for transformation than the extended open circular form of the plasmid. However, if the size of the DNA approaches the size of the pore, the probability of the transformation decreases sharply. When using spermidine or other trivalents, the size of the ball-like structure of DNA might exceed the size of pores in the cell membrane, which can be only solved by altering the physical parameters used in the protocol, primarily the heating and cooling cycles. Whether using divalents or trivalents, their concentrations need to be optimized such that all the phosphates of the DNA are not rendered inaccessible, because some parts of the DNA have to adsorb onto the cell surface and for that free phosphates are required, as inferred by Panja et al. (2008b).

The transformation efficiency is greatly affected by the type of the host cell, as they have different cell surface structures, especially in relation to O-polysaccharides that protrude from the surface of the cell. These surface structures interact with the divalent cations and the DNA, thus making the cell competent for transformation. Different strains of E. coli, as discussed above, have been reported to show variance in transformation efficiency, owing to the differences in chemical properties of their cellular envelope (Taketo, 1972). A very dense O-polysaccharide will become a deterrent for the DNA to pass through. However, it has also been claimed that extensive removal of LPS by excessive ethanol-pretreatment reduces transformation efficiency (Roychoudhury et al., 2009). This can be explained by the aforementioned hypothesis that the DNA first attaches to some external component of the cell membrane, which then assists its movement inside the cell. Along with the density, the composition of the O-polysaccahride also plays a role in the reception of the incoming DNA molecule (Lacks, 1977). Moreover, calcium ions also interacts with the membrane and at 100 mM CaCl2 concentration, almost all calcium is absorbed by the cell membrane's phosphatidylcholine and phosphatidylserine (Melcrová et al., 2016). Therefore, the membrane properties play a major role in DNA adsorption.

The evidences clearly indicate that the physical and chemical treatments used during transformation, i.e., the temperature imbalances and CaCl2 treatment, help deal with the barriers to DNA uptake, such as charge repulsions and pore sizes (Figure 1). Magnesium and calcium combinations are seldom used in transformation protocols, the importance of which should be considered. A combination of divalent and trivalent cations with prolonged incubation times can be suggested to improve the transformation efficiency as in addition to the charge stabilization, trivalent cations can compact DNA, further aiding its internalization. Bacterial cells could also be grown in presence of CaCl2 and MgCl2 before inducing competency. Heating and cooling cycles used just once in transformation protocols could also be increased to three times for higher transformation efficiencies. These conditions need to be adjusted and optimized for different bacterial species and strains, owing to the differences in their surface properties. However, there is a need for concrete evidences based on experiments designed exclusively to elaborate this phenomenon.

Figure 1. shows the barriers /limitations in uptake of DNA by a bacterial cell, which are the repulsion caused by negative charges on the cell membrane and DNA and the porosity of the membrane. These are manipulated by chemical treatment, such as calcium ions which neutralize negative charges. Physical parameters can be applied to improve porosity and permeability.


Transformation of Escherichia coli Made Competent by Calcium Chloride Protocol

The protocol described here represents a standard protocol. However, other protocols can be used that will increase transformation efficiency.

LB broth (Lysogeny broth, also called Luria-Bertani broth)

Adjust pH to 7.5 with NaOH and autoclave for 20 minutes.

LB plates, add 15 g of agar to LB broth before autoclaving.

For LB plates with antibiotic, add the appropriate amount of the selective antibiotic to sterile LB-agar media that has been precooled to 48 o C (see molecular biology textbook (1, 14) for stock and working concentration of a specific antibiotic).

SOC (Super Optimal Catabolite repression) moyen

1. Add the following to 900 ml of distilled H2O

  • 20 g of Bacto tryptone
  • 5 g of Bacto yeast extract
  • 2 ml of 5M NaCl
  • 2.5 ml of 1M KCl
  • 10 ml of 1M MgCl2
  • 10 ml of 1M MgSO4
  • 20 ml of 1M glucose

2. Adjust to 1 liter with distilled H2O.

3. Sterilize by autoclaving.

Chemicals and biological supplies required:

LB plates containing selective antibiotic

Filter-sterilized antibiotic solution (see molecular biology textbook (1, 14) for stock and working concentration of a specific antibiotic)

E. coli K12 derivatives (TB1, JM109) or other commercially available strains (Carolina Biological, New England Biolab, Fisher Scientific, etc.)

Plasmid vector or other DNA (pUC 19, pBR322, pBLU, other cloning vectors) (Carolina Biological Supply Company, Bio-Rad Laboratories, New
England Biolabs)

1x Tris-EDTA (TE) buffer pH 8.0 (10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA pH 8.0)

Sterile 60 mM cold CaCl2 solution (60 mM CaCl2, 15% glycerol, 10 mM piperazine-N,N’-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid) (PIPES), pH 7)

Styrofoam bucket with crushed ice

Equipment required:

  • 37°C incubator
  • Water bath shaker set at 37°C
  • 42°C water bath (using a thermometer ensure the temperature is exactly 42°C for the 2 minutes of heat shock)
  • Centrifuge
  • Roller drum in a 37°C incubator

1. Inoculate 5 ml of LB media with E. coli and grow overnight at 37 o C in a roller drum.

2. Inoculate 1 ml of overnight culture into a sterile Erlenmeyer flask containing 100 ml of LB broth.

3. Shake culture in a 37 o C water bath until cell density reaches mid-log growth phase (about 5 x 10 7 cells/ml). This should take 2 to 4 hours. The growth rate of the culture is determined by removing a 1-ml aliquot at various times and reading the optical density at 550 nm wavelength using a spectrophotometer. The relationship between optical density and cell number will vary depending on the bacterial strain. For a strain such as MM294 (rec + ), 1 OD550 = 0.2 (5 x 10 7 cells/ml) for a strain such as HB101 (rec-), 1 OD550 = 0.5 (5 x 10 7 cells/ml).

4 .Chill the culture on ice for 10 minutes.

5. Spin the cell suspension at 4,000 g in a centrifuge for 5 minutes at 4 o C.

6. Discard the supernatant.

7. Resuspend the cells in half the volume (50 ml) of the original culture with ice-cold sterile 60 mM CaCl2.

8. Place the cell suspension in an ice bath for 30 minutes.

9. Centrifuge the suspension at 4,000 g for 5 minutes at 4 o C.

10. Discard the supernatant.

11. Gently resuspend the cells in 5 ml of sterile ice-cold CaCl2 using precooled pipettes. Cells will remain competent for up to 24 hours at 4 o C. Transformation efficiency increases four- to six-fold during this time. For long-term storage, dispense 250-ml aliquots into prechilled, sterile microfuge tubes and store at -70 o C until needed. Depending on the strain used, some E. colicells will remain competent to take up DNA for as long as 6 months. A competency test (see below) should be performed each time an aliquot is removed from storage and used for transformation. The most recent number of transformants is then compared to the number obtained during the initial preparation.

12. Add 10 to 40 ng (10 to 25 ml volume) of DNA to 250 ml of competent cells in step 11. Concentrated stock DNA can be diluted using sterile 1x TE buffer. A higher volume or concentration of DNA will cause a decrease in transformation efficiency.

Besides the DNA tube, additional tubes should be set up as listed below:

(A) A control tube in which DNA is not added to the 250 ml of competent cells. The DNA volume should be substituted by an equal volume of sterile 1x TE buffer. The control tube will be treated the same as the DNA tube for the remainder of the experiment.

(B) If competent cells have been stored at -70 o C, a test should be performed to ensure that the cells still remain competent to take up DNA. The thawed cells are incubated with 10 ng of a control plasmid such as pBR322. The number of transformants per microgram of DNA will be calculated and should typically yield from 10 6 to 10 8 colonies/mg DNA for E. coli MC1061 and DH1 cells.

14. Transfer the reaction to a 42 o C water bath for exactly 2 minutes.

15. Incubate on ice for 5 minutes.

16. Add 1.0 ml of SOC medium to each tube and incubate at 37 o C for 1 hour in a roller drum (250 rpm) to allow cells to recover and express the antibiotic resistance marker.

17. Spread the appropriate quantity of cells (50 to 100 ml) on selective media. Store the remaining cells at 4 o C.

19. Count the number of colonies.

20. Calculate transformation efficiency and frequency. Transformed E. coli typically yields about 10 6 to 10 8 colonies/mg of DNA.

CFU/ml (colony forming unit per ml) = Number of colonies
Volume x Dilution factor


Calcium Chloride Made E. coli Competent for Uptake of Extraneous DNA Through Overproduction of OmpC Protein

In the standard method of transformation of Escherichia coli with extraneous DNA, cells are made competent for DNA uptake by incubating in ice-cold 100 mM CaCl2. Analysis of the whole protein profile of CaCl2-treated E. coli cells by the techniques of one- and two-dimensional gel electrophoresis, MALDI-MS and immunoprecipitation revealed overproduction of outer membrane proteins OmpC, OmpA and heat-shock protein GroEL. In parity, transformation efficiency of E. coli ompC mutant by plasmid pUC19 DNA was found to be about 40 % lower than that of the type sauvage souche. De plus, dans E. coli cells containing groEL-bearing plasmid, induction of GroEL caused simultaneous overproduction of OmpC. On the other hand, less OmpC was synthesized in E. coli groEL mutant compared to its type sauvage counterpart, by CaCl2-shock. From these results it can be suggested that in the process of CaCl2-mediated generation of competence, the heat-shock chaperone GroEL has specific role in DNA entry into the cell, possibly through the overproduced OmpC and OmpA porins.

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How do you make a bacterial cell competent?

Competent cells sommes bacterial cells that can accept extra-chromosomal DNA or plasmids (naked DNA) from the environment. The generation of competent cells may occur by two methods: natural compétence and artificial compétence.

Secondly, how do competent cells work? Competent Cells. Tel les cellules sont mentionné à be "competent." Cells are fabriqué competent by a process that uses calcium chloride and heat shock. Cellules cette sommes undergoing very rapid growth sommes fabriqué competent more easily than cells in other stages of growth. The growth rate of a bacterial culture is not constant.

Likewise, how do cells become competent in nature?

Naturally competent bacteria actively pull DNA fragments from their environment into their cells. These fragments provide nucleotides, but high similarity with the chromosome also allows them to change the cell's genotype by homologous recombination, a process called Naturel transformation (Fig.

How does calcium chloride make bacteria competent?

Calcium chloride transformation. It increases the ability of a prokaryotic cell to incorporate plasmid DNA allowing them to be genetically transformed. The addition of calcium chloride to a cell suspension promotes the binding of plasmid DNA to lipopolysaccharides (LPS).


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Voir la vidéo: Structure du plasmide (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Whelan

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